劉馨雨 張海生 許銘芯 辛相余 穆明月 梁鑫宇

(陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710000)

沙棘葉富含黃酮、多酚、多糖、維生素、微量元素、氨基酸等物質(zhì)[1-2]，具有抗氧化、抗癌變、降低血糖血脂、調(diào)節(jié)代謝等功能，可以作為生物活性物質(zhì)和功能性食品的來源[3-4]。但是在沙棘采收過程中，沙棘葉往往被視作廢棄物丟棄，從而造成資源嚴重浪費。研究表明，沙棘葉中黃酮類化合物是主要的抗氧化活性物質(zhì)[5]。目前，對沙棘葉黃酮的研究主要集中于提取方法，有機溶劑萃取法、回流法等傳統(tǒng)方法使用溶劑量大、得率低[6-7]；酶解法、超臨界流體萃取法等新興方法提取率較高，但成本高，操作難度較大[8-9]。因此，尋求合適的沙棘葉黃酮提取方法并進行工藝優(yōu)化，對開發(fā)利用沙棘葉、推進沙棘葉產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有一定參考價值。

近年來對沙棘葉黃酮的提取方法有超聲波提取和微波輔助提取。在此基礎(chǔ)上的超聲波微波協(xié)同提取法是一種新興的提取技術(shù)，因其整合了超聲波、微波2種提取技術(shù)的優(yōu)勢，具有較好的應(yīng)用前景[10]。研究表明，利用超聲波微波協(xié)同技術(shù)提取阿拉比卡咖啡豆中的綠咖啡油[11]、荸薺皮中的總黃酮[12]、菠蘿蜜果皮中的果膠[13]，均獲得了較高的提取率，且對產(chǎn)品品質(zhì)的影響較小。而目前將超聲波微波協(xié)同技術(shù)應(yīng)用于沙棘葉黃酮提取中的研究極為少見。

本研究通過比較常規(guī)溶劑萃取、超聲波輔助提取、微波輔助提取和超聲波微波協(xié)同提取4種不同提取方法的沙棘葉黃酮得率及其組織結(jié)構(gòu)變化，篩選出沙棘葉黃酮的最佳提取方法，并對提取工藝進行優(yōu)化，測定沙棘葉黃酮組成成分和體外抗氧化活性，以期為沙棘葉的綜合開發(fā)利用提供技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘干葉：由延安市圓方集團公司提供，2019年6月采摘于延安市。

標準品：蘆丁、兒茶素、槲皮素、山萘酚、異鼠李素、丁香酸、楊梅素、原花青素、大豆苷元、柚皮素，均購于美國Sigma公司。

乙醇、鹽酸、色譜級甲醇、色譜級乙腈、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、水楊酸、過氧化氫、抗壞血酸、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、DPPH、ABTS，均為分析純，購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XO-SM100型超聲波微波協(xié)同反應(yīng)工作站，南京先歐儀器制造有限公司；Multiskan Go型全波長酶標儀，美國熱電公司；Anke TGL-16G型飛鴿離心機，上海安亭科學儀器廠；YR-PTB型真空泵，上海亞榮生化儀器廠；PL203型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；雷磁PhSJ-4A型 pH計，上海久世環(huán)?？萍加邢薰?；GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SY-5000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UltiMate3000高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher公司；Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡，美國FEI公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 沙棘葉樣品處理 將沙棘葉置于電熱鼓風干燥箱中，在55℃恒溫條件下干燥4 h，粉碎過20目篩，備用。

1.3.2 沙棘葉黃酮的提取 常規(guī)溶劑萃?。簠⒄枕n雅慧等[14]的方法，精確稱取5 g沙棘葉粉末于250 mL具塞三角瓶中，按1∶30 (g∶mL) 料液比加入150 mL 60%乙醇溶液，搖勻，蓋塞，在室溫下避光浸提24 h，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸后用95%乙醇溶解并定容至100 mL，待測。

超聲輔助提取：參照Ghasemzadeh等[15]的方法，精確稱取5 g沙棘葉粉末于超聲提取杯中，按1∶30(g∶mL)料液比加入150 mL 60%乙醇溶液，采用150 W的超聲功率提取20 min，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸后用95%乙醇溶解并定容至100 mL，待測。

微波輔助提?。簠⒄誋uang等[16]的方法，精確稱取5 g沙棘葉粉末于250 mL燒杯中，按1∶30(g∶mL) 料液比加入150 mL 60%乙醇溶液，置于微波加熱儀中，采用400 W的微波功率提取2 min，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸后用95%乙醇溶解并定容至100 mL，待測。

