張 敏, 黃 蓉, 段亞君, 楊瀟瀟, 余茂耘

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.重大疾病代謝及營養(yǎng)調(diào)控安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230601; 3.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院,安徽 六安 237012)

脫發(fā)是臨床中較為常見的一種皮膚疾病,其發(fā)病率逐年上升,較難治愈,并呈年輕化趨勢發(fā)展,正在困擾著越來越多人的生活[1]。雖然脫發(fā)不會對患者的身體健康產(chǎn)生影響,但對生活質(zhì)量和心理健康均存在著較為嚴(yán)重的負(fù)面作用[2]。因此治療脫發(fā)藥物研究備受關(guān)注。脫發(fā)的類型有多種,常見的有斑禿和雄激素性脫發(fā),脫發(fā)多與自身免疫以及毛囊微型化相關(guān),但是具體的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[3]。目前臨床用于治療脫發(fā)的藥物主要有米諾地爾和非那雄胺,雖然對脫發(fā)有一定治療作用,但其治療作用是暫時(shí)的,并且伴有皮膚瘙癢、抑郁和性功能障礙等不良反應(yīng),因此開發(fā)安全有效的毛發(fā)生長促進(jìn)劑成為研究的熱點(diǎn)[4-5]。

石斛屬是蘭科大屬,在我國作為民間藥物至今已有2 300多年的歷史[6],本研究所采用的霍山石斛于2020年正式納入《中華人民共和國藥典》,其中包括金釵石斛、霍山石斛和鼓槌石斛等。石斛中主要含有多糖、生物堿、氨基酸、酚、類黃酮等多種有效成分[7],具有促進(jìn)血管生成、保護(hù)神經(jīng)、調(diào)節(jié)血糖、增強(qiáng)免疫力等功效[8]。但石斛對于脫發(fā)的作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過脫毛建立小鼠脫發(fā)模型,觀察霍山石斛對小鼠毛發(fā)生長的作用,并分析其治療脫發(fā)的機(jī)制,為治療脫發(fā)藥物的研發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡SPF級C57BL/6J小鼠(體質(zhì)量為20～30 g),購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016-0011。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級小鼠飼養(yǎng)室,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循合肥工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物道德倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物與試劑

霍山石斛由安徽同濟(jì)生生物科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)所用霍山石斛榨汁液為新鮮霍山石斛10 g,加入50 mL純凈水榨汁所得,現(xiàn)榨現(xiàn)用;H&E染液購于北京蘭杰柯科技有限公司;TRIzol試劑購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于南京維諾贊生物科技有限公司;免疫組化試劑盒購于美國Abcam公司;Ki-67兔多克隆抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)兔多克隆抗體、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β(LC3Ⅱ)兔多克隆抗體、轉(zhuǎn)換生長因子-β1(TGF-β1)兔多克隆抗體,均購于美國Proteintech公司;GAPDH鼠單克隆抗體、β-actin兔單克隆抗體,均購于中國ABclonal;p62鼠單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要儀器

組織自動(dòng)脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、冷臺、石蠟切片機(jī)均購于德國徠卡公司;SCIENTZ48高通量組織研磨器購于寧波新芝生物科技股份有限公司;酶標(biāo)儀購于美國Bio Tek公司;凝膠成像儀購于上海勤翔科學(xué)儀器有限公司; LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀購于瑞士Roche公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模、分組及給藥

小鼠隨機(jī)分為對照組和霍山石斛組,每組5只。小鼠用4%水合氯醛麻醉后,用小鼠剃毛器剃去其背部2 cm×3 cm面積的毛發(fā)構(gòu)建脫發(fā)模型。對照組不作任何處理,霍山石斛組每天涂抹0.2 mL質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的新鮮石斛汁,共持續(xù)14 d。飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食和飲水。

2.2 組織病理學(xué)檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,小鼠安樂死,取背部相同位置的皮膚,置于4%的多聚甲醛溶液中,4 ℃固定24 h,脫水機(jī)脫水、石蠟包埋,制備厚度為5 μm的石蠟切片,后續(xù)用于H&E染色和免疫組化染色。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

