馬麗，卜勝君，張文廣，萬家余，陳志寶

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所；3.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院）

大腸桿菌（E.coli）是食源性疾病相關(guān)的主要食源性致病菌之一。屬于革蘭氏陰性菌，桿狀、無芽孢、兼性厭氧[1]。大腸桿菌的菌株多數(shù)是無害的，但一些血清型（如：大腸桿菌O157）可引起宿主的嚴(yán)重性血性腹瀉、溶血性尿毒癥、低血小板癥等疾病[2-5]。世界上大約有近十分之一的人因食用受污染的食物而患病，每年導(dǎo)致42 萬人死亡[6]。能夠?qū)ζ溥M(jìn)行早期臨床診斷，可以有效減少其帶來的危害。目前對(duì)病原菌的檢測(cè)方法有傳統(tǒng)方法及現(xiàn)代檢測(cè)方法。通過微生物學(xué)方法檢測(cè)細(xì)菌的傳統(tǒng)方法[7]，包括預(yù)富集、選擇性富集、生化篩選，血清學(xué)確認(rèn)和毒素檢測(cè)耗時(shí)（結(jié)果和確認(rèn)需要2～6 d），費(fèi)力，結(jié)果不清晰[8-10]。平板培養(yǎng)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是目前常用的大腸桿菌O157 的檢測(cè)方法[11-12]。要求嚴(yán)格的操作程序且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，特定的檢測(cè)儀器，耗時(shí)長(zhǎng)，特異性差[12-14]等檢測(cè)問題的存在。所以開發(fā)和建立快速、選擇性、敏感、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、易于使用的檢測(cè)方法具有非常重大的意義。

近年，生物傳感器已經(jīng)成為一種現(xiàn)代的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法具有檢測(cè)限低，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜，提供實(shí)時(shí)測(cè)量，多目標(biāo)測(cè)試，可攜帶性，小型化和快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。已開發(fā)的傳感器有電化學(xué)生物傳感器[15-16]、比色生物傳感器[17-18]等。在不同類型的傳感器中，比色生物傳感器由于其簡(jiǎn)單性和敏感性及肉眼可識(shí)別性。用于病原微生物以及小分子疾病標(biāo)記物的快速檢測(cè)[19]。 2006 年由Qian 等[20]首次提出一種為金-鉑雙金屬納米球狀結(jié)構(gòu)，形狀似花的納米結(jié)構(gòu)。其大小通常在幾百納米到幾微米不等。研究發(fā)現(xiàn)，通過將其包裹不同成分及不同的標(biāo)記物，以達(dá)到檢測(cè)不同靶標(biāo)的目的。常見為磷酸銅或硫酸鈣蛋白納米花[21-22]。由于其非常高的比表面積，納米花的信號(hào)放大作用極大，被用在生物檢測(cè)領(lǐng)域中[23]。

基于此開發(fā)一種有機(jī)無機(jī)雜化納米材料比色生物傳感器，通過比色傳感器肉眼可見的顯色方法對(duì)大腸桿菌O157 進(jìn)行檢測(cè)，該納米花通過“一鍋法”在常溫下合成、無需有機(jī)溶劑，與其他雜化納米傳感器材料[24-25]相比，無需變溫及復(fù)雜儀器等特殊條件。該納米花傳感器使用可以特異性識(shí)別大腸桿菌O157的抗體及可與細(xì)菌表面碳水化合物特異性反應(yīng)的伴刀豆蛋白（Con A）作為生物傳感器的識(shí)別元件。納米花中的GOx 作為信號(hào)輸出元件，催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸及過氧化氫（H2O2），通過過氧化氫試紙條顯色的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)。該檢測(cè)方法不需特殊儀器，通過“一步法”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避免了復(fù)雜的檢測(cè)步驟，大大縮短了試驗(yàn)時(shí)間，為在食品安全、臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域提供病原菌檢測(cè)的新的參考策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

研究所應(yīng)用到的食源性致病菌菌株，包括大腸桿菌O157（CICC 21530），大腸桿菌（CICC 10389），鼠傷寒沙門氏菌（CCICC 21482），金黃色葡萄球菌（CICC 21600）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（CICC 21529），副溶血性弧菌（CICC 21617）均由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供，由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所長(zhǎng)期保存。磁珠-大腸桿菌O157 抗體購自美國賽默飛世爾有限公司，過氧化氫試紙條購自于德國默克有限公司，伴刀豆蛋白A（Con A）及葡萄糖氧化酶（GOx）購自于上海西格瑪貿(mào)易有限公司，β-D-葡萄糖購自于上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 試劑

