熊翱，熊仁平，彭艷，黃治中，陳惺，江旭，曹福洋，許建中

原代細胞培養(yǎng)技術(shù)是廣泛應(yīng)用于疾病體外研究的重要方法之一[1,2]，對原代培養(yǎng)的細胞進行分子生物學(xué)研究，可以排除其他細胞干擾，提高生物信息的準確性和特異性，進一步保證研究結(jié)論的可靠性。但原代細胞培養(yǎng)成功率低，有時純度達標困難。解決了純度問題，又會出現(xiàn)可用于實驗研究材料的原代細胞的代數(shù)不多，僅2～3代可用[3,4]，傳至4代以后的細胞就老化的問題，不能保持原代細胞原有的特征和功能。

采用傳代的原代細胞培養(yǎng)進行體外分子生物學(xué)研究，必須保證傳代細胞具有原有細胞的生物學(xué)行為；確保原代培養(yǎng)體系的細胞健康狀況良好；確保傳代細胞的任一組分功能與原有細胞都無差異。原代細胞的分子生物學(xué)研究中，核酸（RNA、DNA）和蛋白質(zhì)一直是其研究的主要內(nèi)容。以往國內(nèi)研究人員從原代培養(yǎng)細胞中提取RNA和蛋白質(zhì)，都是參考國內(nèi)外文獻[5-7]，分別從原代培養(yǎng)細胞中提取。這樣提取RNA和蛋白質(zhì)費時費力，更突出的缺點是浪費資源（需兩份培養(yǎng)細胞）、花費更多的經(jīng)費（試劑重復(fù)使用）、操作繁鎖（易受外界RNA酶污染）、延長研究周期[8-10]。這就使原代培養(yǎng)細胞實驗研究工作的進展慢，不利于研究工作的順利開展。因此，如何對培養(yǎng)的可用于實驗研究的原代細胞做到物盡其用，從而節(jié)約經(jīng)費、降低勞動成本、縮短研究周期是亟待解決的問題。

本研究為了最大限度地發(fā)揮原代細胞的作用，在成功培養(yǎng)Sprague-Dawley（SD）大鼠原代滑膜細胞的基礎(chǔ)上，探討從原代培養(yǎng)的具有滑膜主要功能細胞之稱的成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）[11,12]中同時提取微量總RNA 和蛋白質(zhì)。同時運用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和免疫印跡（Western blot）方法檢測滑膜原代FLS 的特征因子白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的mRNA 和蛋白質(zhì)表達情況，同時與傳統(tǒng)的分別提取微量總RNA和蛋白質(zhì)的IL-1β 和TNF-α 的基因和蛋白質(zhì)表達情況進行比較，探討同時從一份原代培養(yǎng)細胞中提取微量總RNA和蛋白質(zhì)的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

兩月齡SPF 級雄性SD 大鼠，200～240 g，購于陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心［SCXK（軍）2017-0026］，飼養(yǎng)于陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心［SYXK（軍）2017-0058］。動物實驗操作嚴格按照陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物倫理學(xué)要求執(zhí)行（審批號：AMUWEC20181430），同時嚴格按照實驗動物使用的3R（Reduction，減少；Refinement，優(yōu)化；Replacement，替代）原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉（進口分裝，德國），DMEM（high Glucose，BI，美國）,雙抗（GiBco，美國），Ⅰ型膠原酶（abcam，美國），0.25%胰酶（GiBco，美國），小鼠抗vimentin 單抗（abcam，中國香港），兔抗IL-1β 多抗（abcam，中國香港），兔抗TNF-α多抗（cell signaling，美國），2×PCR mix（Bimake，美國），2×master mix（Promega，美國），TRIzolTMReagent（invitrogen，美國）。CO2培養(yǎng)箱（Thermo，美國），T100TM梯度PCR 儀（BioRad，美國），CFX ConnectTMqPCR 儀（BioRad，美 國），ELX800 酶標儀（BioTek，美國），Western blot 實驗系統(tǒng)（BioRad，美國）。所有器皿和所配溶液均按細胞培養(yǎng)和提取總RNA要求準備。

