李帆，羅金文，王峰，徐瀟穎，劉柱*

（1.浙江工業(yè)大學綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州 310014）

（2.浙江省食品藥品檢驗研究院國家市場監(jiān)管重點實驗室（功能食品質(zhì)量與安全），浙江杭州 310052）

食品中違禁藥物包括激動劑類、激素類、獸藥等，因其能提高飼料利用率、提高動物酮體的瘦肉轉(zhuǎn)化率[1]、促進畜禽的生長而被非法用于畜牧業(yè)中[2]。然而動物體內(nèi)殘留的違禁藥物被人體攝入并在人體內(nèi)蓄積達到一定量后，會造成心律失常[1]、體內(nèi)激素分泌紊亂[2]、骨質(zhì)疏松[3,4]、高血壓、糖尿病[5]等危害，影響著人們的身體健康。另外運動員誤食含違禁藥物的畜禽類產(chǎn)品也會擾亂體育賽程，影響個人及國家的成績[6,7]。我國食品安全國家標準GB 31650-2019和農(nóng)業(yè)部第250號公告均對食品中違禁藥物最大殘留限量有明確規(guī)定，歐盟中也禁止對畜禽使用激素作為生長促進劑[8]。由于畜禽類產(chǎn)品基質(zhì)復雜，含有脂肪、蛋白質(zhì)、糖類等多種化合物的干擾，且違禁藥物添加種類復雜，因此建立一種快速、準確的方法同時檢測多種違禁藥物殘留具有重要意義。

目前，免疫分析法、高效液相色譜法（HPLC）[5,9]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[1,10]、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[11,12]被廣泛應(yīng)用于違禁藥物的檢測。高效液相色譜法靈敏度低，難以進行痕量檢測。三重四極桿具有檢出限低，定量準確的優(yōu)點，但通常只能用于一種或一類違禁化合物的檢測[13]，分析效率低，特別是當樣品基質(zhì)復雜且存在有相似質(zhì)荷比化合物時，難以進行有效的準確區(qū)分，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果[14]。四極桿-飛行時間質(zhì)譜法（Q-TOF/MS）作為高分辨質(zhì)譜技術(shù)的代表[15]，能夠根據(jù)高質(zhì)量精度、同位素豐度、保留時間、二級高分辨子離子質(zhì)譜圖四大定性條件進行快速篩查確證[16]，具有分辨率高、分析速度快、檢測范圍廣的特點[17,18]。通過全掃描可以獲得化合物的精確質(zhì)量數(shù)，對復雜化合物的檢測具有明顯優(yōu)勢[19]。此外，其掃描速率高，一次可實現(xiàn)幾百種化合物的高通量檢測[14]，在建立標準品數(shù)據(jù)庫后，無需標準品就能進行非靶向篩查[13,20-23]。

本實驗以畜禽類為研究對象，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）測定畜禽類中β-激動劑類、糖皮質(zhì)激素類、雄激素類、孕激素類藥物4大類50種藥物殘留，建立了高分辨質(zhì)量數(shù)據(jù)庫，可用于后續(xù)快速篩查檢測。該方法快速、準確，能夠為畜禽類違禁藥物的添加提供可靠的分析平臺。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 6550 UPLC-Q-TOF/MS質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1×150 mm，2.7 μm），美國Agilent公司；Waters HLB固相萃取柱（200 mg，6 mL），美國Waters公司；Waters Prime HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL），美國Waters公司；Milli-Q型超純水器，美國Millipore公司；全自動氮氣吹干儀，美國Biotage公司；Multifuge XIR高速冷凍離心機，美國Thermo公司；KH-500DV超聲波清洗器，昆山永創(chuàng)超聲儀器有限公司；QT-1渦旋混合器，上海琪特分析儀器有限公司。

甲醇、乙腈（色譜純），德國Merk公司，甲酸（質(zhì)譜純），美國Roe Scientificing公司，實驗用水為經(jīng)Milli-Q型超純水凈化系統(tǒng)制備的超純水，其余試劑均為分析純。