洗滌緩沖液1 mM PBS（1 mmol·L-1磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、1 mmol·L-1磷酸氫二鈉（Na2HPO4））。pH值使用氫氧化鈉（NaOH）及鹽酸（HCl）進(jìn)行調(diào)節(jié)，用0.22 μm 濾膜過濾溶液，保存于4 ℃冰箱待用。所用金屬鹽類化學(xué)試劑均購自北京化工廠，純度均為分析純。試驗(yàn)用水由長(zhǎng)春市萊博帕特科技發(fā)展有限公司（型號(hào)：LAB-DI-10）純水儀處理的超純水。

1.1.3 儀器

常溫高速離心機(jī)（型號(hào)：D3024）購自于無錫德凡儀器有限公司，OPPO Reno 5 Pro 智能手機(jī)購自于OPPO 廣東移動(dòng)通訊有限公司，生化培養(yǎng)箱（型號(hào)：HPS-250 購自于哈爾濱東明科技有限公司。核酸蛋白分析儀（型號(hào)：SmartSpec Plus）購自于美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 原理

研究采用簡(jiǎn)單的“一鍋法”室溫條件下將伴刀豆球蛋白A（Con A）、葡萄糖氧化酶（GOx）及Ca2+離子在PBS 溶液混合，合成了Con A-葡萄糖氧化酶-Ca2（PO4）3納米花（CGC）。Ca2+作為無機(jī)骨架可以固定Con A 和氧化酶，并且Ca2+離子與氧化酶共存產(chǎn)生協(xié)同增效作用，可以增強(qiáng)氧化酶催化活性這得益于Ca2+離子輔助的α-淀粉酶的變構(gòu)效應(yīng)[26]。Con A 對(duì)大腸桿菌表面O-抗原具有很高的結(jié)合親和力。葡萄糖氧化酶作為信號(hào)放大元件，可以將β-D-葡萄糖催化為葡萄糖酸及H2O2。將含有大腸桿菌O157 特異性抗體的磁珠、大腸桿菌O157 及納米花（CGC）采用“一步法”形成“抗體-靶標(biāo)-納米花”三明治夾心結(jié)構(gòu)。在存在靶標(biāo)時(shí)，加入β-D-葡萄糖后GOx 可以將H2O2試紙條氧化成藍(lán)色，用智能手機(jī)記錄信號(hào)，ImageJ 軟件結(jié)果分析；反之當(dāng)沒有靶標(biāo)時(shí)，無夾心結(jié)構(gòu)，GOx 無法將β-D-葡萄糖氧化，H2O2試紙條無顏色變化。因此，通過建立大腸桿菌O157 與H2O2試紙條顏色變化的相關(guān)性，對(duì)大腸桿菌O157 的濃度進(jìn)行靈敏性分析。原理圖如圖1 所示。

圖1 原理圖Fig.1 Schematic diagram

1.2.2 Con A-葡萄糖氧化酶-Ca2（PO4）3納米花（CGC）的合成

（1）在1.5 mL PCR 管中依次加入780 μL 10 mM PBS 緩沖溶液、0.1 mg Con A、0.1 mg 葡萄糖氧化酶（GOx）及20 μL 200 mM 氯化鈣（CaCl2）溶液，立即振蕩混勻，并靜置于室溫下16 h，產(chǎn)生白色絮狀沉淀物。

（2）將步驟（1）中的混合溶液在25 ℃，10 000 rpm，離心5 min 后，去除上清液，加入1 mL 1 mM PBS 緩沖溶液洗滌、離心兩次。最后，加入100 μL 1 mM PBS 緩沖液制成Con A-葡萄糖氧化酶-Ca2（PO4）3納米花懸浮液，保存于4 ℃冰箱里，待用。

