湯木果，汪玉蘭，趙存朝,2，陶亮,2*，田洋,2,3

（1.云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明 650201）（2.食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南昆明 650201）（3.云南省藥食同源功能食品工程研究中心，云南昆明 650201）

澳洲堅果（Macadamia integrifolia）為山龍眼科，屬于常綠喬木樹種，有“世界堅果之王”、“堅果皇后”的美譽[1]。澳洲堅果原產(chǎn)于澳大利亞昆士蘭與新南威爾士的亞熱帶雨林，二十世紀六七十年代開始引入我國。澳洲堅果含有大量的脂肪外，還含有豐富的蛋白質（17種氨基酸）、碳水化合物、微量元素[2]及少量的B族維生素等營養(yǎng)成分，屬高檔干果，富含熱能，不含膽固醇[3,4]，同時具有調節(jié)血脂、控制血糖平衡、預防血栓以及益智作用[5]，非常適合老年人及血脂偏高的人群食用[6]。截止2017年底，我國澳洲堅果種植面積為282萬畝，產(chǎn)量為1.72萬t，而云南省澳洲堅果種植面積為262萬畝，占全球澳洲堅果種植面積（約460萬畝）的一半以上，占全國種植面積的九成多，產(chǎn)量1.6萬t[3]。目前我國很多種植的澳洲堅果未到豐產(chǎn)期，一旦到豐產(chǎn)期，產(chǎn)量會迅速增加。現(xiàn)階段我國澳洲堅果主要以干果為主，產(chǎn)品較單一，精深加工不足，市場消耗量低，嚴重制約澳洲堅果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

傳統(tǒng)酸奶都是以牛乳為原料[7]，而澳洲堅果酸奶是以純植物基成分為原料，添加菌種，采用生物發(fā)酵工藝以“植物蛋白”替換“動物蛋白”為原料制作的發(fā)酵乳[8]。澳洲堅果具不僅有較高的營養(yǎng)價值，而且還具有一定的藥用價值[9]，以澳洲堅果為原料開發(fā)酸奶，不僅可以豐富澳洲堅果制品的產(chǎn)品種類，同時可滿足當代人對于健康與營養(yǎng)新產(chǎn)品的需求。相較于傳統(tǒng)酸奶，澳洲堅果酸奶具有高蛋白、易消化、不含膽固醇等優(yōu)點，且適合血脂偏高的人飲用。目前，國內外已有利用植物蛋白進行部分或完全替代乳蛋白產(chǎn)品開發(fā)的研究，但以澳洲堅果作為酸奶原料的研究未見相關報道。本研究以澳洲堅果仁為主要原料，研發(fā)一款澳洲堅果植物基酸奶新產(chǎn)品，結合澳洲堅果的營養(yǎng)成分與酸奶的營養(yǎng)，不僅賦予酸奶更好的營養(yǎng)物質，也為澳洲堅果的應用提供一個新方向，進一步拓寬澳洲堅果開發(fā)利用渠道和酸奶的市場。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳洲堅果，臨滄市恒豐種植開發(fā)有限公司；蔗糖，南寧糖業(yè)股份有限公司；Mild 1.0菌種、R-704菌種、R-707菌種，科漢森菌種生物科技公司；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、植物乳桿菌P-8、植物乳桿菌PYS-010，光明乳業(yè)研究院。

1.2 儀器與設備

JM-85膠體磨，常州華奧儀器制造有限公司；DHP-500電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；HJJ-6水浴恒溫電動攪拌器，常州華奧儀器制造有限公司；SVJ-358智能商用型酸奶機，北京世紀陽光有限公司；NDJ-8S旋轉式黏度計，河南精邁儀器儀表有限公司；pHS-3C雷磁pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；YP5001電子分析天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；60-6S高壓均質機，上海東華高壓均質機廠；TA-10型質構儀（硬度），濟南賽成電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝設計