50種違禁藥物標準品：16種β-激動劑（噴布特羅、妥布特羅、克侖特羅、馬布特羅、沙丁胺醇、特布他林、溴布特羅、異丙喘寧、溴代克侖特羅、馬噴特羅、西布特羅、氯丙那林、福莫特羅、萊克多巴胺、西馬特羅、班布特羅），14種糖皮質(zhì)激素（氫化可的松、潑尼松、潑尼松龍、氟米龍、可的松、甲基潑尼松龍、醋酸氟氫可的松、倍氯米松、醋酸氟輕松、丙酸氯倍他索、曲安奈德、氟米松、地塞米松、布地奈德），9種雄激素（勃地龍、甲基睪酮、丙酸睪丸素、諾龍、苯丙酸諾龍、丙酸諾龍、群勃龍、雄烯二酮、司坦唑醇），11種孕激素（左炔諾孕酮、醋酸羥孕酮、炔諾酮、醋酸美倫孕酮、炔諾酮醋酸酯、醋酸氯地孕酮、孕酮、醋酸甲地孕酮、乙酸甲羥孕酮、17α-羥基孕酮、21α-羥基孕酮），純度均≥98%，均來自中國食品藥品檢驗研究院。

同位素內(nèi)標：克倫特羅-D9，萊克多巴胺-D3，氫化可的松-D3，甲基睪酮-D3，孕酮-D9。

畜禽類樣品均購自農(nóng)貿(mào)市場及超市，包括豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉。

1.2 對照品配制

準確稱取各標準品10 mg（精確至0.01 mg），分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配制成1000 mg/L的標準儲備液，于-18 ℃下避光保存。精密稱取各內(nèi)標對照品1 mg，用甲醇溶解并定容至10.0 mL，配制成100 mg/L的標準儲備液，于-18 ℃下保存。使用時根據(jù)需要用甲醇逐級稀釋對照品標準儲備液和同位素內(nèi)標儲備液。

1.3 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入8 mL 0.2 mol/L乙酸銨溶液，40 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，于37 ℃避光水浴振蕩16 h。取出冷卻至室溫，渦旋混勻，10000 r/min離心10 min。取全部上清液加入5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，混勻，用高氯酸調(diào)pH至1.0，10000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用10 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15 mL，渦旋混勻，振蕩10 min，5000 r/min離心5 min，取上層有機相；在下層水相中加入叔丁基甲醚10 mL，渦旋混勻，振蕩10 min，5000 r/min離心5 min，合并有機相。50 ℃氮吹至干，用1 mL甲醇溶解，再加入9 mL水，待凈化。

Oasis HLB固相萃取小柱預先依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，將待凈化液全部上柱，控制流速1～2滴/s，待提取液全部流出，依次用15 mL水和5 mL 5%甲醇水淋洗HLB固相萃取柱，棄去全部流出液，并徹底抽干后用10 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液后于45 ℃下氮氣吹干，加入1.0 mL初始流動相復溶，用0.22 μm有機濾膜過濾后供UPLC-Q-TOF/MS分析。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱（2.1×150 mm，2.7 μm）；流動相：A相為水（含質(zhì)量分數(shù)0.1%甲酸），B相為乙腈；梯度洗脫程序如下：

0～2 min：5% B；2～10 min：5% B→40% B；10～17 min：40% B→90% B；17～20 min：90% B；20～20.1 min：90% B→5% B；20.1～25 min：5% B；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：3 μL。

1.4.2 UPLC-Q-TOF/MS質(zhì)譜條件

離子源：雙噴射離子源（Dual AJS ESI），正離子模式；干燥氣溫度：200 ℃；干燥氣流速：14 L/min；霧化器壓力：35 psig；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L/min；離子源電壓：4000 V；噴嘴電壓：0 V；毛細管出口電壓：380 V；四級桿電壓：750 V。采集模式為MS Scan及Targeted MS/MS；一級質(zhì)譜掃描范圍：m/z100～1000，采集頻率：2 spectra/s；二級質(zhì)譜掃描范圍m/z50～1000，采集頻率：3 spectra/s；碰撞池電壓：10、20、40 eV。參比溶液中含嘌呤（C5H4N4，離子精確相對分子質(zhì)量121.0508730）和HP-0921（C18H18O6N3P3F24，離子精確相對分子質(zhì)量922.009798），能夠進行實時校正，提高所測化合物分子量的準確性。