1.2.3 具體試驗(yàn)步驟

（1）大腸桿菌O157 抗體磁珠預(yù)處理：試驗(yàn)前將抗體磁珠用等體積1 mM PBS 緩沖溶液洗滌三次，用等體積緩沖溶液懸浮備用。

（2）將3 μL 磁珠、50 μL 大腸桿菌O157 及6 μL納米花（CGC）加入200 μL PCR 管中，37 ℃下孵育50 min，形成“抗體-靶標(biāo)-納米花”結(jié)合的“夾心結(jié)構(gòu)”復(fù)合物。用50 μL 1 mM PBS 緩沖溶液洗滌三次，備用。

（3）將10 μL 40 mM β-D-葡萄糖加入到步驟（2）復(fù)合物中，移液槍混勻后，用磁珠分離器將磁珠吸附，吸取上清溶液滴加在H2O2試紙條上，反應(yīng)30 s后立即用智能手機(jī)拍攝信號(hào)，用ImageJ 軟件結(jié)果分析。

1.2.4 試驗(yàn)條件優(yōu)化

首先，試驗(yàn)中“抗體-靶標(biāo)-納米花”的孵育時(shí)間直接影響著“夾心結(jié)構(gòu)”復(fù)合物中葡萄糖氧化酶的量，所以優(yōu)先對(duì)孵育時(shí)間進(jìn)行對(duì)優(yōu)化；其次，“夾心結(jié)構(gòu)”復(fù)合物的孵育溫度及洗滌緩沖溶液的pH 值對(duì)復(fù)合物體系中三者結(jié)合的效率有很大影響，所以對(duì)孵育溫度及洗滌緩沖溶液的pH 值進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化；最后，β-D-葡萄糖的量影響復(fù)合物中葡萄糖氧化酶將其催化為葡萄糖酸的量，對(duì)試紙條的顯色信號(hào)具有影響作用，所以對(duì)β-D-葡萄糖的加入量進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)條件優(yōu)化步驟按照1.2.3 具體試驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)葡萄糖誘導(dǎo)H2O2試紙條的比色強(qiáng)度%，優(yōu)化條件選擇比色強(qiáng)度%最大時(shí)為最佳條件，計(jì)算如下：比色強(qiáng)度%=[（In陽性-In陰性）/In陽性]×100%，選擇結(jié)果數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.5 靈敏度分析

在所優(yōu)化的最佳試驗(yàn)條件下，進(jìn)行研究的靈敏度分析，用核酸蛋白分析儀計(jì)算菌液濃度，以梯度稀釋法依次稀釋到10、102、103、104、105、106、107CFU·mL-1，待用。對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度進(jìn)行分析，確定線性方程及檢測(cè)范圍，檢出靶標(biāo)最低檢測(cè)限。結(jié)果數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.6 特異性分析

分別使用107CFU·mL-1的大腸桿菌O157、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌及副溶血性弧菌，進(jìn)行基于形成“抗體-靶標(biāo)-納米花”結(jié)合的“夾心結(jié)構(gòu)”復(fù)合物，以探究檢測(cè)方法的特異性。結(jié)果數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

在脫脂奶粉中加入大腸桿菌O157 以分別達(dá)到104、105、106CFU·mL-1。對(duì)牛奶樣品進(jìn)行形成“抗體-靶標(biāo)-納米花”結(jié)合的“夾心結(jié)構(gòu)”復(fù)合物，以探究檢測(cè)方法的回收率。結(jié)果數(shù)據(jù)均進(jìn)行3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件優(yōu)化

為探究最佳試驗(yàn)條件，分別對(duì)孵育時(shí)間、孵育溫度、洗滌緩沖液pH 值以及β-D-葡萄糖進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如下：

2.1.1 “抗體-靶標(biāo)-納米花”孵育時(shí)間優(yōu)化

在孵育時(shí)間分別為20、30、40、50 及60 min 情況下，按照具體實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，分析如圖2 可以得出隨著孵育時(shí)間的增加H2O2試紙條的比色強(qiáng)度%也隨之增加，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到50 min 時(shí)比色強(qiáng)度%達(dá)到最大值且趨于穩(wěn)定。所以選擇50 min 作為最佳孵育時(shí)間。

