陳婷婷, 何雅玲, 葉紅玲, 葉 明

(1.合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601; 2.安慶職業(yè)技術學院 農林與服裝學院,安徽 安慶 246003)

肝臟疾病包括藥物性肝損傷、酒精性肝損傷和肝癌等,是世界上發(fā)病率和死亡率較高的一類疾病,并給社會帶來巨大的經濟負擔[1]。二乙基亞硝胺(NDEA)作為一種致癌物質,存在于生活的各個方面,如化妝品[2]、食品[3]、自來水[4]等。NDEA在體內可以引起氧化損傷、代謝紊亂、肝損傷等多種病理現(xiàn)象[5-6]。多酚作為一種具有抗氧化能力的次級代謝產物[7],其生物活性繁多,作為藥物治療肝臟疾病有一定的研究基礎[8]。

粒毛盤菌屬(LachnumRetz.)作為一種重要的真菌資源,生長周期短、易培養(yǎng)、代謝物種類多。有研究者從粒毛盤菌菌絲體及發(fā)酵液中提取出多種活性物質,如異香豆素衍生物[9]、多糖[10]以及多酚類化合物[11],并發(fā)現(xiàn)其多酚提取物具有抗凝血、抗氧化等作用[11-12]。但是,有關粒毛盤菌多酚對肝臟疾病是否具有預防或治療作用的報道并不多。因此,本文對粒毛盤菌YM156進行深層發(fā)酵,利用70%的乙醇溶液提取菌絲體中的多酚類物質,并采用NDEA誘導昆明小鼠建立肝損傷模型,研究粒毛盤菌多酚對肝損傷的保護作用,為粒毛盤菌的利用與發(fā)展提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

粒毛盤菌(Lachnum)YM156采集和分離自中國黃山,并保存于合肥工業(yè)大學微生物資源與應用研究室。

1.2 YM156胞內多酚的發(fā)酵、提純與測定

1.2.1 YM156胞內多酚的發(fā)酵

采用100 L全自動發(fā)酵罐進行深層發(fā)酵[13]。培養(yǎng)基配方為:20 g/L葡萄糖,5 g/L酵母膏,5 g/L蛋白胨,0.81 g/L MgCl2,0.01 g/L酪氨酸。首先對發(fā)酵罐進行清潔與滅菌,配置70 L的發(fā)酵液加入罐中,并加入消泡劑(50 mL色拉油)。于121 ℃再次滅菌20 min,冷卻至30 ℃時接入菌種,發(fā)酵條件為:轉速200 r/min,溫度30 ℃,時間8 d。

1.2.2 YM156胞內多酚的提純

粒毛盤菌YM156發(fā)酵結束后,對發(fā)酵液進行抽濾,收集菌絲體并在60 ℃的烘箱中干燥。將菌絲粉碎,70%乙醇浸泡提取4 h,離心、收集上清液,45 ℃旋轉蒸發(fā)除去乙醇,重復3次。合并濃縮液真空冷凍干燥后,采用XAD-4型大孔樹脂對粗提物進行純化[14]。洗脫條件為:樣品質量濃度為10 mg/mL,流速為2 mL/min,洗脫液為70%乙醇。收集洗脫液并除去乙醇,干燥后得到粒毛盤菌YM156多酚提取物(LSP156),并保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3 YM156胞內多酚量的測定

采用文獻[15]的方法測定LSP156中總酚的量,其中樣品溶液質量濃度為1 mg/mL?？傻没貧w方程為y=7.1x+0.043,R2=0.999。經測定,LSP156中總酚的量為85.9 mg/g。

1.3 肝損傷模型的建立及給藥

采用清潔級昆明小鼠(雄性,20～22 g,40只),適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為5組(n=8)[16]:對照組CG,NDEA模型組MG(150 mg/kg NDEA),單獨LSP156組LG(100 mg/kg LSP156),低劑量組LL(50 mg/kg LSP156和150 mg/kg NDEA),高劑量組HL(100 mg/kg LSP156和150 mg/kg NDEA)。除了對照組和NDEA模型組外,其余3組小鼠每天灌胃0.2 mL的多酚溶液,持續(xù)28 d。在第29天,對照組和單獨LSP156組腹腔注射0.1 mL的生理鹽水,剩余3組注射0.1 mL的NDEA溶液(150 mg/kg),12 h后進行眼球取血,處死后解剖得到小鼠肝臟組織,生理鹽水清洗并保存于-80 ℃冰箱。