使用TRIzol法提取小鼠背部皮膚組織的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得cDNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測Bcl-2、LC3Ⅱ、p62、TGF-β1的mRNA相對表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表1所列。

表1 引物序列

2.4 Western Blot實(shí)驗(yàn)

取皮膚組織約30 mg,加入500 μL組織裂解液后經(jīng)組織研磨機(jī)充分研磨提取組織蛋白,BCA法檢測樣品蛋白質(zhì)量濃度,按每孔45 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,濕法轉(zhuǎn)膜,5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h,條帶采用相應(yīng)的一抗于4 ℃孵育過夜,然后用PBST洗滌3次,每次8 min,相應(yīng)二抗孵育1 h,然后用PBST洗3次,每次8 min。滴加ECL顯影液于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩樣本均數(shù)使用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 霍山石斛對小鼠毛發(fā)生長的影響

為了探究霍山石斛對毛發(fā)生長的促進(jìn)作用,在連續(xù)給藥14 d后,對比各組小鼠背部毛發(fā)生長情況,結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,對照組與霍山石斛組小鼠背部毛發(fā)均有生長,與對照組相比,霍山石斛組小鼠背部毛發(fā)生長更為明顯,毛發(fā)更為濃密。結(jié)果表明霍山石斛可以促進(jìn)小鼠背部脫毛區(qū)毛發(fā)的生長。

圖1 霍山石斛促進(jìn)脫發(fā)區(qū)毛發(fā)生長情況

3.2 霍山石斛對小鼠背部皮膚毛囊形態(tài)的影響

為了探究霍山石斛對小鼠皮膚毛囊的影響,將對照組和霍山石斛組小鼠背部皮膚組織切片進(jìn)行H&E染色,觀察對照組與霍山石斛組小鼠背部皮膚的毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出,與對照組相比,霍山石斛組的毛囊密度顯著高于對照組,霍山石斛組的毛囊大小顯著大于對照組,并且毛囊結(jié)構(gòu)形態(tài)更加完整。結(jié)果表明,霍山石斛可以增加小鼠背部皮膚的毛囊數(shù)量并且改善毛囊形態(tài)。

圖2 小鼠背部皮膚H&E染色結(jié)果

3.3 霍山石斛對小鼠皮膚毛囊生成的影響

Ki-67是增殖細(xì)胞核抗原,可以反映細(xì)胞增殖情況,是評估細(xì)胞增殖活性的重要標(biāo)志物。為了探究霍山石斛是否可以加速毛囊的形成,本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化染色檢測小鼠背部皮膚組織Ki-67的表達(dá)水平,結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出,在對照組和霍山石斛組的小鼠背部皮膚中均能檢測出Ki-67的表達(dá),但與對照組相比,霍山石斛組Ki67的表達(dá)量顯著高于對照組。結(jié)果表明，霍山石斛可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,加速小鼠背部皮膚毛囊的形成。

圖3 小鼠背部皮膚Ki-67表達(dá)水平

3.4 霍山石斛對脫發(fā)的緩解作用

Bcl-2和Bax是線粒體凋亡途徑的重要因子,Bcl-2能夠抑制細(xì)胞凋亡,而Bax不僅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用,還會促進(jìn)凋亡。本文研究表明霍山石斛可以促進(jìn)毛囊的生長,為探究霍山石斛對毛囊凋亡的影響。本實(shí)驗(yàn)通過Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對抑制凋亡分子Bcl-2進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,與對照組對比,霍山石斛組的Bcl-2的蛋白(P<0.05)和mRNA(P<0.01)表達(dá)水平顯著升高。結(jié)果表明,霍山石斛通過促進(jìn)Bcl-2的表達(dá),抑制凋亡緩解脫發(fā)。

