肖 亮 鮑茹雪 曹 升 陸柳英 尚小紅 曾文丹聶宣紅 嚴(yán)華兵,2,*

(1 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，廣西 南寧 530007；2 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；3 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101；4 越南農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 河內(nèi) 12500 越南)

木薯(ManihotesculentaCrantz)是三大薯類作物之一，全球第六大糧食作物，用途廣泛，可食用、飼用和加工成各種工業(yè)產(chǎn)品，如淀粉、酒精等[1]。隨著全球氣候變暖，干旱已經(jīng)成為影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因子之一[2]。近十年來由于干旱造成的農(nóng)作物減產(chǎn)損失已達(dá)到約300億美元[3]。在木薯主產(chǎn)區(qū)廣西，木薯主要種植在旱坡地上，主要土壤類型為磚紅壤和赤紅壤，土壤條件干旱、貧瘠，干旱是制約木薯產(chǎn)量的重要因素之一[4-5]。因此增強(qiáng)木薯耐旱性具有重要的生物學(xué)及經(jīng)濟(jì)學(xué)意義。

SBT基因家族是一類龐大的家族，例如其在小立碗蘚(Physcomitrellapatens)基因組中有23個(gè)成員，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有56個(gè)成員[6-7]，在水稻(Oryzasativa)中有63個(gè)成員[8]，在楊樹(Populustrichocarpa)中有90個(gè)成員[9]，在葡萄(Vitisvinifera)中有80個(gè)成員[9]，在番茄(Solanumlycopersicum)中有15個(gè)成員[10]。大量研究表明枯草桿菌蛋白酶(subtilase, SBT)參與植物非生物脅迫反應(yīng)。擬南芥基因組中SBT基因SDD1(stomataldensityanddistribution1)通過影響氣孔密度調(diào)節(jié)擬南芥植株的抗旱性[11]，后續(xù)研究結(jié)果表明該基因在氣孔前體細(xì)胞中高表達(dá)，并通過產(chǎn)生信號物配體，激活細(xì)胞膜上的激酶蛋白，進(jìn)而控制細(xì)胞線性發(fā)育并導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞形成[12-13]。研究表明，板藍(lán)根(Isatisindigotica)的IiSDD1受干旱和脫落酸處理后下調(diào)表達(dá)[14]。在玉米(Zeamay)中過表達(dá)ZmSDD1后轉(zhuǎn)基因植株的氣孔數(shù)目下降30%，干旱脅迫后過表達(dá)ZmSDD1植株存活率相比于野生型大幅度提高[15]。前期研究表明，干旱脅迫條件下，18個(gè)木薯SBT基因下調(diào)表達(dá)[16]，但木薯MeSDD1能否增強(qiáng)植株的抗旱性仍有待研究。

鑒于此，本研究通過生物信息學(xué)方法鑒定木薯全基因組中SBT成員，明確其在染色體上的分布，分析各成員的基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；從木薯基因組中分離與擬南芥SDD1高度同源的基因MeSDD1，研究其抗旱功能，以期為木薯抗旱遺傳改良提供理論基礎(chǔ)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

木薯(ManihotesculentaCrantz)品種為新選048，擬南芥(Arabidopsisthaliana)材料為Col生態(tài)型；菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，植物表達(dá)載體為pC2 300s-GFP，均由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院木薯課題組保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木薯SBT家族成員的鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及各成員的染色體分布分析 利用Phytozome12(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)結(jié)合NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫通過Blast分析，獲得所有木薯SBT家族成員的編碼區(qū)(coding sequence, CDS)、氨基酸、轉(zhuǎn)錄本和基因組序列。使用MEGA 5.0軟件，將獲得的木薯SBT家族成員與56個(gè)擬南芥SBT成員構(gòu)建進(jìn)化樹，并于在線工具EVOLVIEM(https://evolgenius.info//evolview-v2/#login)中對進(jìn)化樹進(jìn)行編輯。利用MapInspect軟件(http://www.plantbreeding.wur.nl/UK/software_mapinspect.html)對木薯SBT家族成員進(jìn)行染色體定位分析。