1.4 生化指標測定

取出-80 ℃冰箱保存的小鼠肝臟,精確稱取1 g肝臟,與9 mL生理鹽水混合后勻漿并離心取上清,獲得的10%肝組織勻漿備用。眼球取血30 min后,于3 000 r/min離心10 min,取上清液獲得小鼠血清,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

肝功能指標的測定。選取合適質量分數(shù)的肝臟組織勻漿,按照試劑盒說明書(南京建成生物科技有限公司)測定并計算谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)和堿性磷酸酶(AKP)的活性。

氧化損傷指標的測定。首先進行預試驗確定肝臟組織勻漿的最佳質量分數(shù),采用商業(yè)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)檢測肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性。

血脂指標的測定。根據(jù)制造商(南京建成生物科技有限公司)的說明,通過測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)來檢測和分析小鼠的脂質指標。

炎癥反應指標的測定。使用ELISA試劑盒(合肥博美生物科技有限責任公司)測定小鼠血清中白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的質量濃度。

肝臟勻漿中蛋白質的測定采用BCA法試劑盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.5 組織病理學測定

采用H&E染色法對小鼠肝臟組織進行染色并觀察其病理學[17]。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.0進行數(shù)據(jù)分析,以(平均值±標準差)表示。組間分析采用One-way ANOVA檢驗,分析統(tǒng)計學意義。與對照組相比,*P< 0.05 具有顯著差異;與NDEA模型組相比,#P< 0.05具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 LSP156對小鼠肝功能指標的影響

LSP156對小鼠體內AST、ALT和AKP酶活力的影響如圖1所示。

圖1 LSP156對小鼠體內AST、ALT和AKP酶活力的影響

從圖1可以看出,與對照組相比,NDEA模型組小鼠肝臟中AST、ALT和AKP顯著增高(P<0.05);在單獨LSP156組中,AST、ALT和AKP沒有顯著變化;而經過LSP156預處理后,NDEA模型組小鼠肝臟中相關酶活性均有不同程度的降低。其中,與NDEA模型組相比,高劑量組中AST、ALT和AKP顯著性降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這種變化與文獻[18]研究結果相似。在機體中,ALT、AST和AKP是與肝臟代謝相關的細胞酶,當肝臟發(fā)生損傷時,這些酶的水平和活性受到影響[19]。在本研究中,LSP156的處理降低了小鼠肝臟中AST、ALT和AKP的活性,減輕了NDEA對小鼠肝臟的損傷,說明LSP156對肝臟具有較強的保護作用。

2.2 LSP156對小鼠體內抗氧化酶的影響

LSP156對小鼠體內抗氧化酶的影響如圖2所示。由圖2可知,與對照組相比,NDEA模型組中SOD和CAT降低,分別為17%和27%,說明NDEA會降低正常小鼠體內的抗氧化酶活性,引起氧化還原失衡,導致氧化損傷;而使用LSP156預處理后,單獨LSP156組中抗氧化酶活性增加(無顯著差異)。與NDEA模型組相比,100 mg/kg LSP156預處理的小鼠體內SOD增高,并具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而對于CAT,不同劑量的LSP156預處理能提高其酶活力,但不具有統(tǒng)計學意義。結果表明,LSP156能夠增強體內抗氧化酶活性,維持氧化還原平衡,減少NDEA對小鼠的損傷。

圖2 LSP156對小鼠體內SOD和CAT酶活力的影響

2.3 LSP156對小鼠體內TC和TG水平的影響

各組小鼠肝臟中TC和TG濃度的變化情況如圖3所示。

圖3 LSP156對小鼠體內TG和TC水平的影響

由圖3可知,與對照組相比,NDEA模型組中TC和TG的水平顯著升高,具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05),表明小鼠急性肝損傷會導致肝臟內部TC和TG的蓄積;在低劑量和高劑量組中,LSP156降低了TC和TG的水平,并具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。同時,單獨LSP156組中脂質指標水平降低,說明LSP156對于小鼠的血脂水平具有改善作用。