圖4 抑制凋亡分子Bcl-2的檢測結(jié)果

3.5 霍山石斛對毛囊活化的促進(jìn)作用

p62和LC3Ⅱ?yàn)樽允蓸?biāo)志物,相關(guān)研究表明誘導(dǎo)自噬是啟動(dòng)毛囊活化和毛發(fā)再生的重要條件[9]。為了明確霍山石斛促進(jìn)毛囊活化與自噬途徑的相關(guān)性,本實(shí)驗(yàn)檢測自噬相關(guān)基因的蛋白和mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,與對照組相比,霍山石斛組的LC3Ⅱ蛋白(P<0.05)和mRNA(P<0.05)的表達(dá)水平顯著升高,而p62的表達(dá)未發(fā)生明顯改變。結(jié)果表明,霍山石斛通過促進(jìn)LC3Ⅱ的表達(dá)誘導(dǎo)自噬,進(jìn)而促進(jìn)毛囊活化,發(fā)揮調(diào)控毛發(fā)生長的作用。

圖5 自噬相關(guān)基因的蛋白和mRNA的表達(dá)水平

3.6 霍山石斛通過TGF-β1促進(jìn)毛發(fā)生長情況

TGF-β1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化,通過抑制TGF-β1可以促進(jìn)毛囊生長,已有研究表明,中藥及其有效成分中常有TGF-β1抑制劑[10]。為探究TGF-β1是否參與到霍山石斛促進(jìn)毛發(fā)生長的過程中,本實(shí)驗(yàn)檢測小鼠背部皮膚組織中TGF-β1的表達(dá)水平,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,與對照組相比,霍山石斛組的TGF-β1的蛋白(P<0.05)和mRNA(P<0.05)表達(dá)水平均顯著降低。結(jié)果表明,霍山石斛可以通過抑制TGF-β1的表達(dá)來促進(jìn)生發(fā)。

圖6 小鼠背部皮膚組織中TGF-β1的表達(dá)水平

4 討 論

脫發(fā)是一種常見的皮膚病,與自身免疫機(jī)制、遺傳以及內(nèi)分泌等因素有關(guān),可能與一種或幾種細(xì)胞因子的缺失或者過表達(dá)相關(guān),但是具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確[11-12]。目前臨床常用米諾地爾和非那雄胺治療脫發(fā),但其治療伴隨著許多不良反應(yīng)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),中草藥副作用小、靶點(diǎn)多,對于脫發(fā)有一定的治療效果;例如,中草藥驅(qū)蟲斑鳩菊醇提取物能夠抵消壓力,從而促進(jìn)毛發(fā)生長,魚腥草、紫蘇和綠茶的中藥復(fù)合物可以體調(diào)節(jié)IGF1和TGF-β1來刺激毛發(fā)生長。這些都表明中草藥可以作為研究治療脫發(fā)的新方向[13-14]。

自噬在健康與疾病中起著重要的作用,如適應(yīng)氧化應(yīng)激、細(xì)胞分化和衰老等。LC3Ⅱ作為經(jīng)典的自噬標(biāo)志物,通常在自噬過程中明顯上升,用于表明自噬激活。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)自噬在維持自發(fā)生長階段的毛發(fā)生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并且激活自噬可以誘導(dǎo)毛囊活化,促進(jìn)毛發(fā)的生長[9]。本文結(jié)果顯示,霍山石斛能夠促進(jìn)LC3Ⅱ的表達(dá),表明霍山石斛能夠通過自噬通路促進(jìn)毛囊的活化,進(jìn)而促進(jìn)生發(fā)作用。

本研究結(jié)果表明,與對照組相比,用霍山石斛處理的小鼠背部皮膚的毛發(fā)生長更為明顯,毛囊數(shù)目更多,毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)更為完整,并且用霍山石斛處理的小鼠背部皮膚組織的自噬激活的LC3Ⅱ和Bcl-2的蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著上升,細(xì)胞生長分化相關(guān)基因TGF-β1的蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著下降,表明霍山石斛能夠促進(jìn)毛發(fā)生長。

綜上所述,霍山石斛夠通過改善毛囊形態(tài)與結(jié)構(gòu)、促進(jìn)自噬與抑制凋亡發(fā)揮促進(jìn)毛發(fā)生長的作用,為脫發(fā)藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。