1.2.2 木薯SBT家族成員基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析 結(jié)合進(jìn)化樹，使用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)分析所有成員的基因結(jié)構(gòu)，并使用MEME(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)分析保守模體。

1.2.3 木薯SBT基因家族啟動子元件分析 提取所有木薯SBT家族成員基因組序列起始密碼子ATG上游2 000 bp序列作為木薯SBT家族基因的啟動子，利用在線軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)分析啟動子區(qū)域的順式作用元件種類。

1.2.4MeSDD1基因克隆與植物表達(dá)載體的構(gòu)建 使用植物RNA提取試劑盒(寶生物工程大連有限公司)提取正常生長2個(gè)月的木薯新選048葉片組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，依據(jù)Manes.18G044300的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)PCR引物19OV104，引物序列見表1。PCR體系50 μL：DNA 1 μL, 10×Buffer 5 μL, dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL, 19OV104-F(10 μmol·L-1)1 μL, 19OV104-R(10 μmol·L-1)1 μL, TAQ(1 U·μL-1)1 μL, ddH2O 40 μL。反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5 min；98℃變性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸3 min，循環(huán)32次；68℃終延伸5 min。25℃保存。利用瓊脂糖回收試劑盒(寶生物工程大連有限公司)切膠回收PCR產(chǎn)物并純化，采用TA克隆，挑選3個(gè)單克隆送交上海生工測序驗(yàn)證。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

用SacI與BamHI雙酶切處理pC2300s-GFP(35S啟動子)表達(dá)載體獲得線性化載體，將同樣純化的目的片段MeSDD1與線性化pC2300s-GFP載體用T4連接酶連接形成重組質(zhì)粒19ATK50。

1.2.5 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及陽性植株篩選鑒定 在營養(yǎng)土中點(diǎn)播擬南芥種子，22±2℃培養(yǎng)至開花期備用；采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒19ATK50轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)、挑選陽性單克隆、菌落PCR鑒定后，將其接種在含有利福平和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基上，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600值在0.4～0.6之間。

采用蘸花法浸染擬南芥花序，使花浸入菌液中60 s，1周后再次轉(zhuǎn)化，浸染后的植株在22℃、12 h光照/12 h黑暗的培養(yǎng)間培養(yǎng)至收獲種子(T0代)。利用次氯酸鈉對種子消毒后，接種于含50 mg·L-1卡那霉素的MS培養(yǎng)基中，22℃培養(yǎng)1周后，挑選正常萌發(fā)的陽性植株移栽到含泥炭土、蛭石(體積比為1∶3)的營養(yǎng)缽中，培養(yǎng)管理至收種獲得T1代。利用法抽提10株T1代植株葉片基因組DNA，利用NPTII特異引物進(jìn)行PCR檢測。每個(gè)株系單獨(dú)收種子獲得T2代，將T2代種子播種在卡那霉素抗性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7～10 d，用鑷子選取生長正常的綠苗，用水輕洗以洗掉根上的培養(yǎng)基，移栽到營養(yǎng)缽后澆定根水，成活苗用于下一步研究。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)檢測 取轉(zhuǎn)基因T2代陽性植株和野生型植株幼嫩葉片，用Trizol試劑盒(寶生物工程大連有限公司)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用Primer 3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)在線設(shè)計(jì)MeSDD1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)引物QP，引物序列見表1，以擬南芥基因AtACTIN(At3g18780)為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR技術(shù)檢測MeSDD1在野生型和轉(zhuǎn)基因株系中的相對表達(dá)水平，表達(dá)水平以2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性分析 以野生型和2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系OE-1和OE-2為材料，檢測葉片相對含水量、離體葉片失水率和氣孔密度，并進(jìn)行抗旱性鑒定。取擬南芥蓮座葉，稱量重量記為W，放入水中6 h后稱重記為Wt，然后烘干至一個(gè)恒定的重量，記為Wd，每個(gè)基因型設(shè)置3個(gè)重復(fù)。相對含水量=(W-Wd)/(Wt-Wd)×100%。

