王霖，黃紫弦，尤程程,2，譚順梓，黃利鳴,2，黃益玲,2

0 引言

據(jù)2020年世衛(wèi)組織全球癌癥統(tǒng)計，肺癌發(fā)病數(shù)占癌癥總病例數(shù)的11.4%，占癌癥總死亡病例數(shù)的18.0%，是最主要的癌癥死亡原因[1]。肺癌在組織病理學(xué)上主要分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）兩類。非小細胞肺癌是肺癌中最常見的類型，約占每年新發(fā)肺癌患病總例數(shù)的80%～85%[2]。肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）約占NSCLC所有類型的80%。近年來與非吸煙相關(guān)的女性肺腺癌患者呈逐年上升趨勢，化療是其主要的治療方法，可以顯著改善患者的預(yù)后[3-4]。

順鉑（cisplatin,DDP）是一種作用較強的細胞周期非特異性阻斷藥物，其作用基礎(chǔ)是與癌細胞DNA結(jié)合形成DNA-鉑加合物，破壞DNA合成和有絲分裂，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。順鉑被廣泛應(yīng)用于肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、胃癌、頭頸部癌等多種癌癥的治療[5-6]。但是除了睪丸癌之外，其他惡性腫瘤細胞因逐漸產(chǎn)生耐藥性而對順鉑的敏感度降低。因此深入探討順鉑的耐藥機制對于提高肺癌患者的生存率具有重要意義。本研究旨在基于TCGA癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫篩選肺腺癌順鉑耐藥的分子標志物，為肺腺癌順鉑耐藥的治療和逆轉(zhuǎn)提供可能的靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人肺腺癌細胞株A549（三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室保存），人肺腺癌順鉑耐藥株A549/DDP（購自武漢普諾賽公司），順鉑（美國Sigma公司，PBS配置，-80℃避光保存），DMEM培養(yǎng)基粉末、F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司），TRIzol裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司），引物合成（上海生工生物公司），CXCL10 ELISA試劑盒（武漢，Elabscience公司），實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），siRNA由蘇州吉瑪生物公司設(shè)計合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌細胞系A(chǔ)549采用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。人肺腺癌順鉑耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP采用F-12K培養(yǎng)液培養(yǎng)，順鉑維持濃度為1.5 μg/ml。兩種細胞系均加入10%血清，1%青霉素和鏈霉素，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取其處于對數(shù)生長期細胞待用，且A549/DDP細胞脫藥培養(yǎng)后用于實驗。

1.2.2 數(shù)據(jù)的獲取 從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中下載已處理的肺腺癌原始mRNA表達數(shù)據(jù)，一共收集到肺腺癌標本535份。

1.2.3 藥物敏感度分析 基于最大的藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫—GDSC癌癥藥物敏感度基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（https://www.cancerrxgene.org/），使用R軟件包“pRRophetic”預(yù)測每個肺腺癌腫瘤樣本的化療敏感度，線性回歸分析得到順鉑藥物治療的IC50估計值，將樣本區(qū)分為順鉑敏感組和耐藥組，并用GDSC訓(xùn)練集進行10次交叉驗證檢驗回歸和預(yù)測精度。所有參數(shù)都選擇默認值，包括去除批處理效應(yīng)的“combat”以及取重復(fù)基因表達的平均值。

1.2.4 差異表達分析 根據(jù)患者的IC50中位值劃分為高低兩組，探討兩組患者的表型差異。利用limma包對下載的mRNA level 3的FPKM數(shù)據(jù)進行整合和標準化，分析差異表達基因及其表達水平，差異基因篩選條件為|LogFC|>1且P<0.05。

1.2.5 GO功能富集分析和KEGG信號通路分析 為了獲得與疾病發(fā)生發(fā)展所涉及的生物學(xué)功能和信號通路，使用Metascape數(shù)據(jù)庫（www.metascape.org）進行注釋和可視化，對特定基因進行基因本體（GO）分析和京都基因組百科全書（KEGG）通路分析。Min overlap≥3 &P≤0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.6 差異基因的PPI構(gòu)建及基因模塊分析 使用STRING在線數(shù)據(jù)庫11.0（https://string-db.org）探討突變基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，并將置信度得分>0.4作為截點標準。進一步通過Cytoscape軟件可視化生成的PPI網(wǎng)絡(luò)，分析突變在肺腺癌順鉑耐藥發(fā)生發(fā)展中的作用，探討突變與基因表達的相關(guān)性。