超聲波微波協(xié)同提取：參照孫巖等[17]的方法，精確稱取5 g沙棘葉粉末于250 mL燒杯中，按1∶30(g∶mL) 料液比加入150 mL 60%乙醇溶液，置于超聲波微波協(xié)同反應(yīng)工作站中，采用400 W的微波功率、150 W的超聲功率提取20 min，過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸后用95%乙醇溶解并定容至100 mL，待測。

1.3.4 黃酮含量的測定

1.3.4.1 蘆丁標準曲線的制作 將20 mg蘆丁標準品溶于60%的乙醇溶液中并定容至100 mL，即得0.2 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。參照都宏霞等[19]的方法，精密量取上述蘆丁標準溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL至7個10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5%的NaNO2，靜置6 min，再分別加入0.3 mL 10%的 Al(NO3)3溶液，靜置6 min后加入4 mL 4% NaOH溶液，再用30%乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置15 min，最后于510 nm處測定吸光度值。設(shè)定橫坐標為黃酮質(zhì)量濃度，縱坐標為吸光度值，繪制標準曲線，得到蘆丁標準曲線的回歸方程為Y=7.350 8X-0.003 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

1.3.4.2 黃酮含量的測定 取0.3 mL沙棘葉黃酮提取液，參考上述操作測定吸光度值。根據(jù)回歸方程和吸光度值計算沙棘葉中黃酮的含量。

1.3.4.3 黃酮得率的計算 按照以下公式計算黃酮得率：

R=(C×V)/m

(1)

式中，R：沙棘葉黃酮得率，mg·g-1；C：沙棘葉黃酮濃度，mg·mL-1； V：沙棘葉黃酮提取液體積，mL； m：沙棘葉粉末質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗 參照Ghasemzadeh等[15]的方法，固定超聲功率150 W、超聲溫度30℃，分別考察不同乙醇體積分數(shù)(40%、50%、60%、70%、80%)、協(xié)同提取時間(5、10、15、20、25 min)、微波功率(200、300、400、500、600 W)和料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g∶mL)對黃酮得率的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗 以乙醇體積分數(shù)(A)、微波功率(B)、協(xié)同提取時間(C)為試驗因素，黃酮得率為考察指標，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，確定超聲微波協(xié)同技術(shù)提取沙棘葉中黃酮的最佳工藝條件。試驗設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.7 沙棘葉黃酮的組成成分及含量分析 利用超聲波微波協(xié)同提取的最佳工藝條件提取沙棘葉黃酮，采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)對其組成成分進行分析。參照Weng等[20]的方法，取各樣品提取液1 mL，0.45 μm濾膜過濾。液相色譜條件：采用UltiMate3000 HPLC系統(tǒng)，Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相A為乙腈，流動相B為1%冰乙酸溶液，柱溫30℃，檢測波長280 nm，流速1.0 mL·min-1， 進樣量20 μL，總運行時間50 min，洗脫程序見表2。

表2 高效液相色譜的梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program of HPLC

1.3.8 沙棘葉黃酮的抗氧化活性

1.3.8.1 沙棘葉黃酮對DPPH自由基的清除能力 利用超聲波微波協(xié)同提取的最佳工藝條件提取沙棘葉黃酮，并進行下述抗氧化活性測定試驗。

參照Choi等[21]的方法，將2 mL質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg·mL-1的沙棘葉黃酮提取液加入到 2 mL 0.5 mmol·L-1DPPH乙醇溶液中，避光放置30 min，然后在517 nm處測定吸光度值。以Vc和蒸餾水代替黃酮提取液作為陽性和陰性對照，以無水乙醇溶液代替DPPH溶液作為本底對照。根據(jù)式(2)進行計算：

(2)

式中，d1：DPPH自由基清除率，%；A：沙棘葉黃酮溶液的吸光值； A0：陰性對照組的吸光值； Ax：本底的吸光值。

1.3.8.2 沙棘葉黃酮對ABTS自由基的清除能力 參照付曉丹等[22]的方法，取7.4 mmol·L-1ABTS溶液和2.6 mmol·L-1過硫酸鉀溶液各5 mL混合均勻，室溫避光放置過夜，然后加入無水乙醇至吸光值為0.68～0.72(在734 nm處)。向5支試管中分別加入0.2 mL質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg·mL-1的沙棘葉黃酮提取液和5.8 mL ABTS+溶液，20 min后于734 nm處測定其吸光值，以Vc和蒸餾水代替黃酮提取液作為陽性和陰性對照，以無水乙醇溶液代替ABTS稀釋溶液作為本底對照。根據(jù)式(3)進行計算：

