鄭鳳家，焦燕妮，張小紅，劉俊麗，邵立君，王曉琳，王林，楊路平

（1.山東省預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院，山東省疾病預(yù)防控制中心，濟(jì)南 250014； 2.濱州市疾病預(yù)防控制中心，山東濱州 256618）

食物中毒是指健康人經(jīng)口腔攝入正常數(shù)量、可食狀態(tài)的有毒食物（指被致病菌及其毒素、化學(xué)毒物污染或含有毒素的動植物食物）后所引起的以急性感染或中毒為主要臨床特征的疾病[1-4]。雖然政府監(jiān)管部門、食品生產(chǎn)加工企業(yè)、餐飲單位以及消費者都十分重視和關(guān)注，但發(fā)生食物中毒和誤食有毒物質(zhì)造成中毒甚至死亡的案例仍時有報道。食物中毒因具有突發(fā)性、無規(guī)律性、危害嚴(yán)重性和防控難度大等特點得到各級政府的高度重視[5-6]。

引發(fā)食物中毒的常見物質(zhì)主要有鼠藥[7]、重金屬、農(nóng)藥殘留[8]、獸藥殘留、生物毒素[9]、真菌毒素[10]及非法添加物等。目前有機(jī)類毒物的檢測主要采用色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8，11-12]等。由于食物中毒具有突發(fā)性和未知性，上述檢測方法不足以有效地對未知目標(biāo)物進(jìn)行定性，而超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-QTOFMS）具有高分辨率、高準(zhǔn)確度、高靈敏度、高通量的特點[13-15]，一次進(jìn)樣，不僅可以獲得準(zhǔn)確的一級質(zhì)譜信息，還同時獲得檢出物質(zhì)的二級質(zhì)譜（MS/MS）精確質(zhì)量質(zhì)譜圖。將物質(zhì)的化學(xué)式與一級精確質(zhì)量質(zhì)譜圖進(jìn)行對比、MS/MS 精確質(zhì)量質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫或文獻(xiàn)比對，在不需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下可完成對未知毒物的準(zhǔn)確定性。

2018 年1 月，山東某村居民在食用了本村磨坊新磨玉米面、豆面后，陸續(xù)出現(xiàn)惡心、頭暈、頭疼、嘔吐和乏力等癥狀，其中一人出現(xiàn)昏迷。筆者對該縣疾控中心提供的豆面、玉米面及中毒人員血樣，采用基于QuEChERS 原則的凈化處理技術(shù)，用UPLCQTOF MS/MS 法進(jìn)行了定性篩查分析，在樣品中檢出聚醚類抗生素莫能菌素，為中毒人員的醫(yī)治提供了依據(jù)，為搶救病人贏得了寶貴的時間。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

超高效液相色譜儀：ACQUITY UPLC-HCLASS 型，美國沃特世科技有限公司。

飛行時間質(zhì)譜儀：SYNAPT G2-S QTOF 型，美國沃特世科技有限公司。

渦旋混勻器：Vortex-Genie2型，美國科學(xué)技術(shù)有限公司。超純水系統(tǒng)：Millipore-Q型，美國密理博公司。電子天平：Sartorius CPA225D 型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。

高純氮氣：體積分?jǐn)?shù)為99.999%，英國畢克科技有限公司。

甲醇、乙腈：色譜純，德國默克集團(tuán)。

甲酸：優(yōu)級純，德國默克集團(tuán)。

待測樣品：中毒患者就餐可疑食物4 份（豆面2份，玉米面2 份），中毒人員血樣2 份，山東省某縣級疾病預(yù)防控制中心。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司）；柱溫：30 ℃；流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B 為0.1%甲酸-甲醇溶液；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～0.5 min 時，B 相體積分?jǐn)?shù)為5%，0.5～7 min 時，B 相體積分?jǐn)?shù)由5%線性升至95%，7～9 min 時，維持B 相體積分?jǐn)?shù)為5%。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離離子源（ESI）；分辨率：大于20 000；檢測方式：正負(fù)離子模式檢測；質(zhì)量掃描范圍：100～1 200 Da；毛細(xì)管電壓：0.8 kV；錐孔電壓：25 V；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：400℃；錐孔氣：高純氮氣，流量為20 L/h；脫溶劑氣：高純氮氣，流量為800 L/h；掃描時間：0.2 s；MSE低碰撞能量：4.0 V；MSE高碰撞能量：10～45 V；質(zhì)量范圍：50～1 200 Da；Lock Spray 雙噴霧離子源：亮氨酸腦啡肽溶液；在Lock Spray 模式下：ESI+為556.277 1 Da，ESI-為554.262 0 Da。

