唐慧，陳博，黃永鵬，陳茜，孟祥燕

(國民核生化災(zāi)害防護國家重點實驗室，北京 102205)

神經(jīng)性毒劑是一類有機膦酸酯或有機膦酸酯類化合物。沙林(GB)、梭曼(GD)、塔崩(GA)和維?？怂?VX)是最重要的神經(jīng)性毒劑，以呼吸道為主要中毒途徑，進入人體后作用于神經(jīng)系統(tǒng)，通過抑制膽堿酯酶活性從而引起乙酰膽堿的蓄積，使膽堿能神經(jīng)過度興奮，最后導(dǎo)致呼吸、循環(huán)系統(tǒng)衰竭而致人死亡。神經(jīng)性毒劑的毒性極強，不但對人類有較強的殺傷性，且對生態(tài)環(huán)境存在著巨大的威脅。發(fā)生化學(xué)毒劑的突發(fā)事件時，自然環(huán)境中水體極易被污染[1]，建立環(huán)境樣品中神經(jīng)性毒劑的快速分析檢測方法，對突發(fā)性事故的毒劑種類識別及應(yīng)急處理具有重要的意義。樣品前處理包括對樣品中待測組分進行提取、凈化和濃縮等步驟，是整個分析過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響分析方法的靈敏度和精密度。目前神經(jīng)性毒劑及其模擬劑的檢測前處理技術(shù)主要包括固相萃取[2-4]、液相萃取[1，5-6]、超聲輔助萃取、微波輔助萃取、加速溶劑萃取[7]、微萃取[8]等。但上述方法存在耗時長、有機溶劑消耗量大、成本高等缺點。

超分子萃取是由RUBIO 等[9]提出的一種以超分子溶劑為萃取劑的新型萃取技術(shù)，是近幾年新興的環(huán)保型樣品前處理技術(shù)，主要分為親水膠束[10-12]、反相膠束[13]和囊泡[14]三種類型。其中親水膠束型超分子是以表面活性劑水溶液為萃取劑，通過表面活性劑的增溶性和分相來實現(xiàn)對目標(biāo)物的分離和富集，最后用微量的有機溶劑將目標(biāo)物從表面活性劑相中反萃取出來，從而提高了方法的富集倍數(shù)[15]。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于金屬離子、生物大分子、有毒污染物[16]等樣品的分離分析預(yù)處理，但是其應(yīng)用于水中神經(jīng)性毒劑檢測的研究目前沒有報道。

筆者以水中神經(jīng)性毒劑典型化合物GB、GD 以及其模擬劑甲基磷酸二甲酯(DMMP)為目標(biāo)物，以非離子活性劑水溶液為萃取劑，通過加入無機鹽降低濁點溫度，在室溫下完成萃取。使用異辛烷對富集相進行反萃取，減弱了單一溶劑萃取時對極性的限制，在超聲輔助下，目標(biāo)物進入有機相中，據(jù)此建立了超分子萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用方法測定水GB、GD、DMMP 3 種目標(biāo)物的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975C 型，美國安捷倫科技有限公司。

恒溫加熱型振蕩儀：TMS2000 型，萊普特科學(xué)儀器(北京)有限公司。

電子分析天平：XP105 型，感量為0.1 mg，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司。

DMMP、聚氧乙烯單叔辛苯基醚(Triton X-114)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-110)、異辛烷、氯化鈉、碳酸鈉、硫酸鈉：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

二氯甲烷：色譜純，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

GB、GD：質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于93%，實驗室合成，含量采用酸堿滴定法進行測定[17]。

實驗室用水為純凈水。

1.2 溶液配制

GB、GD、DMMP 混合對照儲備液：分別準(zhǔn)確稱取GB、GD、DMMP 25 mg，用乙腈溶解并定容至25 mL，得到1 mg/mL 的GB、GD、DMMP 混合對照儲備液；準(zhǔn)確移取2.5 mL 1 mg/mL 混合對照儲備液，用乙腈稀釋定容至50 mL，制成50 μg/mL 的GB、GD、DMMP 混合對照儲備液，將二者放置于4℃冰箱中冷藏儲備。

