馮俊彥 郎 濤 張 聰 李 明 青莉芳 屈會娟蒲志剛,* 康 樂

(1 西華師范大學環(huán)境科學與工程學院，四川 南充 637002；2 四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所，四川 成都 610061)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原料作物[1]。在我國，甘薯是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物，具有產(chǎn)量高、適應性廣、抗逆性強等優(yōu)點，對保障我國糧食與能源安全具有重要作用[2]。甘薯富含多糖、多酚等多種活性成分[3]，具有重要的醫(yī)療保健作用[4]，越來越受到消費者青睞。

甘薯是六倍體(2n=6X=90)作物，染色體多，基因組大，雜合度高，在基因定位、遺傳圖譜構建等研究上比其他作物困難[5]。目前甘薯遺傳研究主要使用簡單重復序列(simple sequence repeats,SSR)分子標記技術[6-7]、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子標記技術[8-9]等，相關序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)標記[10]、轉座子插入標記(retrotransposon insertion polymorphisms, RIP)[11]、啟動密碼子靶向(start codon targeted polymorphism,SCoT)標記[12]等也有報道。與水稻、玉米等主要作物目前廣泛使用的高通量單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)分子標記技術相比，上述傳統(tǒng)分子標記技術已經(jīng)不能充分滿足研究的需要。

近年來測序技術高速發(fā)展，給生物技術研究提供了強大的技術支持[13]，其中簡化基因組測序(reduced-representation genome sequencing, RRGS)技術是最具有應用前景的技術之一。該技術主要通過酶切技術降低物種基因組復雜程度，再針對基因組特定區(qū)域進行測序，從而獲得基因組序列信息。目前該技術已發(fā)展出多種類型，主要包括特異位點擴增片段測序(specific-locus amplified fragment sequencing, SLAF)[14]、限制性酶切位點相關DNA測序(restriction-site associated DNA, RAD)[15-16]、基因分型測序(genotyping by sequencing, GBS)[17]等，其中應用較為廣泛的是RAD測序技術。RAD測序技術具有高度的穩(wěn)定性，可以獲得大量的遺傳多態(tài)性。與傳統(tǒng)分子標記相比，RAD測序技術在發(fā)掘SNP方面具有顯著優(yōu)勢，而且操作簡單，試驗費用低，對無參考基因組的物種也可以進行大規(guī)模SNP位點篩查[18]。目前RAD測序技術已成功應用于超高密度遺傳圖譜的構建、重要經(jīng)濟性狀定位、群體遺傳結構和系統(tǒng)演化分析等研究[15-16]，并已成為甘薯遺傳研究最理想的研究技術之一[16]。

目標SNP位點的準確分型是首先需要解決的問題。迄今已開發(fā)出雜交法、DNA測序法、微陣列芯片法、酶切法等20多種SNP分型方法[19]。相比其他方法，高分辨率溶解(high resolution melt, HRM)技術具有簡便快速、通量高、成本低等優(yōu)勢。該技術是在PCR擴增產(chǎn)物變性過程中，實時檢測體系內熒光信號的變化，實現(xiàn)對SNP位點進行基因分型[20]。在動植物基因分型、突變掃描等研究中已得到廣泛應用[21-22]。

目前，關于甘薯單核苷酸多態(tài)性分子標記開發(fā)的研究較少[23-24]，因此本研究通過生物信息學分析甘薯簡化基因組測序數(shù)據(jù)，篩選穩(wěn)定單核苷酸多態(tài)性位點，開發(fā)基于HRM技術的分子標記，旨在為SNP分子標記在甘薯研究中的開發(fā)及應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究共收集國內外甘薯種質材料69份，其中國外種質材料7份、國內育成品種(系)49份、地方品種13份，全部試驗材料均由四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所收集保存(表1)。本研究使用的PCR試劑盒、DNA提取試劑盒、熒光染料均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 甘薯種質材料信息Table 1 The information of sweetpotato accessions

1.2 儀器與設備

5425R微型離心機，德國Eppendorf公司；T100-PCR儀，美國Bio-Rad公司；NanoDrop One微量核酸蛋白濃度測定儀，美國Thermo公司；Hise 2500測序儀，美國Illumina公司；DYY-2C電泳儀，北京六一儀器廠；GelDocXR+凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂Bio-Rad公司；Lightscanner-Instrument 96高通量熔解曲線分析儀，美國Idaho-Technology公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 甘薯基因組DNA提取 2019年6月，將全部參試甘薯種質材料種植于四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術核技術研究所新都試驗基地。同年8月，選取各材料幼嫩葉片0.3 g，液氮冷卻帶回四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所生物技術育種工程中心，使用CTAB法提取各材料基因組DNA[25]。用超純水充分溶解DNA后，抽取2 μL加5 μL上樣緩沖液，用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA質量。使用微量核酸蛋白濃度測定儀檢測DNA濃度。根據(jù)DNA濃度，將DNA原液稀釋到100 ng·μL-1，-20℃冷凍待用。