（1）工藝流程：

澳洲堅果仁→清洗及浸泡→打漿→過濾去渣→磨漿→堅果乳→配料→加熱→均質→殺菌→接種發(fā)酵→堅果酸奶

（2） 操作要點：

①清洗及浸泡：將澳洲堅果仁置于25 ℃蒸餾水中，按1:5浸泡16 h，備用。

②加熱：在65～75 ℃下加熱10 min，過60目篩進行均質。

③均質：采用二次均質對澳洲堅果乳進行均質，先在20 MPa均質壓力下均質5 min；再在40 MPa的更高壓強下均質10 min。

④殺菌：在75～80 ℃條件下殺菌15 min，既要保證充分殺菌，又不能影響澳洲堅果酸奶的質地及風味。

⑤接種發(fā)酵：接種按設定復配菌種發(fā)酵液，按設定溫度下發(fā)酵一定時間，促進澳洲堅果酸奶的形成及產(chǎn)酸產(chǎn)香。

⑥后熟：澳洲堅果酸奶發(fā)酵結束后，在4 ℃條件下冷藏后熟24 h，進一步后熟產(chǎn)酸產(chǎn)香，完善酸奶的風味和滋味。

1.3.2 菌種篩選及菌種復配比例的確定

以感官評分及酸度為指標，對直投式乳酸菌種進行篩選及菌種復配比例的確定。

1.3.3 單因素試驗及響應面優(yōu)化試驗

以感官評分為分析指標，考察料液比、發(fā)酵時間（h）、發(fā)酵溫度（℃）、蔗糖添加量（%）對澳洲堅果酸奶的影響；料液比參數(shù)是工業(yè)生產(chǎn)中重要參數(shù)，考慮加工成本、設備及產(chǎn)品特性穩(wěn)定的需要，要求在單因素試驗中完成料液比的確定，其他相關參數(shù)優(yōu)化需要圍繞既定的料液比參數(shù)展開進一步研究。因此后期優(yōu)化試驗以發(fā)酵時間（h）、發(fā)酵溫度（℃）和蔗糖添加量（%）為自變量，以感官評分為響應值，通過響應面試驗優(yōu)化澳洲堅果酸奶最佳工藝配方。澳洲堅果酸奶優(yōu)化試驗因素與水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平 Table 1 Response surface test factor level

1.3.4 產(chǎn)品質量

1.3.4.1 感官評定

選擇10名專業(yè)人士組成評定小組對澳洲堅果酸奶的感官特性進行評估。在色澤（20分）、組織狀態(tài)（20分）、滋味（30分）、氣味（30分）四個方面進行感官評定。其感官評分標準見表2。

表2 澳洲堅果酸奶感官評定標準 Table 2 Sensory evaluation standard of macadamia nut yogurt

1.3.4.2 產(chǎn)品理化指標測定

（1）組織特性

①持水性測定

參考熊政委等[10]方法并稍作修改。取20 mL堅果酸奶放入離心管。離心管質量為M1，加入澳洲堅果酸奶后的總質量為M2，4000 r/min，離心10 min，靜置10 min，去除上清液后，剩余質量為M3。持水性計算公式：

式中：

M1——離心管質量；

M2——澳洲堅果酸奶總質量；

M3——去除上清液后剩余質量。

②黏度的測定：在常溫條件下，根據(jù)旋轉式黏度計的說明書來進行測定3次，最終結果取平均值。

③硬度的測定：在常溫條件下，采用TA-10型質構儀，直徑為13 mm的TA-10探頭測定澳洲堅果酸奶的硬度，使用校正后的質構儀直接測定3次，最終結果取平均值。測定條件為：測試速度為1.0 mm/s，返回速度為1.0 mm/s，循環(huán)次數(shù)為3次，探頭進入距離為10 mm，壓縮之間停留時間為10 s。

（2）常規(guī)理化

①蛋白質含量：參照GB 5009.5-2016《凱氏定氮法》的方法測定[11]；

②脂肪含量：參照GB 5009.6-2016《索氏抽提法》的方法測定[12]；

③酸度測定：參照GB 5009.239-2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》中的方法進行測定[13]；

④pH測定：pH計校準后，重復測量澳洲堅果酸奶pH值，結果取平均值。

（3）脂肪酸測定

脂肪酸含量：參照GB 5009.168-2016《食品中脂肪酸的測定》的方法測定[14]。

1.3.4.3 微生物指標測定

乳酸菌數(shù)測定：參照GB 4789.35-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[15]；大腸桿菌測定：參照GB 4789.3-2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》[16]；致病菌數(shù)測定：參照GB 4789.18-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳與乳制品檢驗》；霉菌和酵母測定：參照GB 4789.15-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)》；菌落總數(shù)測定：參照GB/T 21732《食品安全國家標準含乳飲料》。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析采用Excel 2013、SPSS 24，利用Design-Expert 8.0.6進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 澳洲堅果酸奶發(fā)酵菌種的篩選

