江銘婷，黃晶，鄭淑萍

0 引言

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS）是細胞受到鈣穩(wěn)態(tài)失衡、能量缺失、氧化還原環(huán)境改變、局部缺血、病毒感染等因素的影響，導致錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中堆積，細胞所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，是細胞的自我保護機制。細胞發(fā)生ERS時，未折疊蛋白信號（unfold protein response,UPR）通路被激活，減少蛋白質(zhì)翻譯，促進蛋白質(zhì)恢復正確構(gòu)象，使細胞恢復穩(wěn)態(tài)[1]；但過強或者是長時間的ERS，UPR信號通路則促發(fā)CHOP凋亡信號通路，誘導細胞死亡[2]。研究表明，腫瘤細胞較快的生長速度和血液供應(yīng)不足，使腫瘤細胞處于低氧、低pH、能量缺乏的微環(huán)境中，導致錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積累，最終引起ERS[3-4]。ERS介導的凋亡途徑與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過誘導ATF6、CHOP等基因表達可以促進腫瘤細胞凋亡[5-6]，ERS介導的細胞凋亡是腫瘤治療的潛在機制。

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占原發(fā)性肝癌的主要病理類型。世界衛(wèi)生組織估計，2030年將有超過100萬患者死于肝癌[7-8]。凋亡抵制在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，也是HCC對化療藥物產(chǎn)生抗藥性的主要原因[9-10]。Pin1是一種肽基脯氨酰胺順反異構(gòu)酶（peptidylprolyl cis/trans isomerase,PPIase），可特異性結(jié)合并催化磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸-脯氨酸基序（pSer/Thr-Pro motif）發(fā)生順反異構(gòu)，改變靶蛋白的活性、穩(wěn)定性或亞細胞定位[11]。Pin1在包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤組織中高表達，可以調(diào)節(jié)多個靶標分子的活性，參與各類細胞應(yīng)激應(yīng)答、調(diào)控細胞增殖和凋亡[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)在人結(jié)直腸癌細胞HCT116發(fā)生ERS時，Pin1表達量減少，細胞凋亡數(shù)量增加[14]；研究表明HepG2細胞中Pin1異構(gòu)酶活性比其他肝癌細胞株高[15]，ERS狀態(tài)下HepG2細胞中Pin1的表達情況和作用尚不清楚，因此本研究利用ERS誘導劑——衣霉素（tunicamycin,TM）誘導HepG2細胞產(chǎn)生ERS，檢測Pin1蛋白水平變化，探討Pin1在ERS狀態(tài)下對HepG2細胞增殖和凋亡的影響，為特異性提高ERS介導的細胞凋亡敏感度作為肝癌治療策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 衣霉素（TM）、全反式維甲酸（ATRA）購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒、Actin抗體（HC201-02）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Bip抗體（11587-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Pin1抗體（#3722）購自美國Cell Signaling Technology公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，Annexin V FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，DMEM、PBS、胰酶購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.1.2 細胞系 人正常肝細胞THLE3和人肝癌細胞HepG2購自中國科學院細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2細胞、THLE3細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液一次，取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞增殖檢測 實驗分組：（1）THLE3細胞TM組：設(shè)置0（只加DMSO）、1、2、4、6、8 μg/ml六個TM濃度；（2）HepG2細胞TM組：六個TM濃度同組（1）；（3）HepG2細胞TM+ATRA組：在組（2）的六個TM濃度上分別加25 μmol/L ATRA。實驗步驟：取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，按5×103個細胞每孔接種于96孔板中，每個濃度設(shè)置3個復孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，加入指定濃度的TM或ATRA，再培養(yǎng)48 h后，在每孔200 μl培養(yǎng)基中加入20 μl CCK-8試劑，37℃孵育1 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光值（A）。細胞增殖抑制率（IR）=（1-A值實驗組/A值對照組）×100%。以藥物濃度為橫坐標，以增殖抑制率為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.3 Western blot實驗 實驗分組與細胞增殖檢測相同，分別為：（1）THLE3細胞TM組；（2）HepG2細胞TM組；（3）HepG2細胞TM+ATRA組。實驗步驟：取對數(shù)生長期細胞，按（1.5～2）×105個細胞每孔接種于6孔板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，加入指定濃度的TM或ATRA，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用RIPA細胞裂解液提取蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，蛋白樣本與上樣緩沖液充分混勻后，95℃金屬浴10 min。進行聚丙烯凝膠電泳（濃縮膠5%，分離膠10%），分離蛋白后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉液中封閉1 h，一抗室溫孵育3 h，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，采用ECL化學發(fā)光。采用Image J軟件進行蛋白質(zhì)相對定量分析。