1.3 滑膜組織的分離、滑膜細胞的原代培養(yǎng)及其純度與增殖鑒定

參照熊翱等[13]建立的方法完成。

1.4 總RNA和蛋白質(zhì)的提取

采用經(jīng)鑒定的FLS 純度在98%以上的第6 代原代細胞，調(diào)整細胞密度為4×104/ml。0.2 ml/孔接種至6 孔板，培養(yǎng)至細胞融合度達80%時，調(diào)整并計數(shù)細胞。轉(zhuǎn)移原代培養(yǎng)細胞懸液至1.5 ml離心管，使其細胞數(shù)為5×105?？傆嫓蕚?2 份原代培養(yǎng)的第6 代FLS。每次的平行樣品數(shù)均為4。

1.4.1 經(jīng)典法［酸性硫氰酸胍苯酚氯仿（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform,AGPC）］[14]提取總RNA試劑配制

檸檬酸鈉-月桂酰肌氨酸-β-巰基乙醇（citratesodium-sodium N-lauroyl sarcosinate-betamercaptoethanol,CSB）緩沖液（42 mmol/L 檸檬酸鈉，pH 4.0，8.3 g/L N-月桂酰肌氨酸和0.2 g/L β-巰基乙醇）；快速總RNA 提取試劑：用CSB 配制4 mol/L 異硫氰酸胍；加入0.15 體積4 mol/L乙酸鈉（pH 4.0）；加入等體積酸酚，混勻。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 SDS-裂解法提取總蛋白質(zhì)的試劑配制

預(yù)先配制10%（W/V）SDS 和0.5 mol/L Tris-HCl pH 8.0，室溫保存?zhèn)溆茫活A(yù)先配制1 mol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），-20℃保存?zhèn)溆?。提取總蛋白時，按以下配方現(xiàn)配SDS-裂解液：0.5%（W/V）SDS，0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1 mol/L DTT。

1.4.3 總RNA提取、質(zhì)量、純度鑒定和濃度測定

取8份原代培養(yǎng)FLS細胞，低速離心，棄培養(yǎng)基，用含二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate,DEPC)的PBS洗滌2次，然后隨機分成兩組，每組4份。第一組加入AGPC RNA 提取試劑0.5 ml；第二組加入Invitragen 公司的TRIzolTM試劑0.3 ml。冰浴下超聲破碎細胞5 s×2次，4℃，孵育5～10 min。之后，每管加入100 μl冰浴后的氯仿，震蕩15 s。4℃靜置10 min后，12 000×g，4℃離心15 min，收集透明水相到新的離心管中（其余兩相供蛋白質(zhì)提取用）。每管加等體積異丙醇（-20℃預(yù)冷），混勻，12 000×g，4℃離心10 min，棄上清，加75%乙醇洗滌并沉淀總RNA。真空或空氣干燥總RNA。最后用DEPC處理的超純水15 μl溶解沉淀。詳細總RNA 提取操作：AGPC 提取RNA 按文獻[14]方法改進執(zhí)行；TRIzolTM法提取RNA 按Invitrogen的用戶指南介紹的方法改進執(zhí)行。

取4 μl RNA 樣品加DEPC 處理過的雙蒸水至13 μl，加RNA載樣緩沖液7 μl，煮沸5 min后置冰中，然后上樣，進行0.8%甲醛瓊脂糖凝膠電泳（預(yù)電泳50 V，15 min；電泳60 V，40 min），檢查RNA 的完整性。主要觀察28 S 和18 S 兩條帶是否清晰，有無降解，以及是否有DNA污染。

取1 μl RNA樣品溶于99 μl DEPC處理過的雙蒸水中，用酶標儀測定在260 nm和280 nm波長處的吸光度。以A260值計數(shù)其濃度，1個A260單位=40 μg/ml RNA。計算公式：質(zhì)量濃度（μg/ml）=A260×40×100（倍數(shù)）。