取擬南芥蓮座葉，將離體葉片置于濾紙上，葉背面朝上，每個(gè)基因型設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在光周期為16 h光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)。每隔1 h稱取葉片的重量，初始葉片重量記為M0，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測得的葉片重量記為Mn(n=1～8)。失水率=(M0-Mn)/M0×100%。

取野生型和2個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株倒數(shù)第3片葉進(jìn)行氣孔密度的檢測，具體方法參考文獻(xiàn)[17]。每個(gè)樣品至少拍10個(gè)不同的視野后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥播種在營養(yǎng)缽中后放入穴盤，統(tǒng)一管理，15 d后開始斷水處理，斷水14 d后觀察植株表型。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010和SPSS 11.5軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯SBT家族成員的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用Phytozome12(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫通過Blast獲得69個(gè)木薯SBT家族成員的CDS、氨基酸、轉(zhuǎn)錄本和基因組序列。利用MEGA5.0對56個(gè)擬南芥枯草桿菌蛋白酶和69個(gè)木薯SBT家族成員的氨基酸構(gòu)建進(jìn)化樹。根據(jù)同源性分析，可以將木薯SBT家族成員分成五大類(I～V)，I類為Manes.01G070400、Manes.01G070500、Manes.01G070600、Manes.01G167600、Manes.02G028900、Manes.06G020400、Manes.07G122300、Manes.10G021800、Manes.18G039300等9個(gè)，Ⅱ類為Manes.01G267200、Manes.05G175300、Manes.06G139800、Manes.16G104900等4個(gè)，Ⅲ類為Manes.02G030800、Manes.03G066700、Manes.08G023600、Manes.16G063100等4個(gè)，Ⅳ類為Manes.01G088700、Manes.01G158500、Manes.04G005200、Manes.04G146100、Manes.04G153100、Manes.05G041400、Manes.05G175400、Manes.06G013400、Manes.09G057300、Manes.09G072100、Manes.10G021400、Manes.10G021500、Manes.10G021600、Manes.10G021700、Manes.10G079600、Manes.11G010100、Manes.11G010200、Manes.12G067800、Manes.12G081800、Manes.13G059200、Manes.13G123200、Manes.14G157400、Manes.16G106100、Manes.18G039200、Manes.18G044300、Manes.17G027600等26個(gè)，V為Manes.01G069100、Manes.01G069200、Manes.01G167700、Manes.01G222700、Manes.02G029000、Manes02G011100、Manes.03G086500、Manes.04G074500、Manes.04G150200、Manes.04G153200、Manes.05G206600、Manes.05G206800、Manes.06G013200、Manes.06G013300、Manes.11G013600、Manes.11G018900、Manes.12G038100、Manes.13G039400、Manes.13G113900、Manes.14G164700、Manes.16G063000、Manes.16G094900、Manes.17G062600、Manes.18G010600、Manes.18G039000、Manes.S08900等26個(gè)。其中Manes.18G044300和擬南芥AtSDD1(AT1G04110.1)親緣關(guān)系較近(圖1)。因此，該基因被命名為MeSDD1。

注：紅色箭頭示木薯MeSDD1，綠色箭頭示擬南芥SDD1。Note: The red arrow represented MeSDD1, the green arrow represented AtSDD1.圖1 擬南芥和木薯SBT家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenic tree of Arabidopsis thaliana and cassava SBT family member

