杜云鶴

637000 四川省南充市順慶區(qū)疾控中心，四川南充

急性胃腸炎聚集性疫情易發(fā)生在學(xué)校、托幼機(jī)構(gòu)、工廠及工地等人群聚集場(chǎng)所，起病急、傳染性強(qiáng)、覆蓋面廣，導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。由于其致病病原體眾多，有細(xì)菌、病毒及寄生蟲等，而臨床表現(xiàn)、常規(guī)檢查及流行病學(xué)調(diào)查情況相似，給疫情的研判帶來(lái)阻礙[1-2]。在一線醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，特別是基層疾控中心，參與調(diào)查處置相關(guān)疫情的工作較多，因此，需要盡快建立一種快速簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，為疾病預(yù)防控制工作提供實(shí)驗(yàn)室技術(shù)支持。造成急性胃腸炎疫情暴發(fā)的主要因素是諾如病毒(NV)，NV 是引起人類急性非細(xì)菌性胃腸炎的重要病原體之一。NV 感染性腹瀉患者、隱性感染者及病原攜帶者均可作為本病的傳染源，急性胃腸炎潛伏期最短12 h，平均24～48 h，可以通過(guò)食物、水、生活接觸或吸入懸浮在空氣張的氣溶膠傳播，傳播速度極快，極易在短時(shí)間內(nèi)造成大規(guī)模爆發(fā)流行。本次探討應(yīng)用三重實(shí)時(shí)熒光PCR 法，對(duì)373 份人員及環(huán)境標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行GⅠ型、GⅡ型NV和A組輪狀病毒感染情況檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

采集2020年11月某地一起學(xué)校急性胃腸炎聚集性疫情的疑似病例、臨床診斷病例及密切接觸者肛拭子、糞便及嘔吐物標(biāo)本258 份，學(xué)校食堂餐具、教室、寢室及衛(wèi)生間等環(huán)境物表拭子標(biāo)本115份。

方法：肛拭子標(biāo)本采用肛拭法采集，將專用采樣拭子用生理鹽水潤(rùn)濕后，插入肛門2～3 cm，輕輕旋轉(zhuǎn)擦取直腸表面，需注意肛拭子上應(yīng)有可見的糞便；糞便或嘔吐物標(biāo)本每份取＞5 g 或5 mL，直接放入無(wú)菌干燥容器內(nèi)；環(huán)境物表拭子采用涂抹法采集，用無(wú)菌拭子在病毒保存液里蘸濕，用力反復(fù)涂抹待采表面(最大面積100 cm2)，所采標(biāo)本均低溫保存盡快送至實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本處理：肛拭子、糞便、嘔吐物及環(huán)境物表標(biāo)本分別用旋渦振蕩器混勻后直接取200 μL 混懸液參與提取。核酸提取使用杭州博日NPA-32P 核酸提取純化儀及配套的病毒DNA/RNA 磁珠法提取試劑盒(BSC57M1B)。將室溫放置96 孔試劑板顛倒3 次，去除塑封膜后在96孔板離心機(jī)中短暫離心，避免掛液。撕去96 孔試劑板上的鋁箔膜，確認(rèn)板子方向(磁珠在第6/12 列)。在第1 列及第7 列中加入200 μL 樣品，避免交叉污染。將96 孔板放入核酸提取純化儀中，裝上磁棒護(hù)套，按裂解-吸磁珠-結(jié)合-洗滌3 次-洗脫-棄磁珠的程序進(jìn)行自動(dòng)化提取實(shí)驗(yàn)。RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件：檢測(cè)試劑使用北京卓誠(chéng)惠生的A組輪狀病毒/諾如病毒GⅠ/諾如病毒GⅡ/三重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書配制擴(kuò)增體系。1個(gè)反應(yīng)體系含無(wú)核酸酶水2 μL、2×核酸擴(kuò)增反應(yīng)液10 μL、20×反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、10×引物探針?lè)磻?yīng)液2 μL，將上述反應(yīng)液混勻離心后，按照每管15 μL 分裝于PCR 管中，最后加入提取的5 μL 的RNA 樣品，構(gòu)成20 μL的總反應(yīng)體系。陽(yáng)性對(duì)照體系加入相應(yīng)模板5 μL。PCR循環(huán)條件設(shè)置為45℃，20 min，1個(gè)循環(huán)；95℃，5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃，15 s，55℃，45 s，45 個(gè)循環(huán)。在55℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告集團(tuán)分別設(shè)置為FAM、VIC及CY5，分別對(duì)應(yīng)A組輪狀病毒、GⅡ型諾如病毒及GⅠ型諾如病毒的核酸檢測(cè)。