1.3.2 簡化基因組測序及分析 根據(jù)RAD-Seq測序文庫構建要求制備基因組DNA文庫。先利用不同限制性內切酶對基因組DNA分別進行酶切，根據(jù)酶切試驗結果選擇限制性內切酶EcoRI和NlaIII對甘薯基因組DNA進行酶切。按照RAD簡化基因組測序建庫方法，構建長度范圍在300～400 bp的雙端測序(pair-end)文庫。最后利用Ilumina HiSeq雙端測序平臺進行測序。

用Stacks v1.40軟件過濾原始測序數(shù)據(jù)[26]，去除接頭序列、低質量測序數(shù)據(jù)、接頭序列不明確的序列，以及長度小于指定長度的序列。選取過濾后測序片段長度的15%進行質量評估，保留質量高于10的序列。根據(jù)相同酶切位置測序片段之間的相似性，進行計數(shù)并獲得每個接頭序列的數(shù)目和深度信息。為保證后續(xù)獲得準確的SNP位點，過濾掉接頭序列中5′端非酶切位點為ATC起始的序列和深度值為1的序列，統(tǒng)計數(shù)目和深度。利用Stacks v1.40軟件中的無參考基因組分析方法，將個體內的測序片段進行內部比對，生成各個材料的stacks文件，再對不同個體進行兩兩比對，比對時允許的錯配數(shù)為2。整合深度信息和比對結果信息，過濾掉數(shù)據(jù)缺失大于30%的分型結果。利用最大似然法得到高可信度的SNP基因型結果[27]。

1.3.3 引物設計合成及PCR條件 根據(jù)含有高可信度SNP的測序片段序列信息，篩選SNP位點位于序列30～90區(qū)間內，且僅有1～2個SNP多態(tài)性位點的序列，使用BatchPrimer3 (http://batchprimer3.bioinformatics.ucdavis.edu/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi)，設計特異PCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應體系10 μL：50 ng·μL-1植物基因組DNA 2 μL，10×buffer 1 μL，25 mmol·L-1MgCl20.6 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 0.8 μL，10 μmol·L-1上、下游引物各加0.25 μL，5 unit·μL-1Taq酶0.1 μL，10×Evagreen熒光染料1.0 μL，10 μmol·L-1高、低溫內標各加1.0 μL，最后加去離子水2.0 μL補齊。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸45 s， 36個循環(huán)；72℃終延伸 min，慢慢冷卻至12℃。

1.3.4 PCR擴增產(chǎn)物檢測 將PCR反應板中的PCR產(chǎn)物轉移8.5 μL至上樣板中，每孔加入15 μL礦物油離心后，將上樣板放入Lightscanner儀器中，進行檢測。檢測程序包括采集62～95℃之間熒光信號變化數(shù)據(jù)，升溫速率設定為0.1℃·s-1。

PCR產(chǎn)物中加入5 μL上樣緩沖液(40%蔗糖，0.025%溴酚藍)，用1.5%(w/v)的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。在熒光成像儀上檢測拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理

數(shù)據(jù)采集完成后，使用Lightscanner儀器自帶的溶解曲線分析軟件對結果進行分析。在分析過程中，根據(jù)儀器提示或手動剔除PCR無擴增的樣本，高低溫內標根據(jù)掃描結果手動設置，以樣本曲線高、低溫內標曲線峰的最高點作為高低溫內標的溫度點。然后分析各樣本熔解曲線的分型結果。檢測各樣本分型檢測，對個別未正確分型的樣本，進行手動矯正。

利用Excel 2007軟件對分型數(shù)據(jù)進行初步處理，并進行數(shù)據(jù)相應格式轉化。利用SPSS 16.0軟件的聚類分析模塊，對參試材料進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 簡化基因組測序結果分析

為盡可能多挖掘甘薯基因組中遺傳多樣性豐富的SNP位點，本研究根據(jù)多年田間表型鑒定數(shù)據(jù)以及品種來源信息，選取23個遺傳多樣性豐富的甘薯種質材料進行RAD簡化基因組測序，共獲得54.13 Gb數(shù)據(jù)，從中過濾掉序質量小于9的數(shù)據(jù)和不符合要求的數(shù)據(jù)后，得到樣本測序數(shù)據(jù)的Q20值最大為96.26%，最小為93.44%，平均Q20值為95.42%。Q30值最大值為90.63%，最小為85.60%，平均Q30值為89.16%。