1.5 高分辨質(zhì)譜篩查譜庫構(gòu)建的條件

首先分別配制濃度為1.0 mg/L的50種違禁藥物的標準品溶液，按1.4條件在正離子模式下進行TOF-MS全掃描一級高分辨質(zhì)譜分析，獲得各個化合物的高分辨一級質(zhì)譜信息和對應(yīng)的保留時間。建立化合物PCDL（Personal Compound Database Library）高分辨數(shù)據(jù)庫，含對應(yīng)化合物的名稱、分子式、精確分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)式、CAS號、保留時間等基本信息，完成一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫的建立。

對已獲得高分辨一級質(zhì)譜精確質(zhì)荷比的化合物在10 eV、20 eV、40 eV三種碰撞能量下分別做Targeted MS/MS二級掃描，得到不同碰撞能量下的高分辨碎片離子質(zhì)譜圖（附圖1），并對獲得的二級質(zhì)譜高分辨全掃描信息進行子離子校對后導入數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)化合物目錄下，完成二級譜圖庫的建立。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-Q-TOF/MS條件的優(yōu)化

將所研究的50種違禁藥物分別在正、負兩種離子模式下進行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50種違禁藥物在正離子模式下都有較好的響應(yīng)；在選擇流動相時，考察了甲醇和乙腈的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)使用乙腈洗脫時峰型更尖銳、對稱，同時，在水相中加入0.1%甲酸能夠有效改善峰型、提高化合物的響應(yīng)，因此選擇正離子模式對50種違禁藥物進行掃描，流動相選擇乙腈和0.1%的甲酸水溶液。

通過研究發(fā)現(xiàn)本文所分析的50種違禁藥物中有7種化合物屬于同分異構(gòu)體，分別為潑尼松龍和可的松，勃地龍和雄烯二酮，丙酸諾龍和17α-羥基孕酮、21α-羥基孕酮，由于本研究采用的定量方式為高分辨一級質(zhì)譜定量，因此需要通過調(diào)整流動相中有機相和水相的比例和洗脫梯度，將3對同分異構(gòu)體進行有效分離。通過研究確定50種違禁藥物的最佳分離的洗脫梯度，在最終優(yōu)化后的UPLC-Q-TOF/MS條件下50種目標化合物分離效果見圖1，其中，圖1中標識的數(shù)字與表1中的化合物編號一一對應(yīng)。

本研究所涉及到的3對同分異構(gòu)體（為潑尼松龍和可的松，勃地龍和雄烯二酮，丙酸諾龍和17α-羥基孕酮、21α-羥基孕酮）可以獲得較好的基線分離（附圖2）。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

β-受體激動劑、激素類化合物在動物體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化時會發(fā)生葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)、硫酸鹽化反應(yīng)和氧化反應(yīng)[24]，在動物體主要以葡萄糖醛酸結(jié)合物和硫酸酯結(jié)合物的形式存在。因此需要加入β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶將結(jié)合型化合物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)。由于畜禽類樣品蛋白質(zhì)含量高，在非極性溶劑中不易分散，導致目標化合物的提取效率低。因此在提取前加入乙酸-乙酸銨緩沖液（pH=5.2）使樣品進行分散后再用提取劑提取。除此之外，蛋白質(zhì)的存在不僅會加強基質(zhì)效應(yīng)，且容易在色譜柱上產(chǎn)生不可逆的吸附，導致色譜柱失去柱效。因此本文采用高氯酸進行蛋白沉淀，然后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至堿性使化合物呈游離狀態(tài)。

目前，畜禽類違禁藥物非法添加的檢測常采用甲醇、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、異丙醇[3,17]作為提取試劑。由于甲醇會提取緩沖液中的水分而影響后續(xù)蒸干步驟，本實驗考察了乙酸乙酯、叔丁基甲醚以及兩者分別提一次后混合有機相的提取效果。取空白樣品5 g，加入混合標準溶液，分成3組，每組6份，分別用乙酸乙酯、叔丁基甲醚、以及兩者結(jié)合提取，按1.3進行后續(xù)處理后，供UPLC-Q-TOF/MS分析，不同提取溶劑提取后各類化合物的平均回收率如圖2所示。結(jié)果表明乙酸乙酯的提取效果優(yōu)于叔丁基甲醚，但乙酸乙酯對地塞米松的提取效果較差，叔丁基甲醚對沙丁胺醇、勃地龍、苯丙酸諾龍的提取效果不理想。結(jié)合兩種提取溶劑，先用乙酸乙酯提取后再用叔丁基甲醚提取的方法對50種化合物均呈現(xiàn)出較好的回收率。