染毒水樣：分別準(zhǔn)確移取8 mL 50 μg/mL 的對照儲備液，加入水定容至1 L，得到0.4 μg/mL 的加標(biāo)樣品溶液。由于GB、GD 在水中會發(fā)生水解，樣品需要現(xiàn)配現(xiàn)用，低溫保存，盡量在短時間內(nèi)完成萃取。

Triton X-114 水溶液：準(zhǔn)確稱取2.5 g Triton X-114，用純凈水溶解并定容至25 mL，得到1 g/mL的Triton X-114 水溶液。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確移取40 mL 染毒水樣放入50 mL 離心管中，加入40 mg 氯化鈉，再向其中加入200 μL Triton X-114水溶液混合均勻后，以1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速，于30 ℃恒溫振蕩10 min，再加入500 μL 異辛烷反向萃取，超聲5 min，混合均勻后以4 500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min 以加速相分離。移取上層超分子溶劑相50 μL，待分析。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜系統(tǒng)

分析柱：DB-5MS 色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；載氣：氦氣，恒流模式，流量為1.0 mL/min；進樣方式：分流進樣，分流比為20∶1；進樣口溫度：250 ℃；進樣體積：1 μL；傳輸線溫度：280℃；柱溫：初始溫度為50 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升溫至200 ℃，再以30 ℃升溫至250 ℃，保持1 min；定量方法：色譜峰面積外標(biāo)法定量。

1.4.2 質(zhì)譜系統(tǒng)

離子源：電子轟擊源(EI)；電子能量：70 eV；電子倍增器電壓：120 V；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描方式：選擇離子(SIM)模式；GB 定量特征碎片離子：質(zhì)荷比分別為99、81、125(輔助)；GD 定量特征碎片離子：質(zhì)荷比分別為99、69、126(輔助)；DMMP 定量特征碎片離子：質(zhì)荷比分別為94、79、109、124(輔助)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別移取50 μg/mL對照儲備液0.04、0.4、2.0、4.0、10.0、30.0 mL，置于6 只50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，得到GB、GD、DMMP 質(zhì)量濃度均分別為0.04、0.4、1.0、4.0、10、30.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在1.4 儀器條件下進行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、目標(biāo)分析物色譜峰面積為縱坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理條件

2.1.1 非離子表面活性劑選擇及其用量

非離子表面活性劑會影響超分子溶劑的組成及尺寸大小，進而影響萃取效率。分別選擇Triton X-114 和Triton X-110 兩種表面活性劑進行試驗，Triton X-114和Triton X-110作為萃取劑，均能實現(xiàn)水中3 種目標(biāo)物的有效萃取，萃取率如圖1 所示。由圖1 可知，Triton X-114 對GB、GD、DMMP 的萃取率分別為87.3%、85.6%和90.1%，優(yōu)于Triton X-110；同時，Triton X-114 具有較低濁點溫度和較高的密度，更有利于超分子的形成與目標(biāo)物的萃取。因此選擇Triton X-114 作為萃取溶劑，并通過離心促進相分離。

圖1 不同非離子表面活性劑的萃取率

Triton X-114溶液的濃度直接關(guān)系到超分子的大小以及目標(biāo)物的萃取率。保持水和NaCl 溶液體積不變，考察TritonX-114 用量分別為100、120、140、160、180、200 μL 時GB、GD 和DMMP 的萃取率，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，3 種目標(biāo)物萃取率均隨著Triton X-114 的用量的增大而增大，GB、GD 萃取率增大相對顯著。當(dāng)Triton X-114 用量為200 μL 時，GB、GD、DMMP 的萃取率均較高，因此選擇Triton X-114 的用量為200 μL。

圖2 Triton X-114 不同用量下的萃取率

2.1.2 異辛烷用量

異辛烷作為反向萃取溶劑，其用量同樣也會對萃取效果產(chǎn)生影響。考察異辛烷不同用量(100、200、300、400、500、600 μL) 對GB、GD 和DMMP萃取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 異辛烷不同用量時的萃取率

由圖3 可知，隨著異辛烷用量的增大，3 種目標(biāo)物萃取率逐漸增大，當(dāng)異辛烷用量不小于500 μL時，萃取率趨于穩(wěn)定?？紤]減少有機溶劑用量，因此異辛烷用量優(yōu)選500 μL。