圖2 孵育時(shí)間的優(yōu)化Fig.2 Optimization of incubation time

2.1.2 “抗體-靶標(biāo)-納米花”孵育溫度優(yōu)化

選擇4、25、37 及55 ℃進(jìn)行優(yōu)化，分析如圖3 可以得出隨著孵育時(shí)間溫度的增加H2O2試紙條的比色強(qiáng)度%先增加后減小，當(dāng)孵育溫度達(dá)到37 ℃時(shí)比色強(qiáng)度%達(dá)到最大值，從結(jié)果可以看出孵育溫度過高（過低）都會(huì)影響抗體、靶標(biāo)和納米花三者的結(jié)合效率，對(duì)比色強(qiáng)度%有影響。所以選擇37 ℃作為最佳孵育溫度。

圖3 孵育溫度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of incubation temperature

2.1.3 洗滌緩沖溶液的pH 值優(yōu)化

選擇pH 值為4.5、5.5、6.5、7.5 及8.5，按照具體實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，分析如圖4 可以得出隨著洗滌緩沖溶液的pH 值的增加H2O2試紙條的比色強(qiáng)度%先增加后減小，當(dāng)洗滌緩沖溶液的pH 值達(dá)到7.5 時(shí)比色強(qiáng)度%為最大值，從結(jié)果可以看出洗滌緩沖溶液pH 值過高（過低）都會(huì)影響“夾心結(jié)構(gòu)”復(fù)合物的結(jié)合效率，對(duì)比色強(qiáng)度%有影響。選擇最佳洗滌緩沖溶液的pH 值為7.5。

圖4 洗滌緩沖溶液pH 的優(yōu)化Fig.4 Optimization of the pH of the washing buffer solution

2.1.4 β-D-葡萄糖加入量?jī)?yōu)化

選擇10、20、30、40、50 及60 mM 的β-D-葡萄糖，按照具體步驟進(jìn)行優(yōu)化。分析如圖5 可以得出隨著β-D-葡萄糖加入量的增加H2O2試紙條的比色強(qiáng)度%也隨之增加，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到40 mM 時(shí)比色強(qiáng)度%達(dá)到最大值且趨于穩(wěn)定。所以選擇40 mM 作為最佳β-D-葡萄糖加入量。

圖5 β-D-葡萄糖用量?jī)?yōu)化Fig.5 β-D-glucose optimization

2.2 靈敏度分析

基于最佳反應(yīng)時(shí)間為50 min、孵育溫度為37 ℃、洗滌緩沖溶液pH 為7.5 的條件下用于定量檢測(cè)大腸桿菌O157 的濃度。如圖6-A 所示，隨著加入濃度梯度的增加，H2O2試紙條顏色逐漸加深。H2O2試紙條的比色強(qiáng)度%隨大腸桿菌O157 濃度的增加而增加（圖6-B），且在10～106CFU·mL-1具有良好的線性關(guān)系（圖6-C），線性方程為Y=11.22 X+20.69（其中Y代表比色強(qiáng)度%，X 代表大腸桿菌O157 的濃度），相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)0.987 8。

圖6 （A）H2O2 試紙條靈敏度顯色；（B）大腸桿菌O157 濃度從10～107 CFU·mL-1 與比色強(qiáng)度%；（C）大腸桿菌O157 與比色強(qiáng)度%的線性關(guān)系分析圖Fig.6 （A）Sensitivity color development of H2O2 test strip；（B）E.coli O157 concentration from 10～107 CFU·mL-1 and colorimetric intensity%；（C）Linear relationship between E.coli O157 and colorimetric intensity%

2.3 特異性分析

方法選擇與靶標(biāo)菌同是革蘭氏陰性菌的大腸桿菌（E.coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Sal.t）和副溶血性弧菌（Vibiro.p）及革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌（S.aur）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（List.m）作為對(duì)照菌進(jìn)行特異性分析，對(duì)照菌均為常見的食源性病原菌，常與靶標(biāo)菌共存于受污染的食品中。其中從圖7 中可以看出，對(duì)照菌株E.coli、鼠傷Sal.t、S.aur 和List.m 及Vibiro.p 顯示的H2O2試紙條的比色強(qiáng)度%平均低于20%，低于靶標(biāo)菌最低檢測(cè)限的比色強(qiáng)度%。而靶標(biāo)大腸桿菌O157 的H2O2試紙條的比色強(qiáng)度%非常高，從這些數(shù)據(jù)可以看出，研究策略對(duì)病原性大腸桿菌O157 具有良好的特異性。

