劉迎博，劉曉紅，茹美華，李建強

0 引言

肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）作為肺癌最主要的病理類型，占所有肺癌的80%～85%[1]，以密集淋巴細(xì)胞浸潤為特征，具有惡性程度高、起病隱匿、早期缺乏典型臨床癥狀等特點[2-4]，患者預(yù)后相對較差，早期易發(fā)生局部浸潤和轉(zhuǎn)移[5]。因此需要探索新的生物標(biāo)志物，可靠地評估腫瘤患者預(yù)后和生存情況，為肺腺癌個體化診療提供依據(jù)。

有絲分裂阻滯缺陷蛋白2（MAD2L1）位于人類4號染色體上，是有絲分裂檢查點復(fù)合蛋白的重要組成部分。目前研究表明，在哺乳動物細(xì)胞中MAD2L1功能的破壞可影響有絲分裂檢查點的功能，MAD2L1在有絲分裂檢查點的異常表達(dá)可導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定和非整倍體性[6]，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，有研究表明MAD2L1的遺傳變異可導(dǎo)致肺癌易感性[7]。

本研究擬探討MAD2L1在肺腺癌中的表達(dá)和作用以及MAD2L1調(diào)控肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機制，我們的研究可能對肺腺癌進(jìn)展的分子機制有更多的了解，并為肺腺癌的診斷和預(yù)后提供潛在的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取和預(yù)處理

從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取TCGA-LUAD的RNA隊列數(shù)據(jù)，對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理以去除丟失和重復(fù)的結(jié)果，并從GEO數(shù)據(jù)庫中經(jīng)過篩選后，選擇包含肺腺癌組織和正常肺組織樣本的GSE31210數(shù)據(jù)集作為驗證。其中GSE31210數(shù)據(jù)集包含226個肺腺癌樣本和20個正常肺組織樣本。

1.2 MAD2L1在肺腺癌中的表達(dá)分析

利用TCGA-肺腺癌數(shù)據(jù)來分析包括肺腺癌在內(nèi)的泛癌譜中MAD2L1基因在腫瘤和鄰近正常組織之間的差異表達(dá)。Wilcoxon檢驗比較差異表達(dá)情況，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

使用GEO數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗證MAD2L1在肺腺癌中的表達(dá)水平。t檢驗分析表達(dá)差異，R（4.03版本）軟件的ggplot2包對結(jié)果進(jìn)行可視化分析，P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，UALCAN數(shù)據(jù)庫[8]（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）分析MAD2L1的表達(dá)在肺腺癌不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等中的差異及意義。

1.3 MAD2L1的預(yù)后分析

根據(jù)MAD2L1 mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，Kaplan-Meier生存曲線評估了MAD2L1表達(dá)在肺腺癌患者中總生存期（OS）和無復(fù)發(fā)生存期（RFS）的預(yù)后價值。組間生存率比較采用Log rank檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 MAD2L1上游miRNA的預(yù)測和分析

為了確定MAD2L1是否受到一些非編碼RNA的調(diào)控，使用StarBase數(shù)據(jù)庫對調(diào)控MAD2L1的上游miRNA進(jìn)行預(yù)測，對肺腺癌中miRNA-MAD2L1進(jìn)行相關(guān)性分析，構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 免疫浸潤相關(guān)分析

TIMER數(shù)據(jù)庫[9]評估肺腺癌患者中MAD2L1表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤、免疫相關(guān)標(biāo)志物、免疫檢查點表達(dá)水平的相關(guān)性。采用Spearman檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 免疫組織化學(xué)

在HPA數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org）中，利用該網(wǎng)站的免疫組織化學(xué)圖像數(shù)據(jù)，從蛋白表達(dá)水平比較MAD2L1在正常肺組織和肺腺癌組織中的表達(dá)水平差異。

2 結(jié)果

2.1 MAD2L1表達(dá)分析

使用TIMER數(shù)據(jù)庫分析TCGA RNA-seq數(shù)據(jù)來評估人類不同腫瘤中的MAD2L1轉(zhuǎn)錄水平。與正常樣本相比，MAD2L1在多種癌癥類型中上調(diào)，其在肺腺癌組織中顯著上調(diào)（P<0.001），見圖1A。進(jìn)一步驗證MAD2L1在肺腺癌組織中的表達(dá)水平。在TCGA隊列中，MAD2L1在肺腺癌中的表達(dá)顯著增加（P<0.01），見圖1B。在GSE31210隊列中，MAD2L1在肺腺癌中的表達(dá)顯著增加（P<0.001），見圖1C，使用探針I(yè)D為：1554768_a_at。這些結(jié)果表明MAD2L1在多種腫瘤中異常表達(dá)，在肺腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織。