1.2.7 Hub基因的聚類分析 通過Cytoscape軟件的MCODE插件對差異基因進行聚類，分析Hub基因與腫瘤的關(guān)系。

1.2.8 MTT法檢測細胞增殖情況 待檢測細胞用0.25%胰蛋白酶消化，以5000個/孔的濃度加入到96孔板中，加入200 μl的培養(yǎng)基至細胞貼壁，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入含有不同藥物濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml）溶液混勻，孵育4 h后終止培養(yǎng)；每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μl混勻，室溫培養(yǎng)15 min；酶標儀檢測490 nm處的吸光度值（OD值），計算細胞增殖抑制率，抑制率=（1-實驗組OD值）/對照組OD值×100%。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.9 qRT-PCR檢測 收集細胞后置于冰上，加入TRIzol裂解液冰上靜止裂解細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR，反應(yīng)體系為10 μl：SYBR?Premix 5 μl，5×cDNA 2.5 μl，上下游引物各0.25 μl，ROX 0.2 μl，H2O 1.8 μl；反應(yīng)程序為95℃ 15 s；95℃ 3 s；60℃ 30 s，循環(huán)40次；95℃ 15 s；60℃ 1 min；72℃ 10 min。引物序列：CXCL10：Forward:5'-CCACGTGTTGAGATCATTGCT-3’，Reverse:5’-TGCATCGATTTTGCTCCCCT-3’；GAPDH：Forward:5’-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3’，Reverse:5’-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3’。以GAPDH為內(nèi)參基因。

1.2.10 細胞轉(zhuǎn)染及分組 取傳代培養(yǎng)的A549/DDP細胞，按照4×103萬個/孔接種于96孔板，按說明書配置轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染細胞48 h后換成含有DDP的培養(yǎng)基，DDP濃度梯度為：0、1、2、4、8、16、32、64 μg/ml，處理72 h后MTT法檢測細胞增殖情況。轉(zhuǎn)染CXCL10 siRNA的細胞作為siCXCL10組，轉(zhuǎn)染NC（陰性對照）的細胞作為NC組。siCXCL10序列為sense:5’-GGAGUACCUCUCUCUAGAATT-3’，antisense:5’-UUCUAGAGAGAGGUACUCCTT-3’，NC為無效干擾序列。

1.2.11 ELISA法檢測細胞上清液中CXCL10蛋白的表達 收集待測的細胞上清液，4℃、1000g離心20 min，除去雜質(zhì)及細胞碎片，然后根據(jù)試劑盒說明書進行ELISA法檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用軟件SPSS26.0進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism8.0進行統(tǒng)計圖繪制。兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選順鉑敏感組和耐藥組的差異表達基因

根據(jù)分析結(jié)果繪制差異基因的火山圖，共篩選獲得178個差異基因，與順鉑敏感組相比，耐藥組表達上調(diào)的基因有127個，表達下調(diào)的基因有51個，見圖1。

2.2 差異表達基因涉及的主要分子功能、生物學(xué)過程、細胞組分及通路

GO分析結(jié)果表明，差異表達基因的分子功能主要表現(xiàn)在免疫相關(guān)反應(yīng)、板層小體、趨化因子受體結(jié)合、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、整合素介導(dǎo)的細胞黏附調(diào)控、花生四烯酸代謝過程等方面。KEGG通路分析結(jié)果表明，差異基因主要富集的通路包括免疫球蛋白復(fù)合物（immuoglobulin complex）、免疫球蛋白生成（immunoglobulin production）、板層小體（lamellar body）、CXCR3趨化因子受體結(jié)合（CXCR3 chemokine receptor binding）、免疫相關(guān)反應(yīng)（antibacterial humoral response）等信號通路，提示免疫相關(guān)反應(yīng)可能參與肺腺癌患者對順鉑的耐藥性，見圖2。

2.3 差異基因構(gòu)建的PPI分析結(jié)果

PPI網(wǎng)絡(luò)分析一共獲得11個Hub基因：CXC基序趨化因子9（C-X-C motif chemokine 9,CXCL9）、CXC基序趨化因子10（C-X-C motif chemokine 10,CXCL10）、NKX同源框-1基因（NKX homeobox-1 gene,NKX2-1）、肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A1（Pulmonary surfactantassociated protein A1,SFTPA1）、肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白B（Pulmonary surfactant-associated protein B,SFTPB）、肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A2（Pulmonary surfactant-associated protein A2,SFTPA2）、肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白D（Pulmonary surfactant-associated protein D,SFTPD）、顆粒酶B（Granzyme B,GZMB）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase-9,MMP9）、CXC基序趨化因子11（C-X-C motif chemokine 11,CXCL11）和黏蛋白-1（Mucin-1,MUC1），見圖3。