2.1.1 發(fā)酵菌種對澳洲堅果酸奶感官評分及酸度的影響

發(fā)酵菌種對酸奶的質量品質有至關重要的作用，對酸奶風味品質、組織形態(tài)均有重要影響[17]。本試驗選用8種不同菌種制作堅果酸奶，不同單一發(fā)酵菌種對酸奶的酸度、感官評分的影響如圖1a所示。從圖中可以看出，感官評分最高的菌種為保加利亞乳桿菌，達86.67分，酸度為65.86 °T，其次是Mild1.0菌種和嗜熱鏈球菌菌種，感官評分分別為81.77分、80.12分，其酸度分別為71.33 °T、70.45 °T，最終根據(jù)酸奶發(fā)酵的組織狀態(tài)、口感、風味、感官評分和酸度綜合分析篩選后，選定有較高的感官品質、口感及風味較好、酸度適宜的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌與Mild1.0按照1:1復配后發(fā)酵澳洲堅果酸奶。

從圖1b可以看出，三種澳洲堅果酸奶的感官評分存在一定的差異，表現(xiàn)為保加利業(yè)乳桿菌與嗜熱鏈球菌組具有最高的評分為85.50分，酸度為75.30 °T，該組澳洲堅果酸奶具有明顯的酸奶香味，酸甜適中，細膩濃稠，口感最佳；其次是保加利亞乳桿菌：Mild1.0，感官評分為75.80分，酸度為68.56 °T，最低的是Mild1.0：嗜熱鏈球菌，感官評分為70.85分，酸度60.32，該兩組澳洲堅果酸奶雖然風味較佳，但是口感相對較差。所以本研究以保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌作為復配發(fā)酵菌制作澳洲堅果酸奶。

2.1.2 菌種復配比例對澳洲堅果酸奶感官評分的影響

保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌是酸乳生產(chǎn)中常用的發(fā)酵劑[18]，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)單一菌種發(fā)酵的產(chǎn)酸能力較低、口感較差，而混合菌種發(fā)酵的產(chǎn)酸、口感優(yōu)于單一菌種，同時前人研究表明混合菌種能夠促使兩者之間互助合作，促進生長，具有協(xié)同關系[19]。由圖2可知，當保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌比例在1:2（0.33%:0.67%）時，感官評分最高，達到86.05分，酸度為72.11 °T，澳洲堅果酸奶呈現(xiàn)組織細膩，色澤均勻，酸甜適中，口感及風味較好，當菌種復配比例在3:1（0.75%:0.25%）時，感官評分為72.35分，酸度為50.96 °T，此時酸奶呈現(xiàn)酸味不足、甜度過高，主要是保加利亞乳桿菌產(chǎn)香，嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸，當菌種復配比例在1:3（0.25%:0.75%）時，感官評分為80.10分，酸度為75.02 °T，此時酸奶發(fā)酵過度，酸甜失調，口感差。因此，菌種復配比例為1:2（0.33%:0.67%）最佳。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 料液比對澳洲堅果酸奶感官評分的影響

在發(fā)酵溫度為41 ℃，發(fā)酵時間為7 h，蔗糖添加量為6%條件下，考察料液比對堅果酸奶的影響。由圖3可知，隨著澳洲堅果料液比的增大，澳洲堅果酸奶的感官評分呈先上升后下降趨勢，當料液比為1:3時，感官評分最高，達到83.90分。當料液比小于1:3時，與澳洲堅果充分混勻發(fā)酵后，含水量較低，所得到的澳洲堅果酸奶濃度較高，口感較差；當料液比大于1:3時，澳洲堅果的狀態(tài)變得過稀，澳洲堅果酸奶較淡，都不利于發(fā)酵，影響澳洲堅果整體的味道，影響感官評分指標。因此選擇最適澳洲堅果料液比為1:3。