(3)

式中，d2：ABTS自由基清除率，%；A：沙棘葉黃酮溶液的吸光值； A0：陰性對照組的吸光值； Ax：本底的吸光值。

1.3.8.3 沙棘葉黃酮的FRAP還原能力 參照Muller等[23]的方法，用0.1 mL質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg·mL-1的沙棘葉黃酮提取液與4.9 mL FRAP 試劑反應(yīng)，10 min后于593 nm處測定吸光度值。以Vc代替黃酮提取液作為陽性對照，以70%的乙醇作為本底對照。根據(jù)式(4)進行計算：

Ap=A-Ax

(4)

式中，Ap：FRAP還原能力；A：沙棘葉黃酮溶液的吸光值； Ax：本底的吸光值。

1.3.8.4 沙棘葉黃酮對羥基自由基的清除作用 參照Zhang等[24]的方法，向2 mL質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg·mL-1的沙棘葉黃酮提取液中依次加入2 mL 6 mmoL·L-1硫酸亞鐵溶液、2 mL 6 mmoL·L-1雙氧水溶液和2 mL 6 mmoL·L-1水楊酸乙醇溶液，37℃恒溫反應(yīng)15 min，測定510 nm處的吸光值。以VC和蒸餾水代替黃酮提取液作為陽性和陰性對照，以蒸餾水代替過氧化氫溶液作為本底對照。根據(jù)式(5)進行計算：

(5)

式中，d3：羥基自由基清除率，%；A：沙棘葉黃酮溶液的吸光值； A0：陰性對照組的吸光值； Ax：本底的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用Duncan多元回歸方法分析0.05水平上均值的顯著性差異，選用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對沙棘葉黃酮提取率的影響

常規(guī)溶劑萃取、超聲輔助提取、微波輔助提取和超聲波微波協(xié)同提取4種提取方法提取沙棘葉黃酮的得率如表3所示。通過常規(guī)溶劑萃取法提取的沙棘葉黃酮得率最低，僅有29.36 mg·g-1，超聲波微波協(xié)同提取法提取的沙棘葉黃酮得率最高，為41.85 mg·g-1。與其他3種方法的黃酮得率相比，采用超聲波微波協(xié)同提取法黃酮得率顯著增加(P<0.05)，分別提高42.54%、28.41%和16.83%，因此超聲波微波協(xié)同提取法的提取效果最好。

表3 4種提取方法的黃酮得率Table 3 Flavonoid yields of four extraction methods /(mg·g-1)

2.2 不同提取方法對沙棘葉組織結(jié)構(gòu)的影響

經(jīng)常規(guī)溶劑萃取、超聲輔助提取、微波輔助提取和超聲波微波協(xié)同提取4種方法提取后的沙棘葉粉末殘渣的掃描電鏡觀察結(jié)果見圖1。常規(guī)溶劑萃取處理的樣品表面有完整的細胞組織，原來緊密的結(jié)構(gòu)變得松散，細胞壁沒有明顯的破壞(B)，但與未處理的樣品相比，表面有輕微的裂痕。超聲處理樣品的細胞壁有一定程度的破壞(C)，仍能看到大體的細胞結(jié)構(gòu)，片狀顆粒變得細小均勻，這是因為聲波具有穿透作用，使溶劑穿透細胞壁，導(dǎo)致其破裂，且超聲過程中產(chǎn)生的氣泡也有助于細胞壁的破裂。經(jīng)微波處理的樣品表面破壞嚴重(D)，僅保留小部分細胞結(jié)構(gòu)，片狀顆粒細碎松散，這是由于溫度在微波過程中突然升高，粉碎了樣品的組織結(jié)構(gòu)。超聲波微波協(xié)同處理的樣品破壞最嚴重(E)，細胞結(jié)構(gòu)被完全破壞，產(chǎn)生很多空洞和層層斷裂面，表面積增大，可能是超聲波和微波的共同作用下，細胞內(nèi)蒸氣壓升高，加速了細胞的破裂?？梢姡?、微波處理提取會導(dǎo)致沙棘葉細胞的破裂和損傷，黃酮類物質(zhì)更易溶出，常規(guī)溶劑萃取則是依靠溶劑擴散到固體基質(zhì)中并通過溶解來萃取黃酮，因此4種方法下沙棘葉細胞破損程度大小為：常規(guī)溶劑萃取<超聲輔助提取<微波輔助提取<超聲波微波協(xié)同提取。