2.2.2 凈化方法的選擇

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect）是指樣品中除目標待測物之外的其余組分對分析測定的干擾，表現(xiàn)為基質(zhì)增強或基質(zhì)抑制兩種形式。通過基質(zhì)效應(yīng)的計算公式（ME=基質(zhì)標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率）可以判斷基質(zhì)效應(yīng)的強弱。當ME在0.85～1.15之間時，基質(zhì)效應(yīng)較弱；當ME大于1.15時，基質(zhì)效應(yīng)較強。由于畜禽類產(chǎn)品中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、磷脂等物質(zhì)的干擾，需要采取合適凈化手段后才能供UPLC-Q-TOF/MS檢測。本實驗采用甲醇配制溶劑標準溶液，同時選擇PRiME HLB（Waters；200 mg，6 mL）和HLB（Waters；200 mg，6 mL）兩種固相萃取小柱作為凈化方式，得到基質(zhì)標準溶液。溶劑標準溶液和基質(zhì)標準溶液均上機測試后，計算質(zhì)譜檢測的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用PRiME HLB柱凈化的樣品ME值較高，譜圖存在雜質(zhì)峰的干擾，且待檢測化合物的回收率較低。而經(jīng)HLB柱凈化的樣品ME值低，譜圖清晰，目標化合物的響應(yīng)更高。故實驗采用HLB固相萃取小柱凈化。

2.3 方法評價

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

標準品混合儲備液用甲醇進行逐級稀釋，配制成濃度為2～200 μg/L的系列標準溶液。在最佳儀器條件下進行檢測，以克倫特羅-D9作為克侖特羅、噴布特羅、妥布特羅、馬布特羅、溴布特羅、溴代克倫特羅、馬噴特羅、西布特羅、福莫特羅、西馬特羅、異丙喘寧、氯丙那林的同位素內(nèi)標，萊克多巴胺-D3作為萊克多巴胺的同位素內(nèi)標，氫化可的松-D3作為氫化可的松、潑尼松、潑尼松龍、氟米龍、可的松、甲基潑尼松龍、醋酸氟氫可的松、倍氯米松、醋酸氟輕松、丙酸氯倍他索、曲安奈德、氟米松、地塞米松、布地奈德的同位素內(nèi)標，甲基睪酮-D3作為甲基睪酮，雄烯二酮的同位素內(nèi)標，孕酮-D9作為孕酮的同位素內(nèi)標。以待測物質(zhì)的峰面積和相應(yīng)內(nèi)標的峰面積的比值為縱坐標（Y），以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線。其余化合物采用外標法，以化合物高分辨一級質(zhì)譜的質(zhì)荷比進行定量，以待測物的峰面積為縱坐標（Y），以質(zhì)量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線。以3倍信噪比和10倍信噪比為依據(jù)，確定方法的檢出限與定量限（附表1）。

國家標準GB/T 22286-2008動物源性食品中多種β-受體激動劑檢測的檢出限為0.5 μg/kg；GB/T 21981-2008中動物源食品中激素多殘留檢測的檢出限為0.4～2.0 μg/kg；GB/T 20741-2006中畜禽肉中地塞米松殘留量檢測的檢出限為0.2 μg/kg；GB/T 20758-2006中牛肝和牛肉中孕酮殘留量測定的檢出限為0.1 μg/kg。本實驗的50種藥物在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性相關(guān)系數(shù)都大于0.99。各種藥物的檢出限為0.1～0.5 μg/kg，定量限為0.3～1.5 μg/kg，與國標檢出限基本一致或較優(yōu)于國標方法的檢出限。

2.3.2 回收率和精密度

對檢測為陰性的豬肉樣品進行加標回收實驗，添加濃度水平為：0.5、10、20 μg/kg，每個濃度水平進行6次平行測試，按1.3的前處理方法進行處理，并按1.4的儀器工作條件進行檢測，其平均回收率和相對標準偏差結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明，50種藥物的回收率在81.74%～114.22%之間，RSD在1.41%～8.91%之間，優(yōu)于國標GB/T 21981-2008對動物源食品中激素多殘留檢測方法在0.4～10 μg/kg范圍內(nèi)加標回收率75.2%～121.8%，RSD 2.4%～20.8%，本方法具有良好的準確度、精密度和重復性。

