葉水烽 高寧寧 陳魅瑤 曾海云 馬國華

(1 上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2 溫州科技職業(yè)學(xué)院(溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院) 浙南作物育種重點實驗室，浙江 溫州 325006；3 上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，上海 201106)

水稻(Oryzasativa)是全世界最重要的糧食作物之一，為快速增長的人口提供了近一半的主糧[1]。矮稈品種的培育和雜種優(yōu)勢的利用是水稻育種史上的兩次大跨越，為我國糧食生產(chǎn)做出了巨大貢獻(xiàn)[2]。長期以來，追求高產(chǎn)是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的首要任務(wù)，然而，以提高單位產(chǎn)量為目的的“高投入、高產(chǎn)出、高污染”生產(chǎn)模式對資源的需求巨大，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。2005年，我國科學(xué)家提出了“綠色超級稻”構(gòu)想和育種目標(biāo)：少打農(nóng)藥、少施化肥、節(jié)水抗旱、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)[3-4]。結(jié)合水稻種質(zhì)資源研究、功能基因組研究和分子輔助育種技術(shù)，科學(xué)家們培育出一系列綠色超級稻新品種，實現(xiàn)了資源節(jié)約型、環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)型[5]。

水稻在生長過程中需水量大，尤其在生育后期，缺水會導(dǎo)致減產(chǎn)乃至絕收[6]，因此培育節(jié)水抗旱的水稻品種十分緊迫。節(jié)水抗旱稻是指結(jié)合了水稻的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和旱稻的節(jié)水抗旱特性的新栽培稻品種類型[7-8]。在灌溉條件下，節(jié)水抗旱稻的產(chǎn)量、米質(zhì)與水稻基本持平，但對灌溉用水的需求不到水稻的一半；在缺乏灌溉條件的中低產(chǎn)田種植節(jié)水抗旱稻，可實現(xiàn)旱直播旱管、增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[9-11]。

除了受干旱影響，水稻生長中還經(jīng)常遭受蟲害的侵襲，其中鱗翅目害蟲每年給我國農(nóng)業(yè)造成高達(dá)近百億元的經(jīng)濟(jì)損失[12]。為了培育抗蟲水稻，科學(xué)家們對包括野生稻和栽培稻的水稻種質(zhì)資源進(jìn)行了篩選鑒定，目前已定位和克隆出水稻抗褐飛虱基因，并培育出了抗褐飛虱水稻品種[13]。然而目前，在水稻及其近緣種中還沒有發(fā)現(xiàn)二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲的抗性種質(zhì)資源，因此無法通過常規(guī)育種及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)等方式來培育抗蟲水稻新品種[14]。通過轉(zhuǎn)基因育種的手段增強(qiáng)水稻自身的抗蟲性，是解決上述問題的有效途徑。目前應(yīng)用最廣的方法是將源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的Bt基因轉(zhuǎn)入水稻，以培育抗蟲品種，使用較多的Bt基因主要有cry1Ab/Ac[15]、cry1Ab[16]、cry1Ac[17]、cry2AX1[18]等。通過密碼子優(yōu)化，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)林擁軍教授課題組獲得了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的能顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲性的抗蟲基因cry2A[19]和cry1C*[20-22]。

隨著Bt制劑或轉(zhuǎn)Bt基因作物的廣泛使用，害蟲在持續(xù)的高壓下會對Bt蛋白產(chǎn)生抗性，因此，延緩害蟲抗性發(fā)展是未來轉(zhuǎn)Bt基因作物商業(yè)化的重要課題，而利用多基因聚合策略是目前延緩害蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性的重要手段[23]。美國、澳大利亞、印度等國家主要種植含有cry1Ab/cry1Ac+cry1F、cry1Ac+cry2Ab等雙價抗蟲基因的轉(zhuǎn)基因棉花品種[24-26]。在水稻研究中，1999年第一例雙價的Bt(cry1Ac+cry2A)水稻誕生[27]，我國科學(xué)家又陸續(xù)創(chuàng)制了一系列雙價抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻新材料，為轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻提供了技術(shù)和材料保障[28-29]。

