孔 錦，胡東玉，孫 謙，馮 蕾

濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.腫瘤科；2.靜脈用藥調(diào)配中心；3.藥劑科，山東濟寧 272000

彌漫大 B 細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是最常見的B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤(NHL)，具有較強的異質(zhì)性和侵襲性。近年來DLBCL的治療取得了較大進(jìn)步，由環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松組成的標(biāo)準(zhǔn)化療及利妥昔單抗靶向治療等方案使DLBCL的治療效果明顯改進(jìn)，盡管如此，仍有30%～40%的患者復(fù)發(fā)并最終死亡[1-2]。因DLBCL的異質(zhì)性，其發(fā)病機制尚未完全闡明，臨床上也缺乏評估病情及預(yù)后的分子標(biāo)志物。SENEX基因是新發(fā)現(xiàn)的一類促癌基因，DLBCL相關(guān)的細(xì)胞實驗證實，沉默SENEX基因能夠抑制DLBCL細(xì)胞中Rb/E2F1通路介導(dǎo)的增殖效應(yīng)[3]?；诖耍狙芯繉⒁訢LBCL患者為對象，分析SENEX基因表達(dá)與Rb/E2F1通路及預(yù)后的關(guān)系，旨在為闡明SENEX在DLBCL發(fā)病中的作用及機制積累臨床研究數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年1月至2019年12月本院收治的84例DLBCL患者作為DLBCL組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)確診DLBCL[4]；(2)首次確診；(3)臨床病理資料完整；(4)臨床樣本按要求保存。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受過放化療；(2)既往有其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病病史。參照王靜等[5]的研究，選擇在本院診斷為淋巴結(jié)反應(yīng)性增生的40例患者作為對照組。DLBCL組中男44例、女40例，年齡16～85歲、平均(59.44±11.32)歲；對照組中男22例、女18例，年齡23～75歲、平均(57.23±10.06)歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)、取得患者知情同意。

1.2SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平的檢測 取DLBCL組的腫瘤組織及對照組的淋巴結(jié)組織適量，加入組織裂解液并勻漿，得到的勻漿液在離心機中按照條件4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液進(jìn)行Western blot檢測：首先在聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)電泳分離不同相對分子質(zhì)量的蛋白，而后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，將膜放入5%脫脂牛奶中室溫孵育1 h，洗膜后放入SENEX一抗(美國Abcam公司，1∶1 000稀釋)、pRb一抗(美國CST公司，1∶1 000稀釋)、E2F1一抗(美國Abcam公司，1∶1 000稀釋)或β-actin一抗(美國Abcam公司，1∶5 000稀釋)中、4 ℃孵育，洗膜后放入1∶2 000稀釋的二抗中室溫孵育1 h，在凝膠分析系統(tǒng)(上海天能公司)中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值、以β-actin為內(nèi)參對SENEX、pRb、E2F1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.3DLBCL患者臨床病理特征的記錄 查閱DLBCL患者的病歷資料，記錄以下臨床病理特征：年齡、性別、腫瘤最大徑、B癥狀、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)、GCB亞型、Ann Arbor分期。

1.4DLBCL預(yù)后的隨訪 采用門診復(fù)診、電話或網(wǎng)絡(luò)回訪的方式對DLBCL的預(yù)后進(jìn)行隨訪，隨訪終點為死亡，隨訪截止時間為2021年3月31日。

2 結(jié) 果

2.1DLBCL組與對照組SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平的比較 與對照組比較，DLBCL組患者腫瘤組織中SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 DLBCL組與對照組SENEX、pRb、E2F1表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

表1 DLBCL組與對照組SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平的比較

2.2DLBCL組中不同臨床病理特征患者SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平的比較 DLBCL組中不同年齡、性別、GCB亞型的患者，腫瘤組織中SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；腫瘤最大徑≥5 cm、有B癥狀、IPI為3～5、Ann Arbor分級為Ⅲ～Ⅳ級的患者腫瘤組織中SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平均高于腫瘤最大徑<5 cm、無B癥狀、IPI為0～2、Ann Arbor分級為Ⅰ～Ⅱ級的患者(P<0.05)。見表2。

表2 DLBCL組中不同臨床病理特征患者SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平的比較

續(xù)表2 DLBCL組中不同臨床病理特征患者SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平的比較

2.3DLBCL組SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平的相關(guān)性 DLBCL組患者腫瘤組織中SENEX的表達(dá)水平與pRb、E2F1的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.553、0.236，P<0.05)；pRb的表達(dá)水平與E2F1的表達(dá)水平也呈正相關(guān)(r=0.442，P<0.05)。見圖2。

注：A為SENEX表達(dá)水平與pRb表達(dá)水平的相關(guān)性分析；B為SENEX表達(dá)水平與E2F1表達(dá)水平的相關(guān)性分析；C為pRb表達(dá)水平與E2F1表達(dá)水平的相關(guān)性分析。圖2 DLBCL組SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平的相關(guān)性