表1 不同加標水平下50種藥物的平均回收率和相對標準偏差（n=6） Table 1 Average recoveries and RSDs of 50 drugs spiked in blank samples of different levels (n=6)

續(xù)表1

2.4 數(shù)據(jù)庫的建立及快速定性篩查的應(yīng)用

2.4.1 數(shù)據(jù)庫的建立和對加標樣的篩查驗證

利用1.5的條件建立了50種違禁藥物高分辨質(zhì)譜篩查數(shù)據(jù)庫（附圖3），包括化合物的名稱、分子式、精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、CAS號、不同碰撞能量下的二級質(zhì)譜圖等。

該數(shù)據(jù)庫可以進行化合物的快速篩查和確證，其篩查流程如附圖4所示。處理好的樣品在相同的條件下進行一級質(zhì)譜全掃描，在數(shù)據(jù)處理軟件中根據(jù)精確分子質(zhì)量和保留時間按數(shù)據(jù)庫查找化合物，以精確分子質(zhì)量偏差小于5×10-6、保留時間偏差小于0.05 min作為定性篩查依據(jù)。將所得結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的信息進行比對，根據(jù)精確分子質(zhì)量得分、同位素豐度得分、同位素分布得分、保留時間得分四者占比10:5:6:10進行綜合打分，最終得分小于75分的鑒定為陰性樣品，并且對得分大于等于75分的疑似性樣品進行進一步確證。陽性樣品經(jīng)過二級特征碎片離子掃描后，按Targeted MS/MS查找化合物，利用檢索譜庫識別化合物的功能，以儀器類型、碰撞能量為標準進行檢索，與數(shù)據(jù)庫中二級譜圖作鏡像比對，軟件自動生成得分，對于匹配得分值大于80的化合物，確認該樣品為陽性樣品。

對建立的50種違禁藥物的高分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行定性篩查能力的考察。選取畜禽類陰性樣品加標，按1.3前處理方法處理后供UPLC-Q-TOF/MS檢測，將樣品中50種違禁劑類藥物檢測結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進行比對，50種激素類化合物與一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫檢索匹配的質(zhì)量偏差均小于5×10-6，檢索得分均高于80分（附表2）。

2.4.2 實際畜禽肉樣品中違禁藥物的快速篩查

以豬肉陰性樣品中添加馬布特羅為例，附圖5為馬布特羅一級提取離子流色譜圖。將該結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的理論值進行比對，其相對分子質(zhì)量、保留時間、同位素比例及其分布等均匹配良好，一級檢索得分為98.81，初步確定馬布特羅為疑似藥物。

通過二級質(zhì)譜的碎片離子進行進一步的確證，待測化合物與數(shù)據(jù)庫中二級質(zhì)譜圖的鏡像對比，以化合物的特征碎片離子為主要評價依據(jù)，進行進一步的確證分析。圖3為馬布特羅的二級質(zhì)譜鏡像對比結(jié)果，可以看到其主要的碎片離子峰與譜圖庫匹配較好，得分為99.23分。

3 結(jié)論

本實驗建立了超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法篩查畜禽類中50種違禁藥物的分析方法，考察了提取溶劑、固相萃取柱的選擇，調(diào)試儀器參數(shù)，最終確定乙酸乙酯-叔丁基甲醚提取、HLB固相萃取小柱凈化為最優(yōu)的前處理方法，以0.1%甲酸水溶液、乙腈為流動相，在正離子模式下掃描檢測。在樣品前處理中加入同位素內(nèi)標，不僅能去除復雜基質(zhì)帶來的基質(zhì)效應(yīng)的影響，還能降低在樣品前處理過程中的損失從而提高回收率。該方法檢出限為0.1～0.5 μg/kg，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，在0.5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg三個不同濃度加標的回收率于81.74%～114.22%之間，相對標準偏差為1.41%～8.91%。將本文建立的方法與國標方法進行比較，該方法優(yōu)于國家標準，可以應(yīng)用于實際樣品中的違禁藥物檢測。研究建立了50種藥物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包括化合物的名稱、分子式、精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、CAS號、不同碰撞能量下的二級質(zhì)譜圖等。并驗證了該高分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行定性篩查能力，無需對照品就可實現(xiàn)較為準確的定性分析。