對23個甘薯品種原始測序數(shù)據(jù)過濾后，獲得高質量測序數(shù)據(jù)38.18 Gb數(shù)據(jù)，平均每個樣本獲得1.66 Gb數(shù)據(jù)，共獲得155 467 607個雙端測序片段以及 7 216 825 個單端測序片段。共獲得RAD標簽 11 739 112 個，單個材料最大為612 312個，最小為369 969個，平均每個樣本獲得510 396個。共獲得 155 751 596 個測序片段，平均每個樣本獲得6 771 809 個。通過計算每個樣本中獲得的總測序片段數(shù)與其總RAD標簽數(shù)比值，獲得測序深度，23份材料的測序深度處于9.87～16.44之間，平均測序深度為13.08。不同樣本的原始數(shù)據(jù)分布范圍為6 433 720～28 746 118，平均 10 541 122 (表2)。利用Stacks v1.40軟件進一步過濾數(shù)據(jù)并對樣本之間進行比較分析，發(fā)現(xiàn)346 609個片段含有多態(tài)性單核苷酸位點，共檢測到835 756個SNP位點。

表2 甘薯種質材料的RAD簡化基因組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 The statistic raw reads of RAD sequencing of sweetpotato accessions

2.2 單核苷酸分子標記開發(fā)

為確保SNP數(shù)據(jù)的可靠性，以簡化基因組測序數(shù)據(jù)分析獲得的SNP數(shù)據(jù)為基礎，對SNP進行再次嚴格過濾，確保單個SNP在95%以上的測序樣本(≥22個)中被檢測到，并對單個測序片段中出現(xiàn)3個以上的SNP位點的序列進行過濾，最后選取3 650個高質量測序片段。根據(jù)高分辨率熔解曲線技術對擴增產(chǎn)物片段在100 bp左右的要求，進一步對測序片段進行了篩選，只保留SNP位點位于序列36～90 bp范圍僅有1～2個SNP多態(tài)性位點，且主要變異類型為A/C、A/G、T/C、T/G類型的序列，利用BatchPrimer3在線程序設計引物。針對1個單核苷酸多態(tài)性位點成功開發(fā)54對引物，針對2個單核苷酸多態(tài)性位點成功開發(fā)80對引物。為驗證開發(fā)引物，選取8個甘薯品種DNA作為模板，使用高分辨率溶解曲線技術，分別對134對引物，擴增產(chǎn)物進行檢測，結果表明，134對引物中，112對有擴增產(chǎn)物，占總引物的83.58%，22對引物沒有擴增產(chǎn)物，占總引物的16.42%。在有擴增產(chǎn)物的134對引物中，15對(11.19%)對引物擴增產(chǎn)物檢測結果為多峰，擴增產(chǎn)物不止一個，36對(26.87%)引物在8個樣本中僅有一個擴增產(chǎn)物，樣本之間沒有差異，61對(45.52%)引物在8個樣本中的擴增特異性好，僅有一個擴增產(chǎn)物，而且樣本之間有差異，其中，27對引物之間差異較小，可以對小樣本的不同基因型進行區(qū)分(表3)。34對引物擴增多態(tài)性豐富，差異顯著。對擴增產(chǎn)物單一的引物，瓊脂糖電泳驗證結果表明，這些引物僅有1條100 bp左右的擴增產(chǎn)物，特異性良好(圖1)。

表3 擴增多態(tài)性引物信息Table 3 The amplified polymorphic primer information

注：Marker:DNA Marker，標準條帶分別為100、250、500 bp；1～4: 不同的參試材料。Note: Marker:DNA Marker. The size of bands is 100, 250, 500 bp, respectively. 1～4: Different sweetpotato accessions.圖1 部分Hrm-bat引物在參試材料中擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoretogram result amplified by primer Hrm-bat in different accessions