2.2 MAD2L1表達(dá)與肺腺癌臨床參數(shù)的關(guān)系

利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析正常肺組織和肺腺癌組織中MAD2L1的表達(dá)在肺腺癌不同臨床分期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的差異，結(jié)果顯示：與正常肺組織相比，MAD2L1在Stage 1組、Stage 2組、Stage 3組和Stage 4組的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<1E-12,P<1E-12,P=1.631E-12,P=3.187E-07），見圖2A。

與正常肺組織相比，MAD2L1在N0組、N1組和N2組的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.624E-12,P<1E-12,P=1.748E-12），而在N3組胃癌患者中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=9.635E-02），見圖2B。以上結(jié)果表明，肺腺癌組織中MAD2L1的高表達(dá)與肺腺癌組織不同臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.3 MAD2L1預(yù)后分析

與MAD2L1低表達(dá)組相比，MAD2L1高表達(dá)組肺腺癌患者（HR=1.79,P=8.3E-05）的總生存時間（OS）顯著縮短（P<0.05）；MAD2L1的高表達(dá)（HR=1.55,P=0.043）與肺腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存期（RFS）顯著相關(guān)（P<0.05），見圖2C。綜合OS曲線和RFS曲線結(jié)果來看，MAD2L1可能成為肺腺癌患者不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。

2.4 MAD2L1與上游miRNA的預(yù)測與分析

首先預(yù)測可能與MAD2L1結(jié)合的上游miRNA，最終發(fā)現(xiàn)了11個miRNA，Cytoscape軟件對miRNA-MAD2L1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，見圖3A。根據(jù)miRNA調(diào)控靶基因表達(dá)的作用機制，miRNA與MAD2L1之間應(yīng)該存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此，進(jìn)行了表達(dá)相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中MAD2L1與hsa-miR-139-5p、hsa-miR-101-3p呈顯著負(fù)相關(guān)，與hsa-miR-28-5p、hsa-miR-493-3p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-873-5p呈正相關(guān)，MAD2L1與其他5個預(yù)測的miRNA之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 通過StarBase數(shù)據(jù)庫分析LUAD中預(yù)測的miRNA和MAD2L1的表達(dá)相關(guān)性Table 1 Correlation between predicted miRNA and MAD2L1 expression in LUAD analyzed by StarBase database

最后通過表達(dá)及預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-101-3p在肺腺癌中表達(dá)下調(diào)，且其上調(diào)與患者預(yù)后呈正相關(guān)（P=0.0038），見圖3B、C。這表明hsa-miR-101-3p可能是MAD2L1在肺腺癌中最有潛力的調(diào)節(jié)miRNA。

2.5 MAD2L1表達(dá)水平與肺腺癌免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性

MAD2L1的表達(dá)與B細(xì)胞（cor=-0.209,P=3.52E-06）、CD4+T細(xì)胞（cor=-0.196,P=1.43E-05）的浸潤顯著負(fù)相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞（cor=-0.105,P=2.04E-02）、中性粒細(xì)胞（cor=0.134,P=3.28E-03）的浸潤顯著正相關(guān)，見圖4A。

2.6 MAD2L1與免疫細(xì)胞生物標(biāo)志物表達(dá)的相關(guān)性

MAD2L1與CD8+T細(xì)胞的生物標(biāo)志物（CD8A和CD8B）、M1型巨噬細(xì)胞的生物標(biāo)志物（NOS2、IRF5和PTGS2）、M2型巨噬細(xì)胞的生物標(biāo)志物（CD163、VSIG4和MS4A4A）顯著正相關(guān)，與B細(xì)胞的生物標(biāo)志物（CD19和CD79A）、CD4+T細(xì)胞的生物標(biāo)志物（CD4）、中性粒細(xì)胞的生物標(biāo)志物（ITGAM和CCR7）以及樹突狀細(xì)胞的生物標(biāo)志物（HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLADRA、HLA-DPA1、CD1C）顯著負(fù)相關(guān)，見表2。

表2 通過GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測肺腺癌組織中MAD2L1與免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性分析Table 2 Correlation between MAD2L1 and biomarkers of immune cells in LUAD determined by GEPIA database

2.7 MAD2L1與免疫檢查點的相關(guān)性

MAD2L1在肺腺癌的表達(dá)與PD1、PD-L1和CTLA-4呈顯著正相關(guān)，表明腫瘤免疫逃逸可能參與了肺腺癌MAD2L1介導(dǎo)的致癌作用，見圖4B～D。

2.8 MAD2L1蛋白表達(dá)水平

相較于正常肺組織，腫瘤組織的蛋白表達(dá)和抗體染色程度都是較高水平的，且陽性染色顆粒主要位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上，見圖5。

