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        鐵皮石斛中石斛多糖、石斛堿、石斛酚的聯(lián)合提取

        2022-06-29 02:15:16徐艷飛李康銀李小麗
        云南化工 2022年6期
        關(guān)鍵詞:定容鐵皮石斛

        徐艷飛,夏 謙,李康銀,李小麗,谷 紅

        (1.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南 玉溪 653106;2.云南和瑾科技有限公司,云南 昆明 675400)

        鐵皮石斛(Dendrobium officinale KimuraetMigo)是蘭科石斛屬,為蘭科第二大屬,包括1500多種植物[1]。我國的石斛種類有74種,2個變種,大多分布在云南、貴州、廣東、廣西、浙江等地[2]。石斛是一種多年生草本植物,采收2~3年生為好,11月至翌年3月釆收,藥用部位為新鮮品或干燥的根莖。鐵皮石斛化學(xué)成分及藥理活性是目前石斛領(lǐng)域研究的熱點與重點[3]。近年來,從具有藥理活性的40多種石斛中分離出將近100種活性化合物,包括:石斛多糖、石斛堿、石斛酚、氨基酸、黃銅、萜類、甾體、微量元素等[4-6]。大量藥理活性研究表明,鐵皮石斛具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗突變、降血壓、降血脂、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗輻射、抗?jié)?、抗衰老等功效[7]。除藥用外,石斛作為保健食品已有幾千年的歷史。因此這些活性成分在提高免疫力、抗衰老、抗疲勞等方面進(jìn)行中成藥制劑成品與保健品的開發(fā)極具前景[8]。鐵皮石斛中的活性成分石斛多糖、生物堿、聯(lián)芐酚等均為重要的功能化合物,這些活性物質(zhì)的提取純化已成為近年來的一個研究熱點,但以往的研究多為單一活性成分分離提取及藥理活性研究,對他們的聯(lián)合提取和對石斛中石斛酚的提取及含量測定方面的研究較少,造成鐵皮石斛原材料的極大浪費。因此,對鐵皮石斛中多糖、石斛堿、石斛酚的聯(lián)合提取對于鐵皮石斛這種珍貴中藥材的綜合利用具有重要的現(xiàn)實意義[9]。本研究利用冷浸-超聲、乙醇回流提取、醇沉返溶等方法,對鐵皮石斛中石斛多糖、石斛堿、石斛酚進(jìn)行了聯(lián)合提取,并進(jìn)行含量、純度測定,具有流程簡單、工藝可靠、純度高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢。

        1 材料與設(shè)備

        1.1 材料和試劑

        鐵皮石斛(購自云南省昆明市呈貢區(qū)云南端端生物科技有限公司),鑒定為3年生最佳采收期采收的石斛鮮條(2 kg),經(jīng) 110 ℃ 殺青 30 min,60 ℃ 烘干至恒重,粉碎,過三號篩(0.355 mm);無水葡萄糖對照品(用前 105 ℃ 烘 2 h)、石斛堿對照品、石斛酚對照品(購于中國食品藥品檢定研究所);苯酚試劑(分析純,200 mL 苯酚,加入 0.2 g 鋁片和 0.1 g 碳酸氫鈉蒸餾,收集182餾分。稱取 17 g,加水 150 mL 混勻,溶解即得,置棕色瓶中,放入冰箱備用);甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、其他試劑(分析純)、屈臣氏蒸餾水、實驗室自制去離子水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        高效液相色譜分析儀(島津LC-10AT/SPD10A);色譜工作站(LabSolutions LCsolution),紫外可見分光光度計(UV-2550);氣相色譜分析儀(島津GC2010 Pro);超聲波清洗器(KQ5200E);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5286A);電子天平(BT2202S,北京賽多利斯儀器有限公司);離心機(jī)(LD5-2A);凍干機(jī)(SJIA-10N-60D);超微濾膜(津騰50×0.22 μm);家用多功能料理機(jī)(CX-301,中山市九陽小家電有限公司)。超純水系統(tǒng)(上海葉拓YTUP-30),電熱恒溫干燥箱(IKA HB10)、電熱套、酸度計(PHS-25)

        2 方法與結(jié)果

        2.1 石斛多糖、石斛堿、石斛酚的聯(lián)合提取

        取 110 ℃ 殺青 30 min,60 ℃ 烘干至恒重,粉碎,過三號篩(0.355 mm)的鐵皮石斛粉 20 g,加入 80 ℃ 超純水浸泡 8 h 以上,超聲 20 min,離心過濾得濾液(A部分)和濾渣(B部分)兩部分?;蛴眯迈r鐵皮石斛加10倍無水乙醇打漿,加 60 ℃ 水?dāng)嚢杼崛?1 h,過濾得濾液和濾渣兩部分。

        2.1.1 石斛多糖的提取與精制

        取A部分濾液,加入無水乙醇至無沉淀產(chǎn)生,離心過濾。所得濾液可蒸餾回收乙醇。所得沉淀加5倍的水返溶,將所得溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)濃縮至體積為原來的1/10,加入乙醇達(dá)80%質(zhì)量分?jǐn)?shù),在冰箱中靜置醇沉,過夜。離心過濾,棄上層清液。將沉淀用乙醚、無水乙醇依次洗滌,過濾,所得濾液經(jīng)凍干機(jī)預(yù)凍 10 h,再進(jìn)行真空凍干即得石斛多糖精品 4.2631 g。流程如圖1所示。