本研究利用華中農(nóng)大轉(zhuǎn)基因明恢63(T1C-19)和轉(zhuǎn)基因明恢63(T2A-1)兩個已經(jīng)通過環(huán)境釋放的成熟轉(zhuǎn)基因水稻材料為Bt基因供體，與節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系旱恢3號雜交，經(jīng)過多次回交和自交，通過大田農(nóng)藝性狀考察和自然條件抗性鑒定，獲得高抗螟蟲的新恢復(fù)系旱恢3CA，以期為后續(xù)雜交選育既節(jié)水抗旱又高抗螟蟲的新品種奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

cry1C*、cry2A基因供體材料分別為轉(zhuǎn)基因明恢63(T1C-19)和轉(zhuǎn)基因明恢63(T2A-1)水稻品種，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室林擁軍教授提供。節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系品種旱恢3號由上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 旱恢3CA的選育 以明恢63(T1C-19)和明恢63(T2A-1)為cry1C*基因、cry2A基因供體，分別與節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系旱恢3號雜交，田間噴施草丁膦(Basta)進(jìn)行抗性篩選，并進(jìn)行PCR和蛋白檢測篩選陽性植株，回交3代后自交1代獲得分別攜有cry1C*和cry2A基因的純合旱恢3號，而后進(jìn)行雙Bt基因聚合雜交，回交3代后自交4次獲得純合的雙價純合抗蟲材料，命名為旱恢3CA，每世代進(jìn)行取樣，并進(jìn)行cry1C*基因和cry2A的PCR檢測及田間噴施Basta抗性篩選。具體選育流程見圖1。

圖1 旱恢3CA恢復(fù)系的選育流程Fig.1 Breeding of restore line Hanhui 3CA

1.2.2 田間Basta抗性篩選 分蘗初期，配制終濃度為0.3%的Basta直接在田間噴施轉(zhuǎn)育水稻植株，葉片變黃甚至死亡的為陰性植株，不受影響的為陽性植株。

1.2.3 轉(zhuǎn)育植株的PCR鑒定 利用CTAB法提取水稻基因組DNA作為擴(kuò)增模板。根據(jù)cry1C*和cry2A基因的序列信息設(shè)計引物，引物序列信息見表1。PCR反應(yīng)體系為20 μL：DNA 模板30～50 ng，10× buffer 2.0 μL，2 mmol·L-1dNTP 1.0 μL，25 mmol·L-1MgCl21.0 μL，10 μmol·L-1引物(F/R)各0.2 μL，Taq酶1個單位，加滅菌ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳后置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察條帶。

表1 Bt 基因的引物序列信息Table 1 Primer sequence of Bt genes

1.2.4 Cry1C*和Cry2A蛋白的定性和定量檢測 Bt蛋白的定性檢測采用武漢上成生物科技有限公司的Cry1C和Cry2A膠體金試紙條。取分蘗期新鮮葉片，加緩沖液碾磨出汁，取500 μL碾磨液置于1.5 mL離心管，將膠體金試紙條插入液體中，3～5 min后讀取結(jié)果，有質(zhì)控線和檢測線雙條線即為陽性植株。Bt蛋白的定量測定采用EnvironLogix公司(美國)的ELISA檢測試劑盒(QualiplateTMkit for Cry1Ab/Cry1Ac)，樣品的制備、酶聯(lián)免疫反應(yīng)及OD值的測定，均嚴(yán)格按照試劑盒的使用說明書進(jìn)行。

1.2.5 農(nóng)藝性狀考察 在正常大田水肥、防治螟蟲(打藥)管理下，每個小區(qū)各種植6行旱恢3CA和旱恢3號，每行8株，共48個單株，3次重復(fù)，每個重復(fù)隨機(jī)取10個單株，對株高、單株有效穗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重及單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀進(jìn)行考察。

1.2.6 田間自然條件下的抗蟲性鑒定 在上海市青浦區(qū)白鶴鎮(zhèn)、海南省陵水縣光坡鎮(zhèn)上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因基地內(nèi)，種植旱恢3CA和旱恢3號水稻，進(jìn)行除防治螟蟲外的正常水肥及病蟲害管理，觀察植株的卷葉和白穗情況。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用t測驗法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交選育過程的Basta抗性和PCR陽性檢測