以A260/A280的比值表示其純度，比值在1.8～2.0 為純的核酸；比值低于1.8，說明RNA 樣品有蛋白質(zhì)或酚污染，需用氯仿重新抽提。

1.4.4 熒 光qRT-PCR 檢 測FLS 的IL-1β 和TNF-α mRNA基因變化

利用promega 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA 為cDNA[15]，梯度PCR儀優(yōu)化選定PCR退火溫度。條件優(yōu)化后進行IL-1β和TNF-α mRNA表達分析，復(fù)管，重復(fù)5次。PCR反應(yīng)體系：2×反應(yīng)混合物10 μl，消毒水7 μl，引物0.5 μl，cDNA 2 μl。PCR 條件：95℃10 s 變性，退火溫度[13]，59.0℃15 s退火，40個循環(huán)。55.0℃～95.0℃觀察溶解曲線。引物序列，參考文獻[16-18]并通過美國生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）的Primer-Blast 比 對大鼠基因序列，完全正確。IL-1β mRNA（Forward：5′-CCTTGTGCAAGTGTCTGAAG-3′，Reverse ：5′-GGGCTTGGAAGCAATCCTTA-3′）；TNF-α mRNA（Forward：5’-CAAGGAGGAGAAGTTCCCA-3′，Reverse：5′-TTGGTGGTTTGCTACGACG-3′）；GAPDH mRNA（Forward：5′-TCTTCCAGGAGCGAGATCCC-3′，Reverse：5′-TTCAGGTGAGCCCCAGCCTT-3′）。

1.5 蛋白質(zhì)的提取及其濃度、純度和化學(xué)完整性鑒定

將TRIzolTM法提取RNA 途中留存的樣品，加入100 μl 100%乙醇混勻充分，室溫孵育3 min，2000×g，4℃離心5 min，吸取上清至新管中，加入600 μl 異丙醇，混勻，室溫孵育10 min，12 000×g，4℃離心6 min，棄上清，加入800 μl 0.3 mol/L 鹽酸胍，95%乙醇重懸沉淀。室溫孵育20 min，6000×g，4℃離心5 min，棄上清。重復(fù)重懸沉淀兩次后，加入800 μl 100%乙醇混勻充分，室溫孵育20 min，6000×g，4℃離心5 min，棄上清，空氣干燥，5～10 min。每管加入200 μl 的1%SDS 在50℃水浴鍋中使沉淀充分溶解。10 000×g，4℃離心10 min，收集上清液到新試管中。詳細的TRIzolTM提取蛋白質(zhì)法按Invitrogen 的用戶指南介紹的方法加以改進進行。常規(guī)提取培養(yǎng)細胞蛋白質(zhì)方法按《分子克隆》介紹的用裂解緩沖液提取。

蛋白質(zhì)濃度測定采用紫外光譜吸收法[19]，蛋白質(zhì)溶液在波長280 nm 附近由于酪氨酸、色氨酸殘基有強烈的吸收。據(jù)此運用以下公式計算蛋白質(zhì)含量：蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=F×（1/d）×A280，此處F 可查表，d為測量杯光徑（cm）。

蛋白質(zhì)純度評估采用測定純化蛋白質(zhì)的紫外光譜確定[20]。以A280/A260的比值表示其純度。比值在1.8～2.0為純的蛋白質(zhì)；否則懷疑有核酸污染。

蛋白質(zhì)化學(xué)完整性和生物反應(yīng)能力檢測：采用考馬斯亮藍凝膠染色液染色SDS-PAGE結(jié)果，觀察蛋白質(zhì)有無降解[21]；確定無降解后，采用免疫印跡法檢測FLS的功能蛋白IL-1β和TNF-α表達情況，鑒定所提蛋白質(zhì)的質(zhì)量。免疫印跡法具體操作步驟參考文獻[22,23]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。免疫印跡檢測結(jié)果采用相對光密度值表示，熒光qRT-PCR檢測結(jié)果采用2-△△CT表示。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代滑膜細胞的培養(yǎng)、純度和增殖

采用腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠，劑量為2 ml/（kg·bw）。75%乙醇浸泡大鼠10～20 min，取雙側(cè)后膝關(guān)節(jié)（圖1A、1B）。分離的滑膜組織培養(yǎng)1 d 后，細胞絕大部分為梭形（圖1C）。培養(yǎng)第6 天（圖1D），細胞融合度達70%～80%，貼壁生長，但是仍然有極少的圓形、橢圓形細胞，進行傳代。培養(yǎng)第12～14 天（圖1E），第3 代細胞形態(tài)為梭形，核位于中央，生長良好。第8 代滑膜細胞增長緩慢，形態(tài)從梭形變?yōu)榻茩E圓形，細胞間隙增大，有空泡、壞死、老化（圖1F）。第3 代FLS，免疫熒光化學(xué)（圖1G）和免疫組織化學(xué)染色（圖1H）觀察：形態(tài)規(guī)則，呈梭形，其細胞核為卵圓形位于細胞中央；波形蛋白（vimentin）染色滑膜細胞陽性率大于98%，vimentin為FLS特征性標志蛋白，提示培養(yǎng)的滑膜細胞為FLS；觀察第3～7代的FLS，增殖活躍，生長情況良好，從形態(tài)和特異性蛋白定位看為FLS，且純度高。通過對原代培養(yǎng)的第7代滑膜細胞的5-乙炔基-29-脫氧尿苷（5-ethynyl-29-deoxyuridine,EdU）增殖實驗，顯示仍有增殖能力（圖1I）。