2.2 木薯SBT家族成員的染色體分布

基因組染色體定位結(jié)果表明，除了第15號染色體，木薯SBT家族成員在其他17條染色體上均有分布。第1號染色體分布最為密集，有12個(gè)SBT成員，Manes.S08900位于染色體末端；第2、第11和第13號染色體均有4個(gè)SBT成員；第3、第9和第17號染色體均只有2個(gè)SBT成員；第4和第10號染色體分別分布了6個(gè)SBT成員；第5、第6、第16和第18號染色體均有5個(gè)SBT成員；第7和第8號染色體均只有1個(gè)SBT成員；第12號染色體有3個(gè)SBT成員；第14號染色體有2個(gè)SBT成員(圖2)。

注：左邊的數(shù)字表示該染色體的大小，標(biāo)尺為Mb。Note: Left numbers represented size of the chromosome, scale is Mb.圖2 木薯SBT基因家族的染色體分布Fig.2 The chromosomal location of SBT members in cassava

進(jìn)一步分析表明，多數(shù)成員在染色體上呈緊密串聯(lián)分布，第1號染色體有5個(gè)SBT成員(Manes.01G069100～Manes.01G069200; Manes.01G070400～Manes.01G070600)呈串聯(lián)分布，第10號染色體有5個(gè)SBT成員(Manes.10G021400～Manes.10G021800)呈簇排列，第2、第4、第5、第6、第11、第16、第18號染色體均有2個(gè)成員緊密串聯(lián)，分別是Manes.02G28900和Manes.02G29000；Manes.04G153100和Manes.04G153200；Manes.05G175300和Manes.05G175400；Manes.06G013200和Manes.06G013300；Manes.11G010100和Manes.010200；Manes.16G063000和Manes.16G063100；Manes.18G039200和Manes.18G039300(圖2)。

2.3 木薯SBT家族成員基因結(jié)構(gòu)和保守域分析

為了更好地了解木薯SBT家族基因的結(jié)構(gòu)特征，依據(jù)進(jìn)化樹(圖3-A)對外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，Manes.18G044300(MeSDD1)等22個(gè)成員沒有內(nèi)含子，6個(gè)成員只有1個(gè)內(nèi)含子，2個(gè)成員有2個(gè)內(nèi)含子，2個(gè)成員有3個(gè)內(nèi)含子，Manes.063000和Manes.029000分別有4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)內(nèi)含子，4個(gè)成員含有7個(gè)內(nèi)含子，7個(gè)成員含有8個(gè)內(nèi)含子，13個(gè)成員含有9個(gè)內(nèi)含子，11個(gè)成員含有10個(gè)內(nèi)含子。多數(shù)外顯子數(shù)目相似成員聚為一類(圖3-B)。

注: A: 進(jìn)化樹分析; B: 基因結(jié)構(gòu)分析; C: 保守模體分析。Note: A: Evolutional tree analysis. B: Gene structure analysis. C: Conserved motif analysis.圖3 木薯SBT家族基因結(jié)構(gòu)和保守域分析Fig.3 Cassava SBT genes structural distribution and conserved protein motifs

木薯SBT家族成員共含有10個(gè)模體，其中保守結(jié)構(gòu)域?yàn)槟ｓw1、模體2、模體4、模體5和模體7。Manes.04G153100只含有模體1，Manes.16G063100和Manes.02G011100只含有模體7；5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域基本均勻分布于57個(gè)SBT成員中(圖3-C)。保守域基序的序列如圖4所示。

圖4 木薯SBT家族蛋白質(zhì)的10個(gè)模體基序的Logo展示Fig.4 Logo display of the ten conserved motifs of cassava SBT family proteins

2.4 木薯SBT基因家族啟動子元件分析

為了進(jìn)一步了解該基因家族成員的功能，對啟動子上的順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測分析。結(jié)果表明，該基因家族成員含有光反應(yīng)Box和多種激素類響應(yīng)元件如ABRE(脫落酸響應(yīng)元件，TACGTG)、AuxRR-core(生長素響應(yīng)元件，GGTCCAT)、轉(zhuǎn)錄因子GT1的結(jié)合位點(diǎn)(GGTTAA/TTAACC)、P-box(赤霉素響應(yīng)元件，CCTTTTG)、MBS(干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件，CAACTG)、MYB(V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，V-myb禽成髓細(xì)胞病病毒癌基因同源物)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(CAACCA)和MYC[vmyc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian)，V-myc髓細(xì)胞組織增生病毒癌基因同源物(鳥類)]轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(CAATTG)(表2)。