2.1.3 振蕩時間

利用渦旋能夠加快水中目標(biāo)物轉(zhuǎn)移至超分子溶劑中，使萃取效率在最短時間內(nèi)得到提高。試驗考察了在1 000 r/min轉(zhuǎn)速下，分別振蕩1、5、10、15、20 min 時，GB、GD 和DMMP 的萃取率，試驗結(jié)果見圖4。

圖4 不同振蕩時間的萃取率

由圖4 可知，振蕩時間為1 min 時DMMP 未檢測到；振蕩時間為5～20 min 時，GB、GD 和DMMP 的萃取率基本穩(wěn)定，分別為80.29～88.40%、85.7%～92.3%和89.78%～91.80%，因此振蕩時間選擇為10 min。

2.1.4 鹽的選擇及其用量

向溶液中加入鹽會影響萃取效率。對于大多數(shù)非離子表面活性劑，鹽的存在會促進相分離，因為它們會增加水相的密度；同時鹽析效應(yīng)還可以改變非離子表面活性劑的濁點溫度。為了研究鹽的種類對萃取率的影響，按照1.3前處理方法，分別將氯化鈉、碳酸鈉和硫酸鈉添加到溶液中，GB、GD 和DMMP的萃取率結(jié)果如圖5 所示。

圖5 加入不同鹽時的萃取率

由圖5 可知，加入等量的NaCl 時目標(biāo)物的萃取率明顯比Na2CO3和Na2SO4要高，因此選擇的鹽為NaCl。

分別將0、40、80、160、240、320 mg 的氯化鈉添加到40 mL 樣品溶液中，考察氯化鈉用量對GB、GD 和DMMP 萃取率的影響，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 不同氯化鈉用量下GB、GD 和DMMP 的萃取率

由圖6 可知，當(dāng)氯化鈉添加量大于240 mg 時，富含表面活性劑的相會出現(xiàn)在溶液表面，這會使萃取溶劑更難分離成兩相，準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性可能會受到影響。當(dāng)氯化鈉添加量為40 mg 時，3 種目標(biāo)物均能達(dá)到最佳的萃取效果，因此選擇氯化鈉添加量為40 mg。

2.2 色譜分析條件

對GB、GD 和DMMP 的色譜條件進行了比較，結(jié)果標(biāo)目初始溫度為50 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至200 ℃，以30 ℃/min 升至250℃，保持1 min，此程序為最佳分離條件，分析周期短，分離效果好。SIM 方式只掃描所選定的一個或幾個特征離子，色譜圖本底小，其靈敏度比全掃描提高2～3個數(shù)量級，且選擇性強。作為分子的特征離子，要具有較好的選擇性和靈敏性。通過分析GB、GD 和DMMP 的質(zhì)譜圖，每個化合物選擇相應(yīng)的特征離子作為監(jiān)測離子。GB、GD 和DMMP 的總離子流色譜圖如圖7所示。

圖7 GB、GD 和DMMP 的總離子流色譜圖

2.3 線性方程和檢出限

按照1.4 儀器工作條件測定1.5 中配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計算方法的檢出限和定量限。GB、GD 和DMMP 的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限列于表1。

表1 GB、GD 和DMMP 的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

由表1 可知，GB、GD 和DMMP 在0.040～50 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明該方法具有較高的靈敏度。

2.4 加標(biāo)回收與精密度試驗

以純凈水樣品作為空白基質(zhì)(本底值為0)，分別添加低、中、高3 種水平的GB、GD 和DMMP 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4 儀器工作條件測定，每個樣品水平測定6 次，結(jié)果見表2。由表2 可知，GB、GD 和DMMP 的平均加標(biāo)回收率為80.7%～89.3%，6 次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.87%～9.26%，表明該方法的精密度和準(zhǔn)確度較好。

表2 GB、GD 和DMMP 的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)語

建立了超分子溶劑萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定水中神經(jīng)性毒劑及其模擬劑分析方法，通過單因素試驗考察了影響萃取效果的非離子表面活性劑種類與用量、異辛烷用量、鹽的種類及用量等關(guān)鍵因素。該方法相比于傳統(tǒng)的液相萃取[1，18]法，減少了有機溶劑用量，降低了對環(huán)境和操作人員的危害；樣品前處理步驟更加簡便快速，萃取與凈化過程同步完成，降低了實驗誤差和樣品損失。