圖7 本方法特異性Fig.7 Specificity of this method

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

評(píng)估該檢測(cè)方法在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用效果，使用脫脂奶粉樣品進(jìn)行了回收實(shí)驗(yàn)，樣品添加了密度為104、105和106CFU·mL-1的大腸桿菌O157。方法的回收率從93±0.71%到102±1.31%（表1）。根據(jù)我國GBT 27404-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)附錄中對(duì)加標(biāo)樣品回收率規(guī)定加表樣品回收率范圍在80%～110%之間[27]，回收結(jié)果表明該檢測(cè)方法可為初步的實(shí)際應(yīng)用提供可行和可靠的病原細(xì)菌測(cè)量。

表1 脫脂奶粉樣品中大腸桿菌O157 的檢測(cè)Table 1 Detection of E.coli O157 in skimmed milk powder samples

2.5 試驗(yàn)方法對(duì)比

為了評(píng)估該方法的性能，查閱相關(guān)文獻(xiàn)檢測(cè)方法，與此試驗(yàn)進(jìn)行性能對(duì)比（表2），發(fā)現(xiàn)與其他檢測(cè)方法相比，此方法具有檢測(cè)線性范圍廣、靈敏度高、操作步驟簡(jiǎn)單且無需大型昂貴實(shí)驗(yàn)儀器。

表2 不同的大腸桿菌O157∶H7 檢測(cè)方法的性能比較Table 2 Performance comparison of different E.coli O157∶H7 detection methods

3 討論

食源性致病菌污染給人類健康和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，急需靈敏而有效的檢測(cè)方法對(duì)早期診斷病原細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法操作繁瑣、耗時(shí)久、結(jié)果不明確。因此，需要開發(fā)低成本、方便、快速和靈敏的檢測(cè)方法。研究方法成功建立了一種Con A-葡萄糖氧化酶-Ca2（PO4）3納米花（CGC）并將其運(yùn)用于大腸桿菌O157 的檢測(cè)；在實(shí)際樣品檢測(cè)中獲得了良好的靈敏性能。與王月等[32]以病原菌DNA為模板，通過PCR 技術(shù)和DNA 酶的介導(dǎo)的核酸橫流生物傳感器對(duì)病原菌檢測(cè)方法將比，此方法不需要對(duì)病原菌的核酸進(jìn)行提取，使步驟更加簡(jiǎn)便，避免核酸提取中的污染。但此方法作為商業(yè)化策略或用于實(shí)際檢測(cè)中還有一定局限性。首先，對(duì)于合成納米復(fù)合材料的穩(wěn)定性、存儲(chǔ)條件需要進(jìn)一步研究；其次，需要對(duì)此檢測(cè)方法的穩(wěn)定性及靈敏度進(jìn)一步優(yōu)化，使此方法在更多實(shí)際樣品檢測(cè)中仍具有準(zhǔn)確行；最后，需要將檢測(cè)方法與國際檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)一步比較。為臨床診斷因病原致病菌導(dǎo)致疾病的常規(guī)診斷、快速檢測(cè)方法提供很大的潛能。

4 結(jié)論

檢測(cè)方法通過“一鍋法”合成了Con A-葡萄糖氧化酶-Ca2（PO4）3納米花（CGC），將其作為大腸桿菌O157 的識(shí)別生物分子，用“一步法”將使抗體-靶標(biāo)-納米花三者形成三明治夾心結(jié)構(gòu)，用于檢測(cè)大腸桿菌O157。Con A 作為識(shí)別元件與大腸桿菌O157 細(xì)胞膜識(shí)別結(jié)合；納米花中的葡萄糖氧化酶由于Ca2+離子的作用具有增強(qiáng)的活性和穩(wěn)定性，催化β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸及H2O2，H2O2試紙條比色度變化強(qiáng)度作為信號(hào)輸出端。結(jié)果表明，基于CGC 對(duì)大腸桿菌O157 的夾心測(cè)定法實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)菌10 CFU·mL-1的靈敏度。檢測(cè)范圍在10～106CFU·mL-1有良好線性關(guān)系?；厥章试?3%～102% 之間，符合國家回收率標(biāo)準(zhǔn)。表明此檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確性，且在其他病原菌或臨床診斷的檢測(cè)中具有巨大應(yīng)用潛力。