2.3 基于HRM檢測技術的分子標記多態(tài)性分析

為進一步驗證新開發(fā)引物在不同來源甘薯種質中的應用價值，在初步篩選的基礎上，選取34對擴增產(chǎn)物單一，差異顯著，且多態(tài)性豐富的引物，對本課題組近年來收集、保存且具有代表性的育成甘薯品種、地方甘薯品種、引進甘薯品種及部分測序甘薯品種共52份進行鑒定。結果表明，34對Hrm-bat引物在52份甘薯種質材料共檢測到296個多態(tài)性位點，平均每對引物檢測到8.71個多態(tài)性位點(圖2)。引物Hrm-bat54、Hrm-bat69檢測到的位點數(shù)最多，分別檢測到14個多態(tài)性位點。引物Hrm-bat25、Hrm-bat89、Hrm-bat100、Hrm-bat107檢測到的位點數(shù)最少，分別檢測到5個多態(tài)性位點。根據(jù)檢測結果篩選到14對引物檢測到的10個以上多態(tài)性位點，分別是Hrm-bat15、Hrm-bat30、Hrm-bat45、Hrm-bat46、Hrm-bat54、Hrm-bat57、Hrm-bat61、Hrm-bat69、Hrm-bat72、Hrm-bat85、Hrm-bat90、Hrm-bat95、Hrm-bat111。

注：本圖片為Lightscanner儀器自帶軟件分析結果。橫坐標是溫度值，縱坐標為標準化熒光信號值。Note:The picture shows the analysis results of the Lightscanner instrument’s software. The abscissa is the temperature and the ordinate is the normalized fluoresence.圖2 部分Hrm-bat引物在8份甘薯材料中的HRM檢測結果Fig.2 Applications of some Hrm-bat primers in 8 sweetpotato accesssions with HRM

為驗證Hrm-bat分子標記在甘薯種質材料間的多態(tài)性，本研究對Hrm-bat分子標記在52份甘薯種質材料中的掃描結果進行材料間的比對分析(圖3)，結果表明，34個Hrm-bat分子標記在甘薯種質1-24和紫色觀賞中獲得的多態(tài)性位點最多，有30個位點具有多態(tài)性，多態(tài)性率達到90.91%。甘薯種質2019516161和川菜薯211之間的差異最小，僅得到9個多態(tài)性位點，多態(tài)性率只有27.27%。所有Hrm-bat在全部參試材料間的平均多態(tài)性達到59.35%。以上結果表明，本研究設計開發(fā)的Hrm-bat分子標記在甘薯種質材料間具有豐富的遺傳多態(tài)性，可以用于發(fā)掘甘薯種質材料之間的遺傳多樣性研究。

圖3 部分Hrm-bat引物在52份參試材料中的HRM檢測結果Fig.3 Applications of some Hrm-bat primers in 52 sweetpotato accessions with HRM

2.4 甘薯種質材料遺傳多樣性分析

基于34對Hrm-bat分子標記對52份參試甘薯種質材料的分子標記數(shù)據(jù)，利用SPASS V16.0軟件計算不同材料間平方Euclidean距離，使用系統(tǒng)聚類法的組間聯(lián)結法進行聚類分析。結果表明，52份參試材料可分為兩大類，其中第一大類群包含51份甘薯材料(圖4)；另一大類群僅包括1份紫色觀賞甘薯材料，該材料以臺灣紫秧為母本，通過放任授粉選育得到。

在聚類圖重新標定距離約5.5處，第一大類又被劃分為5個小類群。其中，第一小類群最大，包含41份甘薯材料，占總材料的78.85%。該類群包括5個亞群，第一亞群包括5份材料，其中福薯18、北京553、冀紅肉江88、廣菜2號關系較近，香芋薯關系較遠。第二亞群為最大群，包含18份材料，分為4組，4組之間關系較近，甘薯骨干親本南瑞苕也在本類群中。第三亞群包括10份甘薯材料，分為兩組，包含了甘薯骨干親本徐薯18。第四亞群包括5份材料，其中，地方品種170和湘薯15之間、日紫9號和福薯604之間關系較近，冀19-40關系較遠。3份材料(川薯383、良種苕、西城薯007)與其他材料關系較遠，聚為一個亞群(圖4)。

圖4 基于Hrm-bat分子標記的52份甘薯種質材料平均連鎖聚類圖Fig.4 Dendrogram of 52 sweetpotato accessions using average linkage based on Hrm-bat molecular markers

第二小類群包含3份材料，分別是菜薯5號、金瓜黃11、2019513002。第三類群包括2份材料，分別是湘薯15號、無外苕。第四小類群包含紅紅苕、濟薯26、贛薯22、綿早秋共4份材料，其中紅紅苕、濟薯26、贛薯22關系較近，地方品種綿早秋關系較遠。第五小類群包含日紫1號1份材料(圖4)。從聚類圖可知，日紫1號與其他材料之間的關系較遠，可能與其國外來源有關。