1.2.4 細胞凋亡檢測 實驗組：4 μg/ml TM作用于THLE3細胞，4 μg/ml TM、25 μmol/L ATRA、4 μg/ml TM+25 μmol/L ATRA分別作用于HepG2細胞，以DMSO處理的細胞作為對照組。實驗步驟：取對數(shù)生長期細胞，按3×105個細胞每孔接種于6孔板，12 h后進行加藥處理，48 h后收集加藥實驗組細胞和對照組細胞，用結(jié)合緩沖液重懸細胞進行計數(shù)，取2×105個細胞重懸于100 μl結(jié)合緩沖液中，加入5 μl FITC Annexin V和5 μl PI染料，輕柔混勻，室溫避光染色15 min后，每管加入400 μl結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 8統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)以（）表示，兩組間數(shù)據(jù)采用雙尾非配對t檢驗，多組間采用單因素方差分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ERS狀態(tài)下Pin1蛋白水平變化

Western blot結(jié)果顯示，隨著TM濃度的升高，THLE3和HepG2細胞內(nèi)ERS標志物Bip蛋白表達水平增高，說明細胞發(fā)生ERS。與DMSO對照組比較，THLE3細胞發(fā)生ERS后，Pin1蛋白水平逐漸減少，差異有統(tǒng)計學意義（均P=0.000），見圖1A；而HepG2細胞中Pin1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05），見圖1B。

2.2 ERS狀態(tài)下細胞的增殖變化

CCK-8檢測結(jié)果顯示，與HepG2 TM組相比，THLE3 TM組細胞增殖被明顯抑制，差異有統(tǒng)計學意義（均P=0.000），見圖2。

2.3 ERS狀態(tài)下細胞的凋亡變化

Western blot檢測顯示，TM組細胞Bip蛋白水平上調(diào)，說明細胞發(fā)生ERS；HepG2細胞Pin1的本底水平高于THLE3，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），見圖3A；與DMSO組相比，THLE3 TM組細胞中Pin1的蛋白水平顯著減少（P=0.000），而HepG2 TM組細胞中的Pin1表達不受影響，見圖3A。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與THLE3細胞DMSO組（（3.57±0.31）%）相比，TM組的細胞凋亡率（（22.25±0.78）%）升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001），見圖3B、C、F；HepG2細胞DMSO組和TM組的凋亡率分別為（5.10±1.00）%和（7.36±0.11）%，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.086），見圖3D、E、F。表明ERS誘導劑TM會促進正常肝細胞的凋亡，而不能促進HepG2細胞凋亡，Pin1蛋白可能在其中發(fā)揮重要作用。

2.4 ATRA降低ERS狀態(tài)下HepG2細胞中Pin1的表達

Western blot結(jié)果顯示，TM和ATRA的共同作用下，HepG2細胞中ERS標志物Bip蛋白水平隨著TM濃度的升高而增加，說明細胞發(fā)生ERS；Pin1蛋白水平隨著TM濃度的增加而減少，除1 μg/ml TM組外，其他TM濃度組與0 μg/ml TM組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.01），見圖4。

