曹軍營， 崔素娟， 劉高峰， 湯光耀， 張勇， 丁小勇

(聯(lián)勤保障部隊第九八八醫(yī)院心胸外科，河南省鄭州市450042)

長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding RNA，lncRNA)在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄比例比微小核糖核酸(micro-RNA,miRNA)更高，在調(diào)控蛋白編碼基因和其他非編碼基因的表達上同樣發(fā)揮著重要的作用[1]。有研究表明lncRNA MNX1-AS1在前列腺癌等腫瘤組織中高表達，下調(diào)MNX1-AS1可以抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲[2]。據(jù)報道m(xù)iR-218-5p可能是MNX1-AS1的下游miRNA之一，參與肝癌的進展[3]。MNX1-AS1也被證實參與影響肺癌的進展和預(yù)后[4]，但其與miR-218-5p的關(guān)系以及對非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)進展的作用機制尚不明確。本研究探討MNX1-AS1對miR-218-5p表達的影響及其作用機制，為肺癌的診斷和治療提供參考途徑。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

非小細胞肺癌細胞系HCC827、H1299、A549及人正常肺上皮細胞系Beas-2B購自中國科學(xué)院上海細胞庫。細胞均在含有10%胎牛血清(Life Technologies,USA)、100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素(Gibco,NY,USA)的RPMI-1640(Thermo Fisher Scientific,USA)培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至80%進行傳代。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組

MNX1-AS1-shRNA、MNX1-AS1-shRNA陰性對照(shRNA-NC)、miR-218-5p模擬物、miR-218-5p抑制劑、miR-218-5p陰性對照(miR-NC)均購自廣州銳博生物有限公司。取對數(shù)期生長的A549細胞，分為4組：空白對照組、shRNA-NC組、MNX1-AS1-shRNA組、MNX1-AS1-shRNA+miR-218-5p抑制劑組。將各組A549細胞以每孔2×105個接種于6孔板中，待細胞融合至70%左右，按照上述分組，采用LipofectamineTM2000分別或同時轉(zhuǎn)染MNX1-AS1-shRNA、shRNA-NC及miR-218-5p抑制劑，嚴(yán)格按照試劑說明書進行操作。轉(zhuǎn)染12 h更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，提取細胞RNA。

1.3 qRT-PCR

采用Trizol試劑(Invitrogen)提取細胞總RNA，采用cDNA試劑盒(Invitrogen)將RNA反轉(zhuǎn)錄為互補DNA(complementary DNA,cDNA)。采用SYBR Green Master Mix試劑盒，以cDNA為模板，檢測MNX1-AS1和miR-218-5p的表達。MNX1-AS1正向引物：5′-CCCGCATTTTCAGATTCAC-3′，反向引物：5′-GCTCTCAGCCTCGCCATA-3′；miR-218-5p正向引物：5′-CGAGTGCATTTGTGCTTGATCTA-3′，反向引物：5′-TAATGGTCGAACGCCTAACGTC-3′；GAPDH正向引物：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，反向引物：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃15 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算MNX1-AS1和miR-218-5p的相對表達量。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測

采用雙熒光素酶報告基因檢測分析MNX1-AS1與miR-218-5p之間的關(guān)系。分別擴增含有miR-218-5p結(jié)合位點的MNX1-AS1 3′端非編碼區(qū)野生型和突變型序列，插入熒光素酶報告基因質(zhì)粒PsiCHECK2(Promega)構(gòu)建MNX1-AS1 WT和MNX1-AS1 MUT雙熒光素酶載體，與miR-218-5p模擬物、miR-NC共轉(zhuǎn)染至A549細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測熒光素酶的相對活性，實驗重復(fù)3次。