表2 SBT家族基因啟動子順式作用元件及功能Table 2 Function and cis-acting elements existed in promoters of the SBT family genes

2.5 MeSDD1基因的克隆

MeSDD1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖5中箭頭所示，測序結(jié)果表明，該基因CDS全長為2 316 bp，編碼771個(gè)氨基酸。序列比對結(jié)果表明，MeSDD1與Manes.18G044300相似性為100%。

注: 左: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 右: MeSDD1的cDNA擴(kuò)增片段。Note: Left: DL 2000 marker. Right: cDNA amplification of MeSDD1.圖5 木薯MeSDD1的cDNA擴(kuò)增Fig.5 cDNA amplification of MeSDD1 in cassava

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株篩選鑒定

將pC2300S-MeSDD1通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得10個(gè)獨(dú)立的T1代轉(zhuǎn)基因材料，利用NPTII特異引物進(jìn)行PCR檢測，表明10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均為陽性(圖6)。每個(gè)株系單獨(dú)收種子獲得T2代，經(jīng)過卡那霉素抗性培養(yǎng)基篩選，隨機(jī)挑選2個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系OE-1和OE-2進(jìn)行qRT-PCR檢測。結(jié)果顯示，2個(gè)株系MeSDD1的表達(dá)量均顯著高于野生型(wildtype，WT)(圖7)。

注: M: DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); B: 空白對照; N: 陰性對照; P: 陽性對照; 1～10: MeSDD1轉(zhuǎn)基因株系。19ATK50: 目的片段與表達(dá)載體形成的重組質(zhì)粒。Note: M: DL 2000 marker. B: Blank control. N: Negative control. P: Positive control. 1～10: MeSDD1 transgenic lines. 19ATK50: The recombinant plasmid composed of the target fragment and the expression vector.圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代陽性株系的PCR鑒定Fig.6 PCR identification of positive T1 generation transgenic Arabidopsis thaliana lines

注: 不同小寫字母表示在P<0.05水平有顯著性差異。下同。Note: Different lowercase letters represent significant different at 0.05 level. The same as following.圖7 轉(zhuǎn)基因株系中MeSDD1的表達(dá)量Fig.7 Transcript level of MeSDD1 in transgenic lines

2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱生理指標(biāo)鑒定

由圖8可知，轉(zhuǎn)基因株系的葉片相對含水量顯著大于野生型(圖8-A)。轉(zhuǎn)基因株系的葉片失水率小于野生型(圖8-B)。轉(zhuǎn)基因株系的氣孔密度顯著低于野生型(圖8-C)。

注: A: 野生型和轉(zhuǎn)基因株系的相對含水量; B: 離體葉片失水率; C: 氣孔密度。Note: A: The relative water content of wide type and transgenic lines. B: Water loss percentage of detached leaves. C: Stomatal density.圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱生理指標(biāo)鑒定Fig.8 Characteristics of physiology index of drought resistance of transgenic Arabidopsis plants

2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱表型鑒定

野生型和轉(zhuǎn)基因植株有表型差異，野生型植株生長弱小，蓮座葉幾乎萎焉且接近死亡，只能觀察到少數(shù)花；轉(zhuǎn)基因植株生長高大旺盛，蓮座葉葉片生長旺盛，植株開花數(shù)量明顯比野生型多(圖9)。

圖9 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗旱性鑒定Fig.9 Identification of drought resistance of transgenic Arabidopsis plants