3 討論

細(xì)胞周期是哺乳動物生長發(fā)育必不可缺的關(guān)鍵步驟[10]，細(xì)胞周期檢查點異常被認(rèn)為是多種腫瘤的重要致病原因，細(xì)胞周期檢查點負(fù)責(zé)在細(xì)胞周期的關(guān)鍵節(jié)點上檢查基因組異常，啟動基因修復(fù)或凋亡信號[11]，如果檢查點被破壞，在不受控制的有絲分裂過程中染色體的丟失或錯誤分布將導(dǎo)致細(xì)胞非整倍體。非整倍體的發(fā)展可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，先前的研究在癌前病變和浸潤性肺癌中可以檢測到非整倍體，DNA含量異常的肺癌患者的生存期明顯縮短[12]。這些發(fā)現(xiàn)強烈提示肺癌的發(fā)生可能與細(xì)胞周期檢查點的功能障礙有關(guān)，細(xì)胞周期檢查點相關(guān)蛋白也被認(rèn)為是抗腫瘤治療的關(guān)鍵靶點[13]。

MAD2L1基因集中在細(xì)胞周期通路，且MAD2L1作為有絲分裂檢查點復(fù)合蛋白的一個組成部分，被認(rèn)為是染色體控制途徑的重要介體[14]，在調(diào)控有絲分裂過程中的染色體分離方面起著至關(guān)重要的作用。MAD2L1水平失調(diào)的細(xì)胞表現(xiàn)出嚴(yán)重的有絲分裂異常，腫瘤內(nèi)MAD2L1水平高與腫瘤患者預(yù)后不良和無復(fù)發(fā)生存率降低相關(guān)。MAD2L1在乳腺癌[15]、肺癌、肝癌[16]和胃癌[17]中都被發(fā)現(xiàn)過表達(dá)。

越來越多證據(jù)表明，MAD2L1在包括肺腺癌在內(nèi)的多種人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[18]。本研究通過對MAD2L1的表達(dá)分析、相關(guān)性分析和生存分析等，發(fā)現(xiàn)MAD2L1高表達(dá)的肺腺癌患者預(yù)后較差。Shi等[19]認(rèn)為MAD2L1是肺腺癌的不良預(yù)后生物標(biāo)志物，其表達(dá)增加可能使肺腺癌患者具有較高的癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險和較差的生存率，這和我們的分析結(jié)果一致表明了MAD2L1在肺腺癌中的致癌作用，并可能被用作肺腺癌治療的潛在靶標(biāo)。

此外，通過對MAD2L1的上游調(diào)控miRNA的預(yù)測，確定了miR-101-3p為有意義的MAD2L1的上游調(diào)控miRNA。此外通過相關(guān)表達(dá)分析和生存分析，發(fā)現(xiàn)miR-101-3p在肺腺癌組織中低表達(dá)，miR101-3p高表達(dá)的肺腺癌患者預(yù)后相對較好。這與Meng[20]、Liu等[21]的報道一致。因此，miR-101-3p通過靶向負(fù)調(diào)控MAD2L1的表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，在肺腺癌中發(fā)揮了抗腫瘤作用。

大量研究證實，腫瘤免疫細(xì)胞浸潤可影響腫瘤患者化療、放療或免疫治療的療效和預(yù)后[22-24]。本研究表明，MAD2L1與肺腺癌中的各種免疫細(xì)胞，與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞呈顯著正相關(guān)。此外，MAD2L1還與這些浸潤的免疫細(xì)胞生物標(biāo)志物顯著相關(guān)，提示腫瘤免疫浸潤可能是MAD2L1介導(dǎo)的肺腺癌致癌作用的部分原因。此外，免疫治療的效果不僅需要足夠的免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中浸潤，還依賴于免疫檢查點的充分表達(dá)[25]。因此，我們還評估了MAD2L1與免疫檢查點的關(guān)系。結(jié)果表明，肺腺癌組織中MAD2L1的高表達(dá)與PD1、PD-L1或CTLA-4密切相關(guān)，提示靶向MAD2L1可提高肺腺癌的免疫治療效果。

綜上所述，本研究闡明了MAD2L1在肺腺癌中的高表達(dá)，并與肺腺癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)，確定了MAD2L1在肺腺癌中的上游調(diào)控機制，即miR-101-3p/MAD2L1軸。MAD2L1可能通過增加腫瘤免疫細(xì)胞浸潤和免疫檢查點表達(dá)而發(fā)揮其致癌作用。然而，這些結(jié)果還需要在未來進(jìn)行更多的基礎(chǔ)實驗和更大規(guī)模的臨床試驗來驗證。