結(jié)果判定與質(zhì)控：檢測(cè)儀器為Roche 羅氏Light Cycler 480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀。閾值設(shè)定原則為以剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照的熒光信號(hào)最高點(diǎn)為閾值線?？瞻讓?duì)照和陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線，且陽(yáng)性對(duì)照在三個(gè)檢測(cè)通道均有S型擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)成立，否則判為實(shí)驗(yàn)無(wú)效。若標(biāo)本有S 型擴(kuò)增且Ct 值≤35，根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)對(duì)應(yīng)的熒光通道進(jìn)行判定。若有S型擴(kuò)增，且Ct 值35～40，判定為不確定標(biāo)本，需重新提取核酸后進(jìn)行檢測(cè)；若復(fù)檢的標(biāo)本有S型擴(kuò)增，且Ct值＜40，根據(jù)相應(yīng)熒光通道檢測(cè)的目標(biāo)病毒進(jìn)行判定，否則判定為陰性。若標(biāo)本無(wú)明顯S型擴(kuò)增曲線，但報(bào)告有Ct值，判定為陰性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析系統(tǒng)展開數(shù)據(jù)處理；計(jì)數(shù)資料用[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

檢出病毒核酸分布情況：在檢測(cè)的373 份標(biāo)本中，共檢出NV 陽(yáng)性標(biāo)本144 份，分別是肛拭子、糞便及嘔吐物陽(yáng)性標(biāo)本共131份，環(huán)境物表拭子陽(yáng)性標(biāo)本13份，檢出率為38.61%；檢出A 組輪狀病毒2份，均為人員標(biāo)本，檢出率0.54%；檢出NV 和A 組輪狀病毒混合感染檢出6 份，檢出率1.61%，均為人員標(biāo)本，其中A組輪狀病毒和NV(基因組GⅠ/GⅡ)1份，A組輪狀病毒和GⅠ型NV 為2 份，A 組輪狀病毒和GⅡ型NV 為3份。144份NV 陽(yáng)性標(biāo)本中，檢出GⅡ型NV為111 份，構(gòu)成比77.08%，GI 型NV 為22 份，構(gòu)成比15.28%；檢出NV(基因組GⅠ/GⅡ)11 份，構(gòu)成比7.64%。檢測(cè)結(jié)果顯示，A 組輪狀病毒、NV 的S 型擴(kuò)增曲線典型，陽(yáng)性對(duì)照在三個(gè)通道均有S 型擴(kuò)增曲線，空白和陰性對(duì)照沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生，表明本試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確有效。

NV 感染者性別分布情況：不同性別間NV 感染陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 NV感染者性別分布情況[n(%)]

NV 感染者職業(yè)分布情況：不同職業(yè)間NV 感染陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 NV感染者職業(yè)分布情況[n(%)]

不同年齡組NV 陽(yáng)性率比較：＞45 歲組人群諾如病毒感染陽(yáng)性率最高，26～35歲組陽(yáng)性率最低，不同年齡組人群陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同年齡組NV陽(yáng)性率比較[n(%)]