1.3 樣品處理

血漿樣品：吸取100 μL 血漿，加入400 μL 乙腈，渦旋振蕩30 s，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，待測。

食物樣品：稱取1.00 g 樣品（精確至0.01 g）于10 mL 聚四氟乙烯具塞離心管中，加入含0.1%甲酸的甲醇-水（體積比為7∶3）溶液，渦旋混勻，超聲振蕩提取5 min。以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液1 mL 于含有30 mg 乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）的Eppendorf 管中凈化，渦旋振蕩30 s，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法選擇

應(yīng)急事件處置需要時效性，由于中毒樣品基體復(fù)雜，要求前處理方法快速、準(zhǔn)確、高效。在分散固相萃取中，基于QuEChERS 原則的樣品處理技術(shù)近幾年發(fā)展格外迅速，適用于各種分子結(jié)構(gòu)和極性化合物的提取凈化，已廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜中多種農(nóng)藥殘留的檢測。

依據(jù)筆者多年突發(fā)性食品中毒事件及食品風(fēng)險監(jiān)測工作的經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)基于QuEChERS 原則的樣品處理技術(shù)不僅在復(fù)雜基質(zhì)中具有較好的提取效率，而且最突出的優(yōu)勢在于其處理方法簡單、快速，非常適用于突發(fā)性公共安全事件的檢測，故選擇基于QuEChERS 原則的樣品處理方法。

基于QuEChERS 原則的樣品處理方法一般使用PSA 吸附去除樣品基質(zhì)中的有機(jī)酸、色素、糖、脂肪酸等物質(zhì)，GCB（石墨炭黑粉）去除甾體、葉綠素、類胡蘿卜素等化合物，C18去除基質(zhì)中的脂類等非極性有機(jī)物。本次中毒樣品為玉米面和豆面，含有大量的色素和脂類，在實驗中發(fā)現(xiàn)PSA 能夠有效去除其中的色素、糖和脂肪酸，有效降低基質(zhì)干擾，快速篩查出中毒目標(biāo)物；GCB 操作較復(fù)雜，去除糖、脂肪的能力弱于PSA；C18在去除脂類方面具有優(yōu)勢，但是在吸附色素、糖的能力上弱于PSA。綜合考慮，選用PSA 作為凈化試劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

C18色譜柱在化合物分離中通用性較強，而Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）對多數(shù)化合物均具有較好的分離能力，可以滿足多種化合物同時檢測的要求，故選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱為分離柱。

在正離子模式質(zhì)譜分析條件下，流動相水相中加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸溶液，甲酸能夠提供氫離子，不僅能夠改善色譜峰形，同時能夠提高電離效果。在有機(jī)相的選擇中，比較了乙腈和甲醇的分離效果，兩者差別不大，考慮低毒性、低耗材的因素，選擇甲醇作為有機(jī)流動相。經(jīng)優(yōu)化，選擇的流動相體系A(chǔ) 相為0.1%甲酸水溶液，B 相為0.1%甲酸-甲醇溶液。由于中毒樣品測定的未知性，選擇95%水相線性梯度過度到95%有機(jī)相的洗脫方式，以保證篩查結(jié)果的完整性。

2.3 質(zhì)譜模式選擇

為提高篩查、鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性，希望得到樣品中各組分的碎片離子，同時又不希望損失其準(zhǔn)分子離子的靈敏度。采用非信息依賴型數(shù)據(jù)采集模式即UPLC/MSE正負(fù)離子模式，同時采集2 個不同碰撞能量通道的數(shù)據(jù)，低能量通道監(jiān)測準(zhǔn)分子離子，高能量通道采集碎片離子數(shù)據(jù)，一次進(jìn)樣可以得到樣品中所有化合物的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)。分別記錄母離子及碎片信息，MSE通過母離子與其碎片離子具有相同色譜行為的特性進(jìn)行母離子與子離子的關(guān)聯(lián)歸屬，所有的離子信息都被記錄，定量、定性更加準(zhǔn)確，全部母離子與碎片離子信息都是高精度、高分辨的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。MSE并不選擇特定母離子進(jìn)行單獨碎裂，而是同時采集了所有母離子的碎片離子，這樣MSE就避免了數(shù)據(jù)依賴型串聯(lián)質(zhì)譜法因采集速率的限制而造成信息采集不全的問題，故選擇在MSE 正離子模式下進(jìn)行測定。