3 討論

SBT家族是一類龐大的基因家族，植物SBT家族基因不僅參與葉片氣孔形成，還參與果實(shí)成熟[18]、種子發(fā)育[19]、細(xì)胞程序性死亡[20]、植物與病原菌互作[21]。本研究從木薯基因組中鑒定到69個(gè)SBT成員，親緣關(guān)系相近的成員有相似的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)，接近1/3的成員沒有內(nèi)含子，這種差異可能是SBT基因在進(jìn)化過程中內(nèi)含子的獲得率與丟失率的差異導(dǎo)致的[22]。擬南芥與番茄中SBT基因同樣有大部分成員無內(nèi)含子[10]。內(nèi)含子的獲得與丟失與基因的進(jìn)化率相關(guān)[22]。例如，一些幾乎不含內(nèi)含子的基因(F-box基因家族、早期生長素響應(yīng)SAUR、DEAD box RNA解旋酶)通常在進(jìn)化中經(jīng)歷正向選擇[23]。由于內(nèi)含子處于不斷獲得與丟失的過程中，在一些基因家族中的分布不會完全一樣[24]。木薯SBT基因家族是否具有類似的效應(yīng)還需要進(jìn)一步研究。

木薯SBT家族基因在染色體上呈緊密串聯(lián)分布，如第10號染色體有5個(gè)SBT成員呈簇排列，結(jié)合這些成員的基因結(jié)構(gòu)，表明基因重復(fù)在SBT家族基因擴(kuò)張過程中發(fā)揮了重要作用，且在 SBT 家族基因擴(kuò)張過程中，伴隨了基因的亞功能化、新功能化及表達(dá)模式的改變。

在干旱脅迫條件下，植物為了減少水分散失，減少氣孔數(shù)量是最有效的途徑之一[17,25]。氣孔發(fā)育過程涉及一系列細(xì)胞分裂和連續(xù)的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。首先，原皮細(xì)胞分化為分生組織母細(xì)胞，經(jīng)歷不對稱分裂產(chǎn)生一個(gè)小的三角形細(xì)胞和一個(gè)大的姊妹細(xì)胞(氣孔線性細(xì)胞)。然后氣孔線性細(xì)胞分化成葉狀密生細(xì)胞。最后，分生組織轉(zhuǎn)變成圓形保衛(wèi)母細(xì)胞，單個(gè)保衛(wèi)母細(xì)胞對稱分裂生成一對保衛(wèi)細(xì)胞，形成氣孔[26-27]。該過程受到多個(gè)關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)[28]，其中SDD1作為重要的蛋白酶，通過催化底物形成信號物激活下游MAPK信號通路抑制下游3個(gè)負(fù)責(zé)保衛(wèi)細(xì)胞分化bHLH轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄控制細(xì)胞線性發(fā)育[12,29]。本研究結(jié)果表明，相對于野生型，35S啟動子驅(qū)動的MeSDD1過表達(dá)擬南芥植株葉片細(xì)胞產(chǎn)生了更多的信號物，導(dǎo)致氣孔發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)豐度增加，導(dǎo)致分化出的保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)量更少，進(jìn)而引起氣孔密度降低；MeSDD1轉(zhuǎn)基因植株相對含水量較野生型顯著增加，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的葉片失水率均小于野生型。綜上所述，MeSDD1轉(zhuǎn)基因植株通過減少氣孔密度減少水分散失增強(qiáng)了其對干旱脅迫的抗性。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法，在木薯全基因組水平鑒定到69個(gè)SBT成員，其中22個(gè)成員無內(nèi)含子，69個(gè)成員的蛋白均攜帶5個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，一些SBT成員在染色體上呈緊密的串聯(lián)分布，啟動子存在干旱響應(yīng)元件和植物生長發(fā)育有關(guān)的順式調(diào)控元件，其中Manes.18G044300(MeSDD1)與已報(bào)道的擬南芥SDD1基因親緣關(guān)系最近，且在擬南芥中過表達(dá)MeSDD1，可以增強(qiáng)植株的抗旱性。