2.5 ATRA對ERS狀態(tài)下HepG2細胞增殖的影響

CCK-8 實驗結(jié)果顯示，與TM組相比，TM+ATRA組細胞增殖抑制率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.01），見圖5。提示降低Pin1的蛋白水平，可以增加ERS對HepG2細胞增殖的抑制能力。

2.6 ATRA對ERS狀態(tài)下HepG2細胞的凋亡影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與DMSO組（（5.10±1.00）%）相比，HepG2細胞TM組的細胞凋亡率（（7.36±0.11）%）有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.086）；ATRA組（（10.03±0.49）%）和TM+ATRA組（（23.70±0.75）%）的細胞凋亡率均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（PATRA組=0.024,PTM+ATRA組=0.002），見圖6。表明抑制Pin1蛋白，可提高ERS誘導HepG2細胞凋亡的作用。

3 討論

ERS是機體的自我保護機制，細胞通過UPR信號通路恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，維持細胞穩(wěn)態(tài)，促進細胞存活；當細胞過度損傷，無法恢復正常功能，ERS激活CHOP/GADD153細胞凋亡信號通路，清除受損細胞，維護機體生理平衡[16]。通過誘導腫瘤細胞發(fā)生ERS介導的細胞凋亡是一種新的腫瘤治療策略，但有研究表明，即使給予ERS誘導劑，腫瘤細胞的凋亡率并沒有明顯增加，說明腫瘤細胞可以抵制ERS介導的細胞凋亡[17]。本研究用ERS誘導劑TM作用于正常肝細胞THLE3和肝癌細胞HepG2，結(jié)果顯示正常肝細胞發(fā)生ERS后，細胞增殖抑制率和細胞凋亡率顯著增加，而HepG2細胞中沒有明顯變化。

HCC是常見的惡性腫瘤，具有發(fā)生隱匿、發(fā)展迅速、惡性程度高等特點，多數(shù)患者確診時已到了中晚期，錯過了手術(shù)的最佳時機，因此化療是主要的治療方法，但由于存在化療抗藥的情況，其治療效果并不理想[18]。凋亡抵制與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也是HCC對化療藥物產(chǎn)生抗藥性的主要原因[19]。研究HCC凋亡抵抗的原因和調(diào)控機制，對特異性提高細胞的凋亡敏感度，增強治療效果具有重要意義。既往研究表明，過表達Pin1蛋白可以保護HCT116細胞免受ERS誘導的細胞凋亡[14]；而與正常細胞相比，HepG2細胞中Pin1表達較高，且具有較強的異構(gòu)酶活性[15]。那么Pin1在HepG2細胞中是否也起到了抵抗ERS所誘導的細胞凋亡的作用？本研究結(jié)果顯示，與正常肝細胞相比，HepG2細胞發(fā)生ERS后，Pin1蛋白仍然維持在一定水平，且細胞增殖未受明顯影響。但在加入Pin1抑制劑ATRA后，細胞的增殖抑制率和凋亡率明顯增加。Jeong等研究報道表明，ERS狀態(tài)下人結(jié)直腸癌細胞通過p53抑制Pin1的表達，從而促進細胞凋亡[14]，然而ERS狀態(tài)下HepG2中Pin1的表達調(diào)控及其蛋白穩(wěn)定性調(diào)控還需進一步探討；Bae等報道與Huh7、HLE等肝癌細胞系相比，HepG2細胞中p53是野生型的，Pin1蛋白表達相對較少，但異構(gòu)酶活性較高[15]，這些差異是否會影響肝癌細胞應(yīng)對ERS介導的細胞凋亡，還需要進一步實驗。

綜上所述，在HepG2細胞中Pin1蛋白可以抵制ERS誘導的細胞凋亡，Pin1有可能成為提高ERS介導的凋亡敏感度的潛在靶點。聯(lián)合ERS誘導劑和Pin1抑制劑是否能有效的治療肝癌，還需進一步在更多的肝癌細胞株以及腫瘤小鼠模型中開展實驗。