注：1和2分別為放大200倍和500倍。Note: 1 and 2 are 200× and 500× magnifications respectively.圖1 未處理沙棘葉(A)、常規(guī)溶劑提取葉(B)、超聲輔助提取葉(C)、微波輔助提取葉(D)和超聲波微波協(xié)同提取葉(E)的掃描電鏡觀察Fig.1 Scanning electron microscopic images of residues in the extraction of untreated leaves (A),conventional-solvent extracted leaves (B), ultrasound-assisted extracted leaves (C), microwave-assisted extracted leaves (D) and ultrasound-microwave assisted extracted leaves (E)

2.3 單因素試驗結(jié)果與分析

2.3.1 乙醇體積分數(shù)對沙棘葉黃酮得率的影響 如圖2所示，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，沙棘葉黃酮的得率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當體積分數(shù)為60%時得率最高(P<0.05)。當乙醇體積分數(shù)大于60%時，隨著乙醇體積分數(shù)的逐漸增大，黃酮得率顯著降低(P<0.05)，這可能是因為沙棘葉黃酮的極性與60%乙醇相似，故在60%乙醇溶液中溶解度最大，提取率最高。

圖2 乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of concentration of ethanol on the yield of flavonoids

2.3.2 協(xié)同提取時間對沙棘葉黃酮得率的影響 如圖3所示，隨著超聲波微波協(xié)同提取時間的增加，沙棘葉黃酮的得率先增加后降低，在20 min時提取效果最好。當協(xié)同提取時間小于20 min時，微波提取時間越長，溶液溫度越高，黃酮溶出量越多，黃酮得率也越大；當協(xié)同提取時間大于20 min時，時間過長，可能會導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)在高溫下發(fā)生降解、縮合等化學反應(yīng)，也可能是由于乙醇溶液揮發(fā)，提取能力降低，導(dǎo)致得率降低。

圖3 超聲波微波協(xié)同提取時間對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound-microwave time on the yield of flavonoids

2.3.3 微波功率對沙棘葉黃酮得率的影響 如圖4所示，沙棘葉黃酮的得率隨著微波功率的增加先升高后降低。功率小于400 W時，增加提取功率，可以加快分子運動，使沙棘葉黃酮更易溶出，得率升高；功率大于400 W時，功率的增加使沙棘黃酮提取液的溫度過高，黃酮類物質(zhì)可能發(fā)生降解，從而降低得率。

圖4 微波功率對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the yield of flavonoids

2.3.4 料液比對沙棘葉黃酮得率的影響 圖5表明，當料液比由1∶10(g∶mL)提高至1∶30(g∶mL)時，沙棘葉黃酮的得率也隨之顯著增加(P<0.05)，這是因為當料液比小于1∶30(g∶mL)時，料液比越高，傳質(zhì)過程越快，越利于黃酮的提取，得率增加；當料液比大于 1∶30(g∶mL) 時，沙棘葉黃酮得率隨溶劑用量的增加趨于相對穩(wěn)定，可能是黃酮已被最大限度提取。由此可知，1∶30(g∶mL)的料液比可以在獲得較高得率的同時減少溶劑的消耗，節(jié)約資源，降低成本。

圖5 料液比對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of solvent to solid ratio on the yield of flavonoids

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.4.1 回歸模型的建立及方差分析 采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗進行沙棘葉黃酮提取工藝條件的優(yōu)化，試驗設(shè)計及其結(jié)果見表4。試驗共17組，其中1～13號為沙棘葉黃酮得率的析因試驗，14～17為其中心試驗，每組試驗均重復(fù)3次。

表4 Box-Behnken試驗方案及結(jié)果Table 4 Box-Behnken design in terms of coded levels with response variable

用Design Expert V8.0.6.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸處理，得到沙棘葉黃酮得率(Y)與3個試驗因素的回歸方程：Y=-391.57+10.98A+5.93B+0.18C-0.04AB-0.001AC+0.000 8BC-0.08A2-0.10B2-0.000 1C2。

黃酮得率的方差分析如表5所示，其回歸模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，表明沙棘葉黃酮得率的回歸方程模型比較可靠，擬合度較好，可分析、預(yù)測超聲微波協(xié)同技術(shù)對沙棘葉黃酮的提取效果。各因子對黃酮得率影響的大小依次是A>C>B，其中A和C對黃酮得率的影響達到極顯著水平，B不顯著；交互項AB影響極顯著，AC顯著；A2、B2影響極顯著，C2顯著。