2.4 差異表達基因的聚類分析

通過Cytoscape的MCODE插件對差異基因進行聚類，共劃分成3個基因模塊，見圖4。

2.5 順鉑對A549和A549/DDP細胞增殖的抑制作用

MTT法檢測結(jié)果顯示：順鉑對A549細胞作用48 h的IC50為3.47±0.95 μg/ml，順鉑對A549/DDP細胞作用48 h的IC50為24.27±5.52 μg/ml，見表1。經(jīng)計算耐藥指數(shù)（RI）值為7.0。

表1 順鉑作用48h對肺腺癌A549及A549/DDP細胞的增殖抑制率 (,%)Table 1 Inhibitory effect of DDP treatment for 48h on A549 and A549/DDP cell proliferation (,%)

表1 順鉑作用48h對肺腺癌A549及A549/DDP細胞的增殖抑制率 (,%)Table 1 Inhibitory effect of DDP treatment for 48h on A549 and A549/DDP cell proliferation (,%)

Notes:*:P<0.05,***:P<0.001,compared with the blank group without cisplatin treatment (inhibitory rate was 0);DDP:cisplatin.

2.6 CXCL10在A549和A549/DDP細胞中mRNA表達量差異及上清液中蛋白表達量差異

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，A549/DDP細胞中CXCL10的表達水平顯著高于A549細胞（10.544±1.338vs.1.000±0.000,P<0.001），與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。ELISA結(jié)果顯示，A549/DDP細胞上清液中CXCL10蛋白的表達量高于A549細胞（278.126±13.923vs.142.463±8.951,P<0.001），與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果一致。

2.7 轉(zhuǎn)染siCXCL10對A549/DDP細胞中CXCL10 mRNA表達及上清液中CXCL10蛋白表達的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，siCXCL10組CXC10 mRNA表達水平明顯低于NC組（0.115±0.013vs.1.000±0.000,P<0.001）。ELISA結(jié)果顯示，siCXCL10組CXC10蛋白表達水平明顯低于NC組（119.242±11.699vs.247.647±15.680,P<0.001）。

2.8 DDP對NC、siCXCL10轉(zhuǎn)染A549/DDP細胞后72 h增殖的抑制作用

轉(zhuǎn)染NC及siCXCL10序列48 h后DDP處理72 h，NC組IC50為8.75±0.41 μg/ml，siCXCL10組IC50為5.00±0.31 μg/ml，見表2。與NC組相比，siCXCL10組對DDP的敏感度增加。

表2 順鉑作用72h對NC、siCXCL10轉(zhuǎn)染的肺腺癌A549/DDP細胞的增殖抑制率 (,%)Table 2 Inhibitory effect of DDP on proliferation of A549/DDP cells transfected with NC and siCXCL10 for 72 h (,%)

表2 順鉑作用72h對NC、siCXCL10轉(zhuǎn)染的肺腺癌A549/DDP細胞的增殖抑制率 (,%)Table 2 Inhibitory effect of DDP on proliferation of A549/DDP cells transfected with NC and siCXCL10 for 72 h (,%)

Notes:*:P<0.05,***:P<0.001,compared with the blank group without cisplatin treatment (inhibitory rate was 0);#:P<0.05,##:P<0.01,compared with NC groups treated with the same concentration of DDP.

3 討論

肺癌治療手段多樣化，以順鉑為基礎(chǔ)的化療方式是其主要治療手段之一，但順鉑耐藥性問題使治療效果降低，因此研究順鉑的耐藥機制刻不容緩。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載535例肺腺癌患者表達譜，通過GDSC癌癥藥物敏感度基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫對其進行順鉑耐藥性劃分，得到順鉑敏感組和耐藥組各267例。使用R語言篩選兩組之間的差異表達基因，并對差異表達基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)，差異基因涉及分子功能的變化主要表現(xiàn)在免疫相關(guān)反應(yīng)、板層小體、趨化因子受體結(jié)合、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、整合素介導(dǎo)的細胞黏附調(diào)控、花生四烯酸代謝過程等方面。為了闡明這些差異基因?qū)π盘柾返恼{(diào)節(jié)進行了KEGG通路分析，差異基因主要在免疫相關(guān)反應(yīng)、趨化因子受體結(jié)合等相關(guān)通路富集。通過進一步基因模塊分析，結(jié)果顯示共有四個基因連接度大于10，分別是CXCL9、NKX2-1、SFTPA1以及CXCL10。這些基因涉及趨化因子受體結(jié)合、甲狀腺穩(wěn)態(tài)調(diào)控、肺表面相關(guān)調(diào)控等。然后通過肺腺癌細胞A549及肺腺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP初步驗證生物信息學(xué)挖掘的數(shù)據(jù)結(jié)果，并沉默A549/DDP細胞中CXCL10 mRNA的表達水平后發(fā)現(xiàn)其對DDP敏感度增加。