因T1C-19和T2A-1均含有bar基因，因此，在選育過程中，對水稻植株噴施0.3%的Basta。含有cry1C*或cry2A的雜交后代會表現(xiàn)出Basta抗性，生長不受影響；而不含外源bar基因的植株會發(fā)黃直至死亡(圖2-A)。 對存活的植株進(jìn)行PCR檢測，只有同時含有cry1C*和cry2A兩個基因的后代，電泳檢測結(jié)果才會同時含有799和600 bp 2條目標(biāo)帶，含單基因的植株則只能擴(kuò)增出799或600 bp的1條帶(圖2-B)。

2.2 雜交選育過程的Cry1C*和Cry2A蛋白定性檢測

根據(jù)PCR檢測結(jié)果，對同時含有cry1C*和cry2A基因的轉(zhuǎn)育植株進(jìn)行Bt蛋白定性檢測，陰性植株只顯示1條質(zhì)控線，陽性植株同時顯示質(zhì)控線和檢測線(圖3)，每一代保留Cry1C*和Cry2A蛋白雙陽性植株進(jìn)行回交及自交。

注：左為陰性植株，只顯示質(zhì)控線；右為陽性植株，質(zhì)控線和檢測線均有。Note: Left: Only one quality control line in negative plants. Right: Both quality control line and detection line in positive plants.圖3 水稻植株Cry1C*(A)和Cry2A(B)蛋白的陽性檢測Fig.3 Positive detection of Cry1C*(A) and Cry2A(B) protein in rice plant

2.3 旱恢3CA的Cry1C*和Cry2A蛋白的定量測定

在分蘗期，采用ELISA試劑盒，分別以T1C-19和T2A-1為對照，對旱恢3CA的Cry1C*和Cry2A蛋白進(jìn)行測定。由圖4可知，旱恢3CA中葉片和莖稈中的Cry1C*蛋白含量分別為1.93 μg·g-1FW和0.11 μg·g-1FW，T1C-19葉片和莖稈中的Cry1C*蛋白含量分別為2.64 μg·g-1FW和0.17 μg·g-1FW，表明cry1C*基因成功轉(zhuǎn)入旱恢3號并正常表達(dá)，新材料旱恢3CA葉片中Cry1C*蛋白含量顯著低于親本(P<0.05)。對旱恢3CA中的Cry2A蛋白含量進(jìn)行定量檢測，結(jié)果顯示，葉片和莖稈中的Cry2A蛋白含量分別為62.65 μg·g-1FW和4.07 μg·g-1FW，而親本T2A-1葉片和莖稈中的Cry2A蛋白含量分別為62.68 μg·g-1FW 和3.97 μg·g-1FW。無論在葉片還是莖稈中，旱恢3CA的Cry2A蛋白含量與親本T2A-1相比均無顯著差異。

注：*表示旱恢3CA和T1C-19在P<0.05水平存在顯著差異。Note: * indicates significant difference at 0.05 level between Haihui 3CA and T1C-19 materials.圖4 水稻旱植株的Cry1C*和Cry2A蛋白含量測定結(jié)果Fig.4 Determination of Cry1C*and Cry2A protein content of leaves and stems in rice plants

2.4 正常打藥條件下的旱恢3CA和母本旱恢3號的農(nóng)藝性狀比較

在正常水肥管理和打藥條件下，旱恢3CA和旱恢3號的生育期無明顯差異，且在株高、單株有效穗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重及單株產(chǎn)量均無顯著差異(P>0.05，表2)，表明經(jīng)過多代回交后，Cry1C*和Cry2A蛋白的轉(zhuǎn)入對旱恢3號的農(nóng)藝性狀無顯著影響。

表2 旱恢3CA和旱恢3號的主要農(nóng)藝性狀比較Table 2 Agronomic traits of Hanhui 3CA and Hanhui No 3