        圖1 石斛多糖的提取純化

        2.1.2 石斛堿、石斛酚的提取與精制

        取B部分濾渣,用無水乙醇回流提取 1 h。所得濾液旋蒸回收乙醇,離心過濾;所得固體于恒溫干燥箱中 70 ℃ 烘干,即得石斛堿和石斛酚。向該固體中加入10%稀鹽酸,4000 r/min 離心 20 min,過濾得固體為石斛堿,純度為12%;液體為石斛酚,經(jīng) 70 ℃ 烘干的純度為27%石斛酚。流程如圖2所示。

        圖2 石斛堿、石斛酚的提取純化

        2.2 石斛多糖含量測定

        石斛多糖測定采用苯酚-硫酸法[10]。

        2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        1)多糖對照品溶液的制備。精密稱取無水葡萄糖對照品 10 mg,加水溶解并定容至 100 mL,即得 100 μg·mL-1的對照品溶液。

        2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置 10 mL 具塞試管中;分別往里補(bǔ)水至 1 mL,得質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別精密加入5%苯酚溶液 1 mL,震蕩搖勻,再精密加入濃硫酸 5 mL,置沸水浴中加熱 20 min,取出置冷水浴中冷卻至室溫;以 1 mL 水,同法操作,作為空白對照。按照紫外-可見分光光度法,在 490 nm 波長處測吸光度,得回歸方程為y=0.008x-0.0067,相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

        圖3 無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.2.2 石斛多糖樣品的測定

        精密稱取2.1.1項下制得的石斛多糖精品 20 mg,加水溶解定容至 100 mL,取 1.0 mL 置于具塞試管中,按“2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項方法進(jìn)行測定。

        2.3 石斛堿的測定

        石斛堿的測定采用酸性染料比色法。

        2.3.1 石斛堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        精密稱取石斛堿對照品 1 mg,用氯仿溶解并定容至 100 mL,得 10 μg/mL 石斛堿對照品溶液。精密量取對照品溶液1、2、3、4、5 mL,用氯仿稀釋至 10 mL;加入 5 mL pH4.5的HAc-NaAc緩沖液和 2 mL 0.04%溴甲酚綠溶液,劇烈振搖 3 min,室溫靜置 30 min;將氯仿層用經(jīng)氯仿浸泡干燥后的藥棉濾過。取續(xù)濾液 5 mL,加 1 mL 0.01 mol·L-1氫氧化鈉無水乙醇溶液。以氯仿 10 mL,同法操作,作為空白對照。按照紫外-可見風(fēng)光光度法,在 620 nm 處測吸光度。得回歸方程為:y=0.1667x-0.0075,R2=0.9994。

        圖4 石斛堿對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.3.2 石斛堿樣品的測定

        精密稱取本實驗2.1.2項下制得的石斛堿樣品 50 mg,置于 100 mL 容量瓶中,用氯仿溶解并定容至 100 mL。其余同2.3.1“石斛堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項下操作方法,測定石斛堿的含量。

        2.4 石斛酚的測定

        超高效液相色譜-電化學(xué)檢測法(UPLC-EDC)測定所得產(chǎn)品中的石斛酚[11]。

        2.4.1 石斛酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        精密稱取 20 mg 石斛酚對照品,加入甲醇溶解并定容至 100 mL,得 20 mg/L 石斛酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-20 ℃ 儲存?zhèn)溆?。取石斛酚?biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mL,分別加入甲醇稀釋至 100 mL,得質(zhì)量濃度為0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00和 10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按照以下色譜條件測定:色譜柱C18柱ODS柱(4.6 mm×150 mm,粒徑 5 μm);柱溫 30 ℃;流動相為 20 mmol/L 乙酸銨溶液(pH3.6)-乙腈[60%∶40%(體積比)];流速 1 mL/min;進(jìn)樣量 10 μL;ECD檢測電壓 520 mV,檢測波長 230 nm[11]。以峰面積y作為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)系列溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。石斛酚的回歸方程為y=13.045x+0.5187,R2=0.9997。

        圖5 石斛酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.4.2 石斛酚樣品的測定

        精密稱取本實驗2.1.2項下制得的石斛酚樣品 50 mg,置于 100 mL 容量瓶中,用甲醇溶解并定容至 100 mL。其余同2.4.1“石斛酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項下操作方法,測定石斛酚的含量。

        3 結(jié)論

        利用冷浸-超聲、乙醇回流提取、醇沉返溶等方法對鐵皮石斛中石斛多糖、石斛堿、石斛酚進(jìn)行了聯(lián)合提取,所得石斛多糖、石斛堿、石斛酚的純度分別為89%、12%、27%。對鐵皮石斛的主要活性成分石斛多糖、石斛堿、石斛酚的聯(lián)合提取,流程簡單,工藝可靠,能耗低,生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢。為鐵皮石斛有效成分的綜合利用提供一定的參考依據(jù)。

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