2.4 LSP156對小鼠炎性因子的影響

炎癥反應是機體中一種重要的防御機制,機體中炎癥因子的大量產生會導致肝臟損傷。LSP156對小鼠體內IL-6和TNF-α水平的影響如圖4所示。

圖4 LSP156對小鼠體內IL-6和TNF-α水平的影響

從圖4可看出,在NDEA模型組中,小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平顯著升高(P<0.05),說明NDEA刺激機體產生炎癥反應;在低劑量和高劑量組中,LSP156的預處理降低了小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平。結果表明，LSP156可以減輕NDEA誘導的肝臟炎性反應,從而對肝臟起到一定的保護作用。

2.5 LSP156對小鼠肝組織病理學的影響

NDEA不僅會導致肝功能受損,還會影響肝臟組織結構。肝組織學切片(放大400倍)如圖5所示,圖5中箭頭所示為肝細胞體積增大,水樣性變、核仁增多。

圖5 肝組織學切片

由圖5可知,對照組和單獨LSP156組中小鼠肝臟結構正常,肝細胞排列緊密,界線明顯,細胞核正常;NDEA模型組中出現(xiàn)肝細胞體積增大,水樣性變,核仁增多,肝組織結構松散以及一些小灶性壞死。而LSP156的預處理減少了NDEA導致的肝臟組織病變,表明LSP156顯著減輕了肝病損害。

3 討 論

多酚類物質是自然界中最豐富的抗氧化劑,主要來源于水果、蔬菜以及一些真菌微生物等[20-21]。這些多酚類化合物可以通過不同的機制發(fā)揮其抗氧化性能,如清除自由基、改善內源性酶防御、降低脂質過氧化等[22]。眾所周知,氧化過程與多種疾病有關,如神經退行性疾病、癌癥、糖尿病、心血管疾病以及一些炎癥疾病[23],這些均與多酚類化合物的生物學活性相關[24]。事實上,多酚類藥物治療肝臟疾病已有幾十年的歷史,并且有關體內外的研究也已經取得了振奮人心的結果。例如,槲皮素作為一種天然多酚類化合物,能通過抗氧化應激和抗炎作用保護肝臟免受CCl4誘導的損傷[25]。此外,多酚還可以通過多種分子機制預防甚至治療肝癌[26]。

肝臟作為人體中最大的解毒和代謝器官,NDEA能夠造成肝臟損傷[16]。在本研究中,LSP156能夠減輕肝臟損傷,降低小鼠體內ALT、AST和AKP活性。有研究表明,NDEA能夠導致機體中氧化還原反應失衡,減少抗氧化酶的水平[26],在機體中,SOD和CAT是2種重要的抗氧化活性酶,其中,SOD主要催化超氧陰離子自由基,而CAT催化過氧化氫,但超氧陰離子自由基和過氧化氫同屬于活性氧(reactive oxygen species,ROS)。本文發(fā)現(xiàn)不同劑量的LSP156可以提高SOD和CAT的活性,抗氧化酶活性增加,從而降低活性氧水平,維持機體平衡。與此同時,本文還研究了小鼠體內TC和TG的水平。在機體中肝臟對脂肪、糖原等的運輸和代謝尤為重要,而LSP156則緩解NDEA導致的脂質代謝紊亂[27]。此外,LSP156還降低了肝損傷小鼠血清中IL-6和TNF-α的質量濃度。機體中,IL-6和TNF-α是2種重要的細胞因子,在炎癥、細胞免疫等活動中起著關鍵的作用[28]。結果表明,LSP156通過提高肝功能、調節(jié)氧化應激、降低脂質損傷以及抑制炎癥反應來減輕NDEA造成的肝損傷,具有非常良好的保肝活性,但其具體的作用機制仍需進一步深入研究。