2.5 田間自然條件下的抗蟲性鑒定

在保證正常水肥，全生育期不防治螟蟲的大田管理條件下，雙價抗蟲材料旱恢3CA表現(xiàn)出對稻縱卷葉螟的高抗性，分蘗期葉片正常，未見卷葉，成熟期也未有白穗出現(xiàn)；而對照品種旱恢3號在分蘗期有83.2%的植株受到稻縱卷葉螟為害，葉片內(nèi)卷，且有肉眼可見的白絲、蟲糞或有長短不一的條狀白斑(圖5-A、B)。在成熟期旱恢3CA無白穗，而30.2%的旱恢3號植株有白穗出現(xiàn)(圖6-A、B)。剝開莖稈觀察，旱恢3CA的莖稈光滑，無缺口和蟲糞，而被卷葉螟為害的旱恢3號植株莖稈有明顯的咬口，莖稈內(nèi)有蟲糞(圖6-C、D)。

注：A：旱恢3號卷葉細(xì)節(jié)圖；B：旱恢3號(左)和旱恢3CA(右)植株在分蘗期的田間抗性表現(xiàn)。Note: A: The details of Hanhui No 3 plant rolled leaf. B: The field resistance performance between Hanhui No 3 (left) and Hanhui 3CA (right) plants at tillering stage.圖5 恢復(fù)系在田間的抗蟲性表現(xiàn)Fig.5 Insect resistance of rice restorer lines under field

注：A、B分別為旱恢3CA和旱恢3號植株成熟期的田間抗性表現(xiàn)；C、D為旱恢3CA(左)和旱恢3號(右)植株莖稈比較。Note: A and B showed the field resistance performance of Hanhui 3CA and Hanhui No 3 plants at maturity, respectively. C and D showed the comparison of stems between Hanhui 3CA (left) and Hanhui No 3 (right).圖6 旱恢3CA和旱恢3號成熟期植株在田間的抗蟲性表現(xiàn)Fig.6 Insect resistance of Hanhui 3CA and Hanhui No 3 at maturity under field

3 討論

現(xiàn)階段在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，害蟲防治主要采用農(nóng)藥噴施方法，不利于環(huán)境保護(hù)和人類健康。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用Bt基因創(chuàng)制培育抗蟲水稻新材料的技術(shù)已經(jīng)十分成熟。然而，根據(jù)Bt棉商業(yè)化結(jié)果顯示，單價的Bt基因作物的大面積推廣種植，減少了化學(xué)殺蟲劑的使用，但同時迫使靶標(biāo)害蟲長時間處于單一的選擇壓力下，容易導(dǎo)致害蟲抗性種群的產(chǎn)生[30-31]。

T1C-19和T2A-1分別攜帶cry1C*和cry2A基因，特異毒殺水稻鱗翅目蟲，效果顯著。為延緩螟蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性，本研究將cry1C*和cry2A基因同時導(dǎo)入節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系旱恢3號，獲得雙價聚合抗蟲新材料旱恢3CA，在分蘗期，旱恢3CA的Cry1C*蛋白含量較T1C-19有所下降，推測可能與Ubiquitin啟動子的同源性有關(guān)。因為T1C-19和T2A-1兩個供體材料中的cry1C*和cry2A基因均由Ubiquitin啟動子驅(qū)動，可能會引起基因沉默，與前人研究結(jié)果一致[29]。分子標(biāo)記輔助選擇主要通過PCR技術(shù)對導(dǎo)入基因進(jìn)行鑒定，但由于PCR技術(shù)過于靈敏，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此，在PCR初期篩選的基礎(chǔ)上，采用Bt試紙條進(jìn)行陽性復(fù)核，提高了目標(biāo)植株的篩選準(zhǔn)確度。挑選與輪回親本長勢相似的陽性材料進(jìn)行回交，在選育流程中進(jìn)行全生育期不打藥管理，剔除出現(xiàn)蟲斑、白穗的植株，加速了選育材料純合[32]。通過農(nóng)藝性狀鑒定，旱恢3CA和輪回親本無顯著差異，可直接用于組合配制。

4 結(jié)論

本研究以T1C-19和T2A-1為供體，分別獲得含cry1C*基因的旱恢3號和含cry2A基因的旱恢3號中間材料，進(jìn)一步通過雜交選育，獲得雙價Bt基因聚合新材料。通過田間自然條件下的抗蟲性鑒定，選育出對稻縱卷葉螟具有高度抗性的水稻新材料旱恢3CA，其基本農(nóng)藝性狀與輪回親本旱恢3號無顯著差別，為培育既節(jié)水抗旱又高抗螟蟲的水稻品種奠定了材料基礎(chǔ)。