表5 方差分析表Table 5 Variance analysis (ANONA) of test results

2.4.2 響應(yīng)面分析及最佳工藝條件 由圖6可知，乙醇體積分數(shù)和協(xié)同提取時間的交互作用以及乙醇體積分數(shù)和微波功率的交互作用對黃酮得率的影響顯著(P<0.05)，提取時間和微波功率的交互作用對黃酮得率的影響不顯著(P>0.05)。

利用Design-Expert軟件對沙棘葉黃酮的超聲波微波協(xié)同提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分數(shù)61.04%、協(xié)同提取時間18.16 min、微波功率445.73 W，預(yù)測黃酮得率為42.13 mg·g-1。

圖6 兩因素交互作用對黃酮得率的影響Fig.6 The effect of the interaction of two factors on the yield of flavonoids

2.4.3 驗證試驗 為了實際操作方便，將優(yōu)化后的工藝條件修改為乙醇體積分數(shù)61%、協(xié)同提取時間18 min、微波功率446 W。經(jīng)驗證，此條件下的黃酮得率為42.09 mg·g-1，與理論預(yù)測值42.13 mg·g-1僅相差0.04 mg·g-1。故通過響應(yīng)面所得到的沙棘葉黃酮提取工藝的方程適用性強，優(yōu)化的工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

2.5 沙棘葉黃酮的組成成分分析

采用高效液相色譜法對沙棘葉黃酮的組成成分進行分析。對比黃酮標準品混合溶液和沙棘葉黃酮提取液的HPLC色譜圖中各成分的保留時間，沙棘葉黃酮中主要檢測出了6種黃酮類物質(zhì)，各成分及具體含量見表6。沙棘葉黃酮中含量最高的為兒茶素，為1.474 8 mg·g-1，其次是丁香酸和槲皮素，含量在0.2～0.4 mg·g-1之間，其余均在0.1～0.2 mg·g-1之間，含量最低的為山萘酚。

表 6 沙棘葉黃酮的成分及含量Table 6 Composition and content in flavonoid of Hippophae rhamnoides leaves /(mg·g-1)

2.6 沙棘葉黃酮的抗氧化活性測定結(jié)果

2.6.1 沙棘葉黃酮對DPPH自由基的清除作用 由圖7可知，當溶液濃度小于0.2 mg·mL-1時，樣品質(zhì)量濃度越高，沙棘葉黃酮和Vc對DPPH自由基清除效果越好。黃酮清除率在樣品濃度為0.2 mg·mL-1時高達88%，濃度繼續(xù)增大對DPPH自由基清除率的增加無明顯影響。此外，沙棘葉黃酮對DPPH自由基的清除效果稍弱于Vc，但超過80%的DPPH自由基清除率也表明沙棘葉黃酮具有較高的抗氧化活性。

圖7 樣品濃度與DPPH自由基清除率的關(guān)系Fig.7 Relationship between sample concentration and DPPH radical scavenging rate

2.6.2 沙棘葉黃酮對ABTS自由基的清除作用 圖8表明，Vc和沙棘葉黃酮均對ABTS自由基具有很強的清除作用，并且清除作用與樣品濃度息息相關(guān)，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。樣品濃度低時，沙棘葉黃酮對ABTS自由基清除作用弱，但其清除作用隨樣品濃度的增加不斷增強，濃度為0.6 mg·mL-1時，與Vc的清除作用基本相同，清除率高達98.1%。即沙棘葉黃酮在濃度高時對ABTS自由基清除能力較強。

圖8 樣品濃度與ABTS自由基清除率的關(guān)系Fig.8 Relationship between sample concentration and ABTS radical scavenging rate

2.6.3 沙棘葉黃酮的FRAP還原能力 由圖9可知，Vc和沙棘葉黃酮都具有較強的還原能力，都可以把Fe3+還原為 Fe2+，從而使溶液的顏色發(fā)生明顯的變化。溶液濃度越高，沙棘葉黃酮和Vc的還原力越強，還原力和濃度成正相關(guān)，同濃度沙棘葉黃酮的還原力低于Vc。

圖9 樣品濃度與FRAP還原力的關(guān)系Fig.9 Relationship between sample concentration and FRAP reducing power