2.4DLBCL組中不同SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平患者預(yù)后的比較 DLBCL組中不同SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平患者累積生存率的K-M曲線見圖3，經(jīng)Log-rank檢驗，SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平≥中位數(shù)患者的累積生存率均低于SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平<中位數(shù)的患者(P<0.05)。

注：A為SENEX不同表達(dá)水平患者的累積生存率；B為pRb不同表達(dá)水平患者的累積生存率；C為E2F1不同表達(dá)水平患者的累積生存率。圖3 DLBCL組中不同SENEX、pRb、E2F1表達(dá)水平患者預(yù)后的比較

3 討 論

DLBCL被認(rèn)為是一種侵襲性淋巴瘤，具有較強的異質(zhì)性，形態(tài)學(xué)及免疫分型復(fù)雜且發(fā)病的分子機制未完全闡明。目前，治療DLBCL的方案包括環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松化療及利妥昔單抗靶向治療，但部分患者容易出現(xiàn)耐藥、預(yù)后不佳，相關(guān)的流行病學(xué)資料顯示DLBCL的5年生存率為30%～40%[6-7]。因此，研究DLBCL的發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)DLBCL發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用的基因，不僅有助于發(fā)現(xiàn)疾病早期診斷、病情評估的分子標(biāo)志物，也有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。

近年來，越來越多的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)了不同基因表達(dá)異常與DLBCL的發(fā)病有關(guān)[5,8]，完顏智翔等[3]通過細(xì)胞實驗證實SENEX基因參與DLBCL細(xì)胞增殖的調(diào)控，敲低SENEX基因顯著抑制DLBCL細(xì)胞增殖。SENEX是參與細(xì)胞生長、衰老、增殖、凋亡調(diào)控的新型基因，LOVELACE等[9]在內(nèi)皮細(xì)胞中證實，SENEX定位于微管、通過維持微管穩(wěn)定性的方式促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長。另有兩項細(xì)胞實驗均證實SENEX參與DLBCL細(xì)胞增殖的調(diào)控[10-11]。本研究在上述細(xì)胞實驗中SENEX基因促增殖的基礎(chǔ)上以DLBCL患者為對象，分析了SENEX基因在DLBCL發(fā)病中的作用，結(jié)果顯示，與對照組比較，DLBCL組織中SENEX的表達(dá)水平明顯升高并且隨著腫瘤最大徑、IPI、Ann Arbor分級增加及B癥狀的出現(xiàn)，SENEX的表達(dá)水平呈升高的趨勢，表明SENEX表達(dá)增加與DLBCL的發(fā)病及病理進(jìn)展有關(guān)，其可能機制是高表達(dá)的SENEX促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖。

根據(jù)完顏智翔等[3]的細(xì)胞實驗結(jié)果，SENEX促進(jìn)DLBCL細(xì)胞增殖的分子機制是激活下游Rb/E2F1通路。Rb/E2F1是經(jīng)典的細(xì)胞周期調(diào)控通路，Rb通過磷酸化和去磷酸化的方式調(diào)控下游E2F1的激活，去磷酸化的Rb與E2F1結(jié)合并阻礙E2F1發(fā)揮生物學(xué)作用，Rb磷酸化為pRb后與E2F1解離，E2F1通過激活細(xì)胞周期蛋白的方式促進(jìn)細(xì)胞生長[12-13]。為了進(jìn)一步驗證SENEX在DCBCL發(fā)病中的作用，本研究對SENEX下游Rb/E2F1通路進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DCBCL中Rb/E2F1通路的表達(dá)與SENEX表達(dá)的變化一致，即DLBCL組織中pRb、E2F1的表達(dá)增加且與病理進(jìn)展有關(guān)；相關(guān)性分析證實，SENEX的表達(dá)與pRb、E2F1的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。以上結(jié)果表明SENEX下游Rb/E2F1通路的激活與DCBCL的發(fā)病及病理進(jìn)展有關(guān)，高表達(dá)的SENEX可能在DLBCL的發(fā)病中通過激活Rb/E2F1通路發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

DLBCL患者的預(yù)后不佳，目前的臨床研究認(rèn)為IPI、Ann Arbor分級等病理特征是DLBCL患者預(yù)后的獨立影響因素[14-16]。本研究已經(jīng)在DLBCL中證實SENEX基因及其下游Rb/E2F1通路與疾病進(jìn)展有關(guān)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析其與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系，隨訪DLBCL患者的生存情況并通過K-M曲線比較累積生存率的差異可知，DLBCL中SENEX、pRb、E2F1表達(dá)增加與累積生存率降低有關(guān)，由此表明SENEX及其下游Rb/E2F1通路不僅與DLBCL的發(fā)病及病理進(jìn)展有關(guān)，還與疾病的預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，DLBCL中SENEX基因表達(dá)增加與疾病進(jìn)展及預(yù)后不良有關(guān)，激活下游Rb/E2F1通路是SENEX發(fā)揮作用的可能分子機制。SENEX有望成為發(fā)現(xiàn)DLBCL評估標(biāo)志物、治療靶點的新基因，而且有必要以SENEX基因為切入點研究DLBCL發(fā)病的分子機制。