2.2.2 發(fā)酵時間對澳洲堅果酸奶感官評分的影響

在發(fā)酵溫度為41 ℃，蔗糖添加量為6%，料液比為1:3條件下，考察發(fā)酵時間對堅果酸奶的影響。由圖4可知，澳洲堅果酸奶的感官評分在7 h時最高，此時酸奶表面凝固較好，呈乳白色，澳洲堅果酸奶味道醇香、酸甜適中、口感細膩、質地均勻，無乳清析出；酸奶發(fā)酵時間低于7 h時，酸奶發(fā)酵不完全，黏稠度低，質地偏軟，凝固性差，口感差；高于7 h，酸奶發(fā)酵過度，組織狀態(tài)不均勻，酸度增加，風味口感較差并伴有少量乳清析出。因此，確定發(fā)酵時間為7 h。

2.2.3 發(fā)酵溫度對澳洲堅果酸奶感官評分的影響

發(fā)酵溫度會影響發(fā)酵效率和感官品質。在發(fā)酵時間為7 h，蔗糖添加量為6%，料液比為1:3條件下，考察發(fā)酵溫度對澳洲堅果酸奶的影響。由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，澳洲堅果酸奶的感官評分呈先上升后下降趨勢，當發(fā)酵溫度達到41 ℃時，感官評分最高。而發(fā)酵溫度過低時出現(xiàn)凝乳不夠完全、產(chǎn)酸產(chǎn)香不足的問題，當發(fā)酵溫度為過高時，出現(xiàn)乳清析出、組織狀態(tài)變差、產(chǎn)生不愉快的氣味等。因此，最佳澳洲堅果酸奶發(fā)酵溫度為41 ℃。

2.2.4 蔗糖添加量對澳洲堅果酸奶感官評分的影響

由圖6可以看出，在其他因素一定的條件下，隨著蔗糖添加量的增加，感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當蔗糖添加量在6%時，感官評分最高，達到85.08分。蔗糖在酸奶中為菌種提供碳源、增加甜味、同時增加固形物，使酸奶口感更好，且體系較穩(wěn)定[20]。當蔗糖添加量低于7%時，酸甜味不足，香味不足，口感偏差，當蔗糖添加量超過7%，口感過甜，并且有少量刺激味產(chǎn)生。因此確定7%蔗糖是最優(yōu)添加量。

2.3 響應面試驗優(yōu)化結果

2.3.1 響應面試驗設計及結果分析

在單因素試驗基礎上，以發(fā)酵時間（h）X1、發(fā)酵溫度（℃）X2、蔗糖添加量（%）X3為自變量，以感官評分為響應值，利用響應面進行3因素3水平試驗設計，試驗方案及結果見表3，回歸分析見表4。

表3 響應面試驗結果 Table 3 Response surface test results

2.3.2 模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，得到二次多項式回歸方程：

方差分析結果見表4。

由表4方差分析可知，二次回歸模型的p＜0.0001 ＜0.01，表明回歸模型顯著；失擬性檢驗F值=2.21，p=0.2289＞0.05，失擬項不顯著，說明模型可以接受，即表明所選澳洲堅果酸奶感官評分二次回歸模型可用于預測設定的參數(shù)，即可用于評估酸奶的感官評分。模型的確定系數(shù)R2=0.9851，調整系數(shù)R2Adj=0.966，說明該模型具有較高的擬合及預測精度。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，能夠準確的分析和預測澳洲堅果酸奶感官評分，說明實驗操作可信度高，具有一定的實踐指導意義。由回歸系數(shù)顯著性表明，在所取因素水平范圍內，各因素對澳洲堅果酸奶感官評分影響的順序為：蔗糖添加量（X3）＞發(fā)酵溫度（X2）＞發(fā)酵時間（X1）。

2.3.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

根據(jù)此回歸方程，通過響應面法得到最優(yōu)澳洲堅果酸奶工藝條件為發(fā)酵溫度為41.50 ℃，發(fā)酵時間為7.50 h，蔗糖添加量為6.27%。此條件進行三次重復試驗，感官評分達到了89.16分，與模型預測結果接近，表明基于該響應面模型分析優(yōu)化感官評分的方法有效可行。