CXCL10是半胱氨酸-X氨基酸-半胱氨酸（CXC）亞家族細胞因子中的一種小分子分泌型蛋白，通過與CXCR3受體結(jié)合并傳遞信號，在介導(dǎo)白細胞轉(zhuǎn)運、獲得性免疫、炎性反應(yīng)和血管生成等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[7]。研究表明，由腫瘤或免疫細胞產(chǎn)生的CXCL10可以招募與腫瘤抑制相關(guān)的CXCR3+腫瘤浸潤性T細胞和NK細胞，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。但是也有研究報道CXCL10能夠增強多種癌細胞的遷移、侵襲、增殖和細胞外基質(zhì)黏附[9]。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子在多種癌癥中可以通過自分泌軸促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并且與細胞自噬及凋亡等途徑相關(guān)[10-11]。在胰腺癌的研究中，CXCL10被胰腺癌細胞誘導(dǎo)并招募免疫抑制的CXCR3+T細胞至癌細胞處，以阻斷抗原細胞對T效應(yīng)細胞的刺激或直接抑制效應(yīng)T細胞和NK細胞，促進胰腺腫瘤的生長和發(fā)展[12]。與正常組織相比，CXCL10在肺腺癌中高表達并且發(fā)揮重要作用[13]。在最新的關(guān)于程序性死亡受體1（PD-1）/程序性死亡受體配體1（PD-L1）免疫檢查點抑制劑的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCL10是肺癌患者抗PD-1/PD-L1治療和預(yù)后信息的潛在預(yù)測標志物[14]。

Ling等[15]發(fā)現(xiàn)，相比接受大體積肝移植的患者，小體積肝移植術(shù)后肝癌患者的復(fù)發(fā)率更高，并且在腫瘤內(nèi)部以及血漿中伴隨著更高濃度的內(nèi)皮祖細胞（EPC）以及CXCL10；體外研究發(fā)現(xiàn)高濃度的CXCL10可以以劑量方式或者CXCR3依賴的方式招募EPC，并具有直接誘導(dǎo)EPC活化、分化以及血管形成的作用，這可能給接受肝移植的肝癌患者提供一個復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的環(huán)境，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展。Dimberg等[16]發(fā)現(xiàn)CXCL10在直腸癌組織中的水平比癌周組織的水平更高，并且與局限性腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性腫瘤的CXCL10水平也更高，這表明CXCL10與直腸癌的進展也有關(guān)系。CXCL10在腫瘤發(fā)生中的雙重作用取決于相應(yīng)的CXCR3受體的剪接變體。據(jù)報道，CXCR3-A可與Gai相互作用，激活p38/MARK、ERK1/2、PI3K/Akt和JNK通路，誘導(dǎo)細胞增殖或趨化；CXCR3-B可以與Gas偶聯(lián)，激活腺苷酸環(huán)化酶，抑制增殖和遷移[17-18]。Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn)CXCL10可以促進乳腺癌細胞MCF7雌激素依賴性和非依賴性增殖，并且抑制CXCL10可以恢復(fù)乳腺癌對他莫昔芬的敏感度。但是目前對于CXCL10與肺腺癌順鉑耐藥的關(guān)系尚無研究報道。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)的方法篩選出可能參與肺腺癌順鉑耐藥過程的4個連接度大于10的基因：CXCL9、NKX2-1、SFTPA1以及CXCL10。然后通過qRT-PCR實驗驗證CXCL10基因在A549/DDP細胞中的mRNA表達量顯著高于A549細胞，與分析結(jié)果一致，最后沉默CXCL10的表達后發(fā)現(xiàn)A549/DDP細胞對DDP的敏感度增加。說明CXCL10基因在肺腺癌順鉑耐藥中起到一定的調(diào)控作用，可能是潛在的耐藥機制，但仍需要實驗室和臨床的進一步研究驗證。本實驗只是選擇了其中的一個關(guān)鍵基因進行實驗驗證，后續(xù)會繼續(xù)驗證其他幾個關(guān)鍵基因的表達情況及作用。