圖1 SD大鼠正?；ぜ毎囵B(yǎng)及其鑒定

綜上，滑膜細胞原代培養(yǎng)的第3～7代FLS可作為后續(xù)實驗研究材料。

2.2 RNA的完整性、得率、純度[24]

用AGPC和TRIzolTM法提取的RNA[25,26]進行甲醛瓊脂糖凝膠電泳，18 S 帶和28 S 帶清晰可見，且28 S帶比18 S帶亮度強2～3倍，帶與帶之間無明顯拖尾現(xiàn)象，表明RNA 無降解，無明顯的DNA 污染（圖2A），RNA 樣品A260/A280的比值均在1.8 以上，說明RNA 未被蛋白質(zhì)、酚污染，是高純度的。RNA 的最低濃度1.4 μg/μl，含量18.5 μg以上/5×105細胞，達到了AGPC和TRIzolTM法提取RNA的標準。用此RNA可進行多次qRT-PCR 分析，若用于耗RNA 量較大的Northern印跡法，也可滿足2次以上。

qRT-PCR分析IL-1β 和TNF-α mRNA表達，獲得成功。AGPC 和TRIzolTM法提取的FLS 總RNA 進行功能基因IL-1β 和TNF-α 表達分析，二者的2-△△CT值無明顯差別（圖2B）。

熒 光qRT-PCR 檢 測FLS 的IL-1β、TNF-α 和GAPDH mRNA 結(jié)果顯示：擴增曲線均成S 趨勢，溶解曲線一致，無雜峰。圖2C、D 顯示的是TRIzolTM法提取的總RNA 進行IL-1β 的qRT-PCR 分析所得的擴增曲線和溶解曲線。

圖2 AGPC和TRIzolTM法所提FLS總RNA的甲醛瓊脂糖凝膠電泳及IL-1β和TNF-αmRNA表達情況

2.3 蛋白質(zhì)的得率、純度[24]和生物反應(yīng)能力

用SDS 裂解緩沖液和TRIzolTM試劑提取的蛋白質(zhì)[27]，進行SDS-聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳后，用考馬斯亮藍染色液染色凝膠，顯示分離效果好，無降解蛋白肽段（圖3A）。

通過測定蛋白質(zhì)在波長280 nm 處吸收值，兩組方法得出總蛋白質(zhì)80 μg以上/5×105細胞，完全可以滿足2～3次免疫印跡分析需要。兩種方法所提蛋白質(zhì)樣品的A280/A260比值均在1.8以上，表明蛋白質(zhì)純度達標。

免疫印跡法對IL-1β 和TNF-α 蛋白分析結(jié)果顯示：目的蛋白條帶均一，背景干凈，無雜帶（圖3B），這說明蛋白肽段完整性好，可與抗體有效結(jié)合，具有生物反應(yīng)能力。

圖3 SDS-裂解和TRIzolTM法所提FLS總蛋白電泳分離后的考馬斯亮藍染色的凝膠圖像及IL-1β和TNF-α蛋白表達情況

3 討論

細胞原代培養(yǎng)技術(shù)是廣泛用于分子生物學(xué)體外研究的重要方法之一，但多數(shù)實驗室細胞原代培養(yǎng)的成功率不高，純度不夠，有穩(wěn)定的母系細胞特征和功能的傳代細胞的代數(shù)較少。如何成功培養(yǎng)出原代細胞并建立從其培養(yǎng)出的有母系細胞特征和功能的少量原代細胞中提取所需的RNA 和蛋白質(zhì)尤為重要。因此，建立原代培養(yǎng)方法和從同一份原代培養(yǎng)細胞中同時提取核酸蛋白的方法很有必要。本研究經(jīng)過多次實驗，成功地培養(yǎng)出有FLS生理功能的原代滑膜細胞，F(xiàn)LS純度在98%以上，且原代培養(yǎng)細胞的第3～7代均可作為后續(xù)實驗研究材料[13]。在此基礎(chǔ)上，運用TRIzolTM試劑盒成功建立了從同一份原代培養(yǎng)細胞中同時提取總RNA和蛋白質(zhì)的快速提取法。RNA和蛋白質(zhì)的純度、完整性和生物學(xué)行為功能完全達標，試劑來源容易，操作簡便，適用于國內(nèi)實驗室。