2.4 澳洲堅果酸奶的產(chǎn)品質量指標測定

2.4.1 澳洲堅果酸奶的理化及微生物指標

由表5可知，制備的澳洲堅果酸奶硬度為323.10 g，黏度為53.04 mPa·s，持水性為1.53%，pH值為3.91，酸度為76.12 °T，蛋白質含量達到4.98%，與市面上的酸奶相比，高于大部分酸奶蛋白質含量，是一種高蛋白的酸奶，脂肪含量為11.80%，主要成分為不飽和脂肪酸，且脂肪鏈較短，更易被人體消化吸收，不易在體內形成脂肪堆積[21]，并對人體具有較高的營養(yǎng)價值。乳酸菌活菌數(shù)為1.65×109CFU/g、大腸菌群、菌落總數(shù)、霉菌、酵母及致病菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌）均未檢出，符合國家標準。澳洲堅果本身就具有多種人體生長所必需營養(yǎng)物質且風味獨特，制備的澳洲堅果酸奶蛋白質含量高，同時具有不含膽固醇、高蛋白、易消化、風味佳等特點。

表5 澳洲堅果酸奶的理化及微生物指標 Table 5 Physicochemical and microbiological indexes of macadamia nut yogurt

2.4.2 澳洲堅果酸奶脂肪酸種類與相對含量

脂肪酸可分為不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸[22]。從表6可以看出，共檢測出脂肪酸成分為15種，主要為不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸具有降低冠心病的發(fā)生幾率、降血糖、調節(jié)血脂[23]及調節(jié)人體血液中膽固醇含量[4]等作用，常作為高端食品的輔料。澳洲堅果酸奶中不飽和脂肪酸含量達67.77%，含量最高的為油酸，油酸能保護脂蛋白免受氧化，從而保護動脈免受損傷，并具有保留好膽固醇的能力，被稱為“安全的脂肪酸”[24]，這使得澳洲堅果酸奶具有較高的營養(yǎng)價值；產(chǎn)品飽和脂肪酸總含量為33.06%，含量最高的是棕櫚酸。與金素鈺等[25]研發(fā)的牦牛酸奶中脂肪酸相比，牦牛酸奶中油酸含量為27.19%，棕櫚酸為33.76%，澳洲堅果酸奶的油酸為39.32%，棕櫚酸為16.88%。羅倩等人[26]的研究發(fā)現(xiàn)，辛酸、葵酸、月桂酸、肉豆蔻酸是酸奶的主要風味物質，對酸奶的滋味及氣味起到重要作用，其中辛酸呈水果香氣；葵酸是脫脂乳酸奶中主要的呈味酸類，增加奶香；月桂酸呈味甜類；肉豆蔻酸具有辛香味及棕櫚酸可賦予酸奶特殊的香味。本產(chǎn)品風味更加柔和，口感更加細膩綿柔，更具有獨特的澳洲堅果風味。

表6 澳洲堅果酸奶脂肪酸種類與相對含量 Table 6 Types and relative content of fatty acids in macadamia yogurt

3 結論

3.1 澳洲堅果酸奶加工的最佳發(fā)酵劑菌種為保加利業(yè)乳桿菌與嗜熱鏈球菌，其菌種復配比為1:2（0.33%:0.67%），發(fā)酵溫度為41.50 ℃，發(fā)酵時間為7.50 h，蔗糖添加量為6.27%。加工的澳洲堅果酸奶產(chǎn)品香氣濃郁，滋味厚重，凝固性好，是一種適合中國人口味的純植物基酸奶。其硬度為323.10 g，黏度為53.04 mPa.s、持水性為1.53%、pH值為3.91，酸度為76.12 °T，感官評分達到了89.16分，整體感官品質較佳；產(chǎn)品的蛋白質含量4.98%，脂肪含量11.80%，乳酸菌活菌數(shù)為1.65×109CFU/g、及大腸菌群、菌落總數(shù)、霉菌、酵母及致病菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌）未檢出；本產(chǎn)品共檢測出脂肪酸成分15種，其中不飽和脂肪酸總含量達67.77%，飽和脂肪酸總含量達33.06%。

3.2 澳洲堅果酸奶以植物蛋白為主要原料，區(qū)別于動物源的酸奶產(chǎn)品，是一款高蛋白、風味佳、營養(yǎng)價值高的純植物基成分的產(chǎn)品，具有一定的新穎性和較好的市場前景，也可豐富澳洲堅果產(chǎn)品形式，對產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有一定的推動意義。