房 斌，蔣林時(shí)

(遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧 撫順 113001)

汽油是重要的石油制品，主要由C4～C10烷烴組成，其中異辛烷是其主要成分[1]。汽油在使用過(guò)程中會(huì)不可避免地發(fā)生泄漏和廢棄，造成環(huán)境污染，也會(huì)通過(guò)呼吸、皮膚接觸、飲食攝入等途徑損傷人體[2，3]。環(huán)境中汽油的降解是混合菌共同作用的結(jié)果，通常不同的降解菌降解不同類型的烴分子[4]。

作者在此從石油污染土壤中篩選、分離純化得到一株能以異辛烷為唯一碳源的菌株，并對(duì)其生理生化特性及降解條件進(jìn)行研究，以期為混合菌株應(yīng)用于石油污染的微生物修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種篩選自大慶油田某采油井井臺(tái)周圍被石油污染的土壤。

富集培養(yǎng)基(g·L-1)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH值7.0。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g·L-1)：NaNO30.5，NaH2PO41.0，無(wú)水CaCl20.1，MgSO4·7H2O 0.2，(NH4)2SO40.5，KH2PO41.0，pH值7.0。

固體培養(yǎng)基[5，6]：各培養(yǎng)基中加入2%(質(zhì)量濃度)瓊脂，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的馴化與篩選

取土樣適量，接種于100 mL含500 mg·L-1異辛烷的富集培養(yǎng)基中，于35℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)。按10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的接種量2 d接種1次，使異辛烷濃度逐漸增至1000 mg·L-1、1500 mg·L-1和2000 mg·L-1。然后用以2000 mg·L-1異辛烷為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)4 d。用稀釋平板法將菌液涂布到含500 mg·L-1異辛烷的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，馴化培養(yǎng)5～7 d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落，在富集培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線純化3次，接種于無(wú)機(jī)鹽試管斜面中，待生長(zhǎng)良好置于4℃冰箱保存，備用[7]。

觀察記錄菌株生長(zhǎng)情況、菌落特征、菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)、染色反應(yīng)及生理生化反應(yīng)，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)其進(jìn)行鑒定[8，9]。

1.2.2 異辛烷降解率的測(cè)定

將菌株活化液置于含500 mg·L-1異辛烷的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于35℃、200 r·min-1培養(yǎng)72 h，將培養(yǎng)液離心分離(20 min，3000 r·min-1)，取上清液加入0.5%(以樣液體積計(jì))濃硫酸，用20 mL石油醚萃取3次，收集上層清液用無(wú)水硫酸鈉脫水，過(guò)濾，定容。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定異辛烷殘留量(以吸光度值A(chǔ)217表示)[10，11]，并計(jì)算異辛烷的降解率。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定

菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定采用光電比濁法[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選分離及鑒定

經(jīng)過(guò)反復(fù)馴化、富集培養(yǎng)、劃線分離與純化，篩選到一株具有降解異辛烷能力的菌株，命名為L(zhǎng)SH01。

菌落的形態(tài)特征：表面粗糙，呈規(guī)則線形，扁平，乳白色不透明，挑取時(shí)有粘性。鏡檢顯示：菌細(xì)胞為長(zhǎng)桿狀，菌體呈紫色，屬革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。生理生化特性：氧化酶陽(yáng)性，吲哚反應(yīng)陰性，氧化葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，接觸酶陽(yáng)性，V.P反應(yīng)陽(yáng)性，M.R反應(yīng)陽(yáng)性，分解含硫氨基酸產(chǎn)硫化氫，產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，不利用檸檬酸，不水解淀粉，液化明膠，牛奶胨化，還原硝酸鹽。

依據(jù)Bergey分類系統(tǒng)(1994)芽孢桿菌屬的基本特征，初步鑒定菌株LSH01為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2.2 菌株LSH01的生長(zhǎng)曲線