本研究對分離出的SD大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織采用Ⅰ型膠原酶消化法進行原代培養(yǎng)，嚴控操作細節(jié)，獲得具有FLS 生理功能的原代細胞。原代培養(yǎng)出FLS的成功關(guān)鍵是嚴控細節(jié)操作。整個過程在無菌和冰浴下操作，減少細胞污染和死亡；銳性分離滑膜組織要盡可能剪碎滑膜組織，不要過濾，要磨平移液器吸頭，減少細胞物理損傷和污染機會；傳代消化終止后，重懸洗滌2次以上，減少胰酶對細胞的損傷；原代細胞進行傳代時，融合度不能超過80%，防止細胞接觸抑制、損害原代細胞的生物學(xué)行為和特征的穩(wěn)定。

TRIzolTM試劑盒雖有從同一份標本中提取出RNA 和蛋白質(zhì)的方法支持，但國內(nèi)研究人員鮮有成功嘗試的報道。本研究經(jīng)過多次重復(fù)和探索實驗，運用TRIzolTM試劑盒試劑，經(jīng)過改良從同一份原代培養(yǎng)細胞標本中同時提取出RNA和蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)提取方法比較，兩種方法提取的RNA 和蛋白質(zhì)質(zhì)量無差別。RNA和蛋白質(zhì)的完整性和生物功能取決于最大限度地避免提純過程中內(nèi)源及外源性的核糖核酸酶和蛋白酶對RNA和蛋白質(zhì)的降解。同時還要防止機械高溫對RNA 和蛋白質(zhì)的降解。為了確保所提RNA 和蛋白質(zhì)的特征和功能，提取過程須在無菌和冰浴下操作，超聲破碎細胞不能超過5 s×3次，每次間隔1 min，嚴防RNA和蛋白質(zhì)受熱和機械力持續(xù)而降解；RNA、DNA 和蛋白質(zhì)的分相過程中，確保水相或管子處于無RNA酶狀態(tài)，確保水相無RNA酶和蛋白質(zhì)污染，吸取上清，寧少勿多；在100%乙醇去除中下層中的絮狀DNA 時，吸取上清，寧少勿多，確保蛋白質(zhì)的純度；最后，在RNA 和蛋白質(zhì)的洗滌過程中，尤其是蛋白質(zhì)，離心力不宜太大，離心時間不宜太長，防止增加溶解RNA和蛋白質(zhì)沉淀的難度。

傳統(tǒng)方法提取RNA和蛋白質(zhì)，多種試劑分別加入兩份原代細胞，多環(huán)節(jié)操作，增加了RNA和蛋白質(zhì)的污染和降解機會，從而增加了操作難度。把RNA和蛋白質(zhì)放在同一份標本中提取，簡化了操作步驟，可比性好。不但節(jié)省時間，提高了工作效率，而且減少了RNA和蛋白質(zhì)降解的機會，無需單獨提取RNA和蛋白質(zhì)所需的RNA酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。

4 結(jié)論

本研究建立的同時提取FLS原代細胞微量RNA和蛋白質(zhì)的方法，操作簡便，高效快速，經(jīng)濟實用。通過FLS總RNA 的0.8%變性甲醛凝膠電泳監(jiān)測、實時熒光定量PCR對FLS的功能分子分析及FLS總蛋白質(zhì)的SDS-PAGE監(jiān)測、免疫印跡法實驗印證功能分子表達，證明了同時提取的FLS 原代細胞RNA 和蛋白質(zhì)純度高、完整性好，具有母系細胞的生物學(xué)行為功能，完全適用于體外培養(yǎng)細胞的分子生物學(xué)研究，預(yù)示此方法將有良好的應(yīng)用前景。本研究建立的提取方法，對除FLS 外的原代細胞的微量RNA 和蛋白質(zhì)同時提取也有借鑒作用。

從FLS原代細胞中同時提取微量總RNA和總蛋白質(zhì)，得率高、純度好，具有化學(xué)完整性和生物反應(yīng)能力，有利于體外細胞分子生物學(xué)研究。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突