2.6.4 沙棘葉黃酮對羥基自由基的清除作用 由圖10可知，Vc和沙棘葉黃酮對羥基自由基的清除效果隨著濃度的變化，呈現(xiàn)出相同的趨勢，且沙棘葉黃酮的清除作用弱于Vc。溶液濃度小于0.2 mg·mL-1時，隨著濃度的增加，Vc和沙棘葉黃酮對羥基自由基的清除能力大幅提高；當濃度大于0.2 mg·mL-1時，增幅減小，曲線趨于平緩。

圖10 樣品濃度與羥基自由基清除率的關(guān)系Fig.10 Relationship between sample concentration and hydroxyl radical scavenging rate

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)超聲波微波協(xié)同提取技術(shù)是最適合沙棘葉黃酮的提取方法。Wang等[25]研究了甘草中黃酮類化合物的不同提取方法，發(fā)現(xiàn)與乙醇回流法、水抽提法和酶萃取法相比，超聲波微波協(xié)同提取法的能源節(jié)約率分別為38%、75%和16%，且耗時低、提取率最高、CO2排放最少。這可能是因為此方法結(jié)合了超聲波提取和微波提取兩種方法的優(yōu)勢。超聲波產(chǎn)生的強烈的物理混合打破了植物的組織結(jié)構(gòu)，但缺乏為天然植物化合物產(chǎn)生高熱能的能力；微波為天然植物化合物提供快速方便的加熱，使結(jié)構(gòu)變得膨脹，但具有傳質(zhì)限制[10,26]。超聲波微波協(xié)同提取法將機械振動和熱效應(yīng)有機結(jié)合，可快速、徹底地破壞細胞結(jié)構(gòu)，有利于內(nèi)容物快速溶出，將其應(yīng)用在沙棘葉黃酮的提取上，表現(xiàn)出更高的提取效率。

通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化沙棘葉黃酮的超聲波微波協(xié)同提取工藝發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響達到極顯著水平(P<0.01)，且隨著乙醇體積分數(shù)的增加，黃酮得率先增加后減小。Munhoz等[27]研究表明，溶劑的極性對萃取有顯著影響。乙醇是一種低極性溶劑，水是一種高極性溶劑，使用水和乙醇的混合物，可以提高黃酮類化合物在內(nèi)的酚類化合物的提取效率。黃酮類化合物在乙醇中的溶解度比在水中的溶解度高，所以乙醇在溶劑中的濃度越高，提取率就越高；且由于溶劑有利于微波提取黃酮中的熱量分配，當溶劑含量逐漸增大，對微波加熱的介電性能增強，得率增加。然而，在水溶液中加入一定濃度的乙醇后，得率開始下降，這是因為水對溶劑極性有積極的調(diào)節(jié)作用，可以增加植物材料的溶脹，提供更大的接觸表面積，促進提取過程，隨著乙醇的不斷加入，溶劑的極性將不斷降低，從而降低了黃酮類物質(zhì)的溶解度，因此得率減小[28]。

提取的沙棘葉黃酮具有較高的抗氧化活性，這可能是由于沙棘葉黃酮中所含的兒茶素、槲皮素等成分具有很強的抗氧化作用。Grzesik等[29]研究表明，兒茶素在體外抗氧化試驗中，對ABTS自由基清除能力以及對Fe3+的還原能力都很強，可作為抗氧化治療的納米制劑的理想候選者。Algandaby等[30]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以抑制谷胱甘肽以及超氧化物和谷胱甘肽過氧化物酶的消耗，具有顯著的抗氧化作用。但沙棘葉黃酮提取液中具體起抗氧化作用的成分還有待進一步提取分析。

4 結(jié)論

通過常規(guī)溶劑萃取、超聲輔助提取、微波輔助提取、超聲波微波協(xié)同提取4種提取方法提取沙棘葉黃酮，并對黃酮得率、沙棘葉組織結(jié)構(gòu)進行比較研究，得出超聲波微波提取法是提取沙棘葉黃酮的最佳方法。采用響應(yīng)面法對超聲波微波協(xié)同提取沙棘葉黃酮的工藝進行優(yōu)化，最終乙醇體積分數(shù)61%、提取時間18 min、微波功率446 W條件下的黃酮得率最高。沙棘葉黃酮提取液中共鑒定出6種黃酮類成分，并且具有較強的抗氧化活性。研究結(jié)果證實了超聲波微波協(xié)同提取法對沙棘葉黃酮提取的可行性，提高了黃酮提取率且對品質(zhì)影響較小。