將菌株LSH01按10%接種量接種于含500 mg·L-1異辛烷的富集培養(yǎng)基中，于35℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定OD600，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 菌株LSH01的生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，接種0～10 h，菌株生長(zhǎng)量無(wú)顯著增加，為延滯期；10～27 h，菌株生長(zhǎng)量快速上升，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；27～46 h，為穩(wěn)定生長(zhǎng)期；46 h后菌株進(jìn)入衰亡期。由此可見，菌株LSH01繁殖速度較快、繁殖能力較強(qiáng)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，對(duì)實(shí)際應(yīng)用較有利。

2.3 溫度對(duì)菌株LSH01生長(zhǎng)和異辛烷降解的影響

菌株LSH01按接種量10%接種，于200 r·min-1、不同溫度下?lián)u床培養(yǎng)72 h，測(cè)定異辛烷降解率和菌株生長(zhǎng)量，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對(duì)菌株LSH01生長(zhǎng)和異辛烷降解的影響

由圖2可知，溫度為35℃時(shí)菌株生長(zhǎng)量和異辛烷降解率最高。這可能是因?yàn)椋⑸锂a(chǎn)生的酶有最適溫度，溫度較低時(shí)，酶活性受到影響，代謝活性差，微生物生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致異辛烷降解效果下降；溫度較高時(shí)，蛋白質(zhì)遭到破壞或凝固，菌株生長(zhǎng)受阻，甚至死亡，也導(dǎo)致異辛烷降解效果下降。因此，確定最適溫度為35℃。

2.4 pH值對(duì)菌株LSH01生長(zhǎng)及異辛烷降解的影響

菌株LSH01按接種量10%接種，于35℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)72 h，考察pH值對(duì)異辛烷降解和菌株生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 pH值對(duì)菌株LSH01生長(zhǎng)和異辛烷降解的影響

由圖3可知，pH值為6.0～8.0時(shí)，菌株生長(zhǎng)良好，pH值為8.0時(shí)生長(zhǎng)量最高；pH值為4.0～8.0時(shí)，隨著pH值的增大異辛烷降解率逐漸升高，pH值為8.0時(shí)降解率達(dá)到最大值，此后又逐漸下降。因此，確定最適pH值為8.0。

2.5 異辛烷濃度對(duì)菌株LSH01生長(zhǎng)及異辛烷降解的影響

菌株LSH01按接種量10%接種，于35℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)72 h，考察異辛烷濃度對(duì)異辛烷降解和菌株生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 異辛烷濃度對(duì)菌株LSH01生長(zhǎng)和異辛烷降解的影響

由圖4可知，異辛烷濃度為500 mg·L-1時(shí)，菌株生長(zhǎng)量最高；異辛烷降解率隨著異辛烷濃度的增大逐漸下降。因此，確定最適異辛烷濃度為500 mg·L-1。

2.6 接種量對(duì)菌株LSH01生長(zhǎng)及異辛烷降解的影響

在35℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)72 h條件下，考察接種量對(duì)異辛烷降解和菌株LSH01生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 接種量對(duì)菌株LSH01生長(zhǎng)和異辛烷降解的影響

由圖5可知，異辛烷降解率和菌株生長(zhǎng)量隨接種量的增大而升高，但接種量超過(guò)15%時(shí)，菌株生長(zhǎng)量顯著下降。這是因?yàn)椋S著接種量的增大，營(yíng)養(yǎng)物消耗較快，代謝產(chǎn)物積累，菌株生長(zhǎng)后期的營(yíng)養(yǎng)匱乏，生物量減少，從而使菌株生長(zhǎng)量下降，降解率趨于平緩。因此，確定最適接種量為15%，此時(shí)異辛烷降解率為74.9%。

3 結(jié)論

通過(guò)富集培養(yǎng)的方法從土壤中分離得到一株能以異辛烷為唯一碳源的菌株LSH01，經(jīng)形態(tài)特征及生理生化特征鑒定，初步確定為芽孢桿菌屬(Bacillus)。其最適生長(zhǎng)溫度為35℃、最適pH值為8.0，在接種量為15%時(shí)，500 mg·L-1異辛烷降解72 h的降解率為74.9%。

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