討 論

全球急性胃腸炎的散發(fā)病例和暴發(fā)疫情的主要致病原是NV，該病毒由于感染劑量低、抵抗力強(qiáng)、傳播速度快，極易造成大規(guī)模群體感染事件，NV 不僅可引起成人、兒童胃腸炎散發(fā)病例，還常在醫(yī)院、養(yǎng)老院、學(xué)校及托幼機(jī)構(gòu)等場(chǎng)所引起暴發(fā)。NV 傳播途徑包括人傳人、經(jīng)食物和經(jīng)水傳播。人傳人可通過(guò)糞口途徑(包括攝入糞便或嘔吐物產(chǎn)生的氣溶膠)或間接接觸被排泄物污染的環(huán)境而傳播。食源性傳播是通過(guò)食用被NV 污染的食物進(jìn)行傳播，污染環(huán)節(jié)可出現(xiàn)在感染NV 的餐飲從業(yè)人員在備餐和供餐中污染食物，也可出現(xiàn)食物在生產(chǎn)、運(yùn)輸和分發(fā)過(guò)程中被含有NV的人類排泄物或其他物質(zhì)所污染，例如食物暴露引起的點(diǎn)源暴發(fā)常會(huì)導(dǎo)致在一個(gè)機(jī)構(gòu)或社區(qū)內(nèi)出現(xiàn)續(xù)發(fā)的人與人之間傳播。2013年以來(lái)我國(guó)NV 感染導(dǎo)致的暴發(fā)疫情大幅增加，主要發(fā)生在學(xué)校、托幼機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)等人群聚集場(chǎng)所[3]。本探討的聚集性疫情發(fā)生在學(xué)校，通過(guò)檢測(cè)各類標(biāo)本373份，檢出人員標(biāo)本NV 陽(yáng)性131 份，檢出率35.12%，高于部分地區(qū)的檢出率[4-5]；檢出人員標(biāo)本A 組輪狀病毒陽(yáng)性2 份，A 組輪狀病毒檢出率為0.54%，明顯低于NV 檢出率；檢出A 組輪狀病毒和NV 均為陽(yáng)性標(biāo)本6 份，檢出率為1.61%。我國(guó)國(guó)內(nèi)多地監(jiān)測(cè)結(jié)果也顯示，GⅡ型是NV感染的主要基因型。麗水、寧波、沈陽(yáng)通過(guò)對(duì)NV腹瀉病例分析，G Ⅱ型的檢出率分別為92.12%、93.4%、86.96%，本次探討的疫情中仍以G Ⅱ型(77.08%)感染為主，GⅠ型占15.28%，與上述地區(qū)監(jiān)測(cè)結(jié)果一致[6]。該疫情中NV 感染病例性別分布比較，男性陽(yáng)性率51.55%，女性陽(yáng)性率50.31%，不同性別感染陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果一致[7]。也有較多文獻(xiàn)支持NV 感染的不同年齡比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。經(jīng)過(guò)對(duì)本起疫情的流行病學(xué)調(diào)查，分析傳染源為該學(xué)校食堂的一名54 歲從業(yè)人員，＞45 歲組人群主要是學(xué)校食堂及其他后勤部門工作人員，與他有密切接觸，因此，陽(yáng)性率最高；16～25 歲組人群以住校學(xué)生為主，多在該食堂就餐，造成陽(yáng)性率也較高；26～35 歲組人群多為年輕的教職工，該組人群在外面餐館就餐或點(diǎn)外賣人數(shù)較多，在學(xué)校食堂進(jìn)餐人數(shù)與次數(shù)均較少，因此，被傳染的機(jī)會(huì)降低，陽(yáng)性率在各年齡組中最低。

該探討采用三重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法，運(yùn)用熒光標(biāo)志物和自動(dòng)化儀器，依據(jù)每一個(gè)反應(yīng)體系均含有輪狀病毒、GⅠ型、GⅡ型NV基因保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物和探針，在同一反應(yīng)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)三種病毒的同時(shí)檢測(cè)和分型，并在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí)間和流程，提高了檢測(cè)效率。

綜上所述，NV 可能是導(dǎo)致本次疫情的主要病原體，同時(shí)存在NV 和A 組輪狀病毒混合感染的情況，三重實(shí)時(shí)熒光PCR 法同時(shí)檢測(cè)多種病毒為疫情快速處置提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。