整體來看，聚類圖中參試52份甘薯種質材料之間遺傳關系較近，大部分選育品種之間差異較小，這可能與我國甘薯育種中廣泛使用少數(shù)材料作為親本，選育出的品種間親緣關系較近有關。相對而言，一些引進材料和地方品種的遺傳差異較大，可作為育種親本使用，從而進一步豐富品種的遺傳多樣性。

3 討論

目前，甘薯研究中主要使用的分子標記仍然是非特異性、傳統(tǒng)型分子標記[28-29]。相比傳統(tǒng)分子標記，SNP分子標記在基因組中分布廣泛，標記數(shù)量遠多于傳統(tǒng)型分子標記[30]，但是目前該標記在甘薯研究應用較少。

測序技術的發(fā)展為甘薯研究提供了強大的技術支撐，甘薯及其近緣種I.trifida和I.triloba基因組測序工作相繼完成[31-32]。在眾多測序技術中，簡化基因組測序技術在發(fā)掘基因組SNP多態(tài)性方面優(yōu)勢也逐漸顯現(xiàn)[33]，目前已開發(fā)出多種簡化基因組測序技術，這些技術已經(jīng)在甘薯超高密度遺傳圖譜的構建、群體遺傳結構和系統(tǒng)演化分析等研究中得到廣泛應用[34]。本研究利用簡化基因組測序技術對甘薯種質材料進行了測序分析，在甘薯基因組中檢測到835 756個SNP位點，從中篩選了一批多態(tài)性高、穩(wěn)定好的SNP位點，用于開發(fā)SNP分子標記。同時，本研究將簡化基因組測序技術應用到甘薯基因組SNP發(fā)掘和分子標記開發(fā)上，充分發(fā)揮了簡化基因組測序技術高通量、快速、低成本的優(yōu)勢，為今后甘薯SNP分子標記的開發(fā)提供了參考。

近年來，SNP分子標記的檢測技術一直是國內外研究的熱點。目前，研究人員已開發(fā)出多種SNP檢測技術。相比其他檢測技術，HRM技術操作簡單、靈敏高效，能夠開展高通量、低成本的操作，可以有效區(qū)分SNP、SSR和InDel等不同類型變異的雜合與純合狀態(tài)，在水稻、玉米、小麥等作物的遺傳及分子標記輔助選育研究上得到了廣泛應用[20-22]。因此，本研究根據(jù)HRM技術要求設計開發(fā)引物，以簡化基因組測序篩選到含有SNP多態(tài)性位點的測序片段為參考，成功開發(fā)出134對分子標記，通過對開發(fā)分子標記的驗證，篩選到98對引物的擴增產(chǎn)物特異性好，利用HRM技術實現(xiàn)了對不同基因型的準確區(qū)分。

為進一步驗證本研究開發(fā)的引物在甘薯種質材料中的多態(tài)性，本研究選取了34對多態(tài)性高的引物對52份甘薯種質材料進行了分型，發(fā)現(xiàn)平均每對引物檢測到8.71個多態(tài)性位點，最多可以檢測出15個基因型，最少仍可檢測出5個基因型。初步證明本研究開發(fā)的HRM分子標記在甘薯種質材料中具有豐富的多態(tài)性，在今后甘薯分子標記研究中具有一定的應用價值。

利用本研究開發(fā)Hrm-bat分子標記的檢測結果，對52份甘薯種質材料進行的聚類分析發(fā)現(xiàn)，52份材料件相似性很高，多數(shù)材料的差異在5.5以下，這與我國甘薯育種中使用親本較少，育成品種遺傳背景狹窄有密切關系，與前人研究結果基本一致[35-36]。78.85%的參試材料被聚到一個類群中，其中包含了甘薯骨干親本南瑞苕和徐薯18，這可能與我國大量甘薯品種含有骨干親本其血緣有關[37-38]。相比較而言，聚類圖顯示甘薯地方品種和國外引進品種的遺傳差異較大。建議在今后甘薯育種中盡量選用地方品種和國外甘薯品種，以更好地拓寬甘薯遺傳背景[39]。在聚類圖中一些地方品種、國外引進品種與育成品種有聚集，推測這些品種間存在親緣關系，具體原因還需進一步研究。

4 結論

本研究利用簡化基因組測序技術對甘薯地方品種、引進品種及育成品種進行了測序分析，成功開發(fā)出基于HRM技術的甘薯特異SNP分子標記，并將部分分子標記應用于甘薯親緣關系分析，為今后甘薯SNP分子標記開發(fā)提供了參考。