采集的玉米面、豆面、及血液樣品的總離子流色譜圖、質(zhì)譜圖分別如圖1、圖2 所示，其中有效的化合物信息提取較為困難。

圖2 玉米面樣品質(zhì)譜圖

2.4 確證檢出的目標(biāo)化合物

在血液樣品的總離子流色譜圖（如圖3）中，未觀察到信噪比高的色譜峰；對比玉米面與空白玉米面總離子流色譜圖（如圖4），也無法獲取有效信息，這反映了生物基質(zhì)復(fù)雜、毒性化合物濃度一般較低、其信號經(jīng)常被噪音掩蓋的特點。

圖3 血液樣品的總離子流色譜圖

圖4 空白玉米面的總離子流色譜圖

首先采用非信息依賴型數(shù)據(jù)采集模式即不需對樣品中的化合物進(jìn)行預(yù)選擇，而是采集所有從色譜中分離出的化合物質(zhì)譜信息，數(shù)據(jù)采集后結(jié)合本實驗室依托山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃（2015WS 0273）建立的動植物源性食品中獸藥、農(nóng)藥及違禁添加高通量篩查與檢測平臺對樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過峰提取、母子離子峰精確質(zhì)量對比、保留時間、化合物加合方式等內(nèi)置算法，將化合物的相關(guān)質(zhì)譜信息從海量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中提取出來，并進(jìn)行譜庫檢索。在玉米面樣品中檢出了莫能菌素，其精確質(zhì)量數(shù)與數(shù)據(jù)庫信息符合(±5 μg/g) ，即在5.96 min處發(fā)現(xiàn)了m/z 669.4209離子的一個明顯色譜峰，如圖1 所示。

使用MassLynxTM應(yīng)用管理系統(tǒng)元素組成工具，即Elemental Composition，對離子（m/z）669.420 9進(jìn)行分析，最有可能的建議化學(xué)式為C36H61O11，最大質(zhì)量偏差小于2.1×10-6，并且通過使用智能匹配將該化學(xué)式選定為最佳擬合，該化學(xué)式與一種畜禽專用抗生素聚醚類抗生素莫能菌素相匹配。對5.96 min 采集的質(zhì)譜使用MassFragmentTM工具進(jìn)行處理，分析結(jié)果與莫能菌素的母離子（m/z）669.420 9及子離子（m/z）637.353 8相匹配，通過高能通道采集碎片離子圖譜，可以清楚直觀地得到化合物特征性的碎片離子色譜峰及化學(xué)鍵斷裂位置。

參照歐盟指令2002/657/EC 的規(guī)定，使用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜確認(rèn)的一個母離子計2 分，一個子離子計2.5 分，對目標(biāo)物質(zhì)的定性要求為4 分。本實驗中對莫能菌素的確認(rèn)，達(dá)到了4.5 分，且滿足指令中規(guī)定的相對分子質(zhì)量偏差小于5.0×10-6和絕對質(zhì)量數(shù)偏差為2.0 mDa時保留時間偏差為0.15 min的要求。

經(jīng)現(xiàn)場調(diào)查，磨坊在磨玉米之前磨過雞飼料（添加劑），初步懷疑患者為飼料中添加的藥物中毒。經(jīng)UPLC-Q TOF-MS/MS 檢測分析，在玉米面和豆面及中毒患者血漿中均檢出高濃度的莫能菌素，在全面檢索篩查質(zhì)譜數(shù)據(jù)后，排除了其它化合物可能造成的中毒，確認(rèn)為莫能菌素。為進(jìn)一步確認(rèn)篩查結(jié)果，取莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)樣分析，其UPLC 保留時間以及一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與玉米面、血漿樣品中的數(shù)據(jù)一致，玉米面樣品、血漿樣品、莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)品扣除背景后的色譜圖如圖5所示，對應(yīng)質(zhì)譜圖如圖6，三者基本吻合，從而證實樣品中含有莫能菌素。

圖5 玉米面、血漿樣品、莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)品扣除背景后的色譜圖

圖6 玉米面、血漿樣品、莫能菌素標(biāo)準(zhǔn)品MS/MS 質(zhì)譜圖

3 結(jié)語

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法分離效率高、定性準(zhǔn)確，尤其在缺少標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，以精確質(zhì)量數(shù)定性，也可定量?；赒uEChERS原則的樣品處理技術(shù)，該法在應(yīng)急事件快速篩查和鑒定中，能夠為突發(fā)性食物中毒事件的快速篩查檢測提供有力的分析平臺，具有一定的應(yīng)用價值。