1.5 RNA pull-down實驗

按照RNA pull down試劑盒(Thermo Fisher Scientific,USA)說明書操作。提取A549細胞總RNA。按照試劑盒要求預(yù)處理磁珠，并將miR-218-5p模擬物及miR-NC用生物素(Biotin)進行標(biāo)記，分別為Biotin-miR-218-5p及Biotin-NC；將Biotin-miR-218-5p及Biotin-NC分別與鏈霉親和素磁珠孵育，使其結(jié)合；將其加入總RNA中，室溫輕輕混勻，孵育30 min；而后加入洗脫緩沖液，收集磁珠拉下的RNA復(fù)合物。qRT-PCR對RNA復(fù)合物中的MNX1-AS1的水平進行定量分析。

1.6 MTT檢測

取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，以1×104個/孔接種至96孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別再培養(yǎng)24、48、72、96 h時，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h。棄MTT后，加入150 μL二甲基亞砜振蕩5 min充分溶解。于酶標(biāo)儀(Thermo，USA)570 nm波長處檢測各孔的光密度(optical density,OD)值，以時間點為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細胞增殖曲線。

1.7 流式細胞術(shù)檢測

取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞，消化、緩沖液重懸后，加入5 μL Annexin V，避光孵育10 min，再加入10 μL碘化丙啶(prodium iodide,PI)染色，室溫避光5 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。每組重復(fù)3次。

1.8 Transwell實驗

將RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell小室上室內(nèi)。將轉(zhuǎn)染48 h后的細胞以1×105個/mL接種至Transwell小室上室，下室加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，取出小室，用棉簽擦拭掉上室中未穿過的細胞。70%乙醇固定30 min后，用0.1%的結(jié)晶紫染色。自來水沖洗后，于倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)穿過上室的細胞。隨機選擇5個視野，取平均值。遷移實驗中Transwell小室上室不采用基質(zhì)膠包被，其余實驗步驟同侵襲實驗。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MNX1-AS1和miR-218-5p在NSCLC細胞系中的表達

與正常肺上皮細胞系Beas-2B比較，NSCLC細胞系HCC827、H1299和A549中MNX1-AS1表達水平均顯著升高(P<0.05；圖1A)，而miR-218-5p的表達水平顯著降低(P<0.05；圖1B)。其中A549細胞的變化最為顯著，將其用于后續(xù)實驗。

轉(zhuǎn)染MNX1-AS1-shRNA后A549細胞中MNX1-AS1的表達水平顯著降低(圖1C)，而miR-218-5p水平顯著升高，共轉(zhuǎn)染MNX1-AS1-shRNA和miR-218-5p抑制劑后，miR-218-5p水平降低(P<0.05，圖1D)。

圖1 MNX1-AS1和miR-218-5p在NSCLC細胞系中的表達a為P<0.05，與Beas-2B細胞比較；b為P<0.05，與MNX1-AS1-shRNA組比較。

2.2 MNX1-AS1靶向調(diào)控miR-218-5p

生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)MNX1-AS1與miR-218-5p基因序列之間存在結(jié)合位點(圖2A)。miR-218-5p模擬物能夠顯著降低MNX1-AS1-WT的熒光素酶活性，對MNX1-AS1-MUT的熒光素酶活性無明顯影響(圖2B)。RNA pull down實驗結(jié)果顯示：Biotin-miR-218-5p通過磁珠拉下的MNX1-AS1明顯高于Biotin-NC，提示miR-218-5p能特異性結(jié)合MNX1-AS1(P<0.05，圖2C)。

2.3 MNX1-AS1對A549細胞增殖的影響

MNX1-AS1-shRNA組細胞增殖活力顯著低于空白對照組、shRNA-NC組，但顯著高于MNX1-AS1-shRNA+miR-218-5p抑制劑組(P<0.05；圖3)。

2.4 MNX1-AS1對A549細胞凋亡的影響

與空白對照組和shRNA-NC組比較，MNX1-AS1-shRNA組細胞凋亡率顯著增高；MNX1-AS1-shRNA+miR-218-5p抑制劑組細胞的凋亡率顯著低于MNX1-AS1-shRNA組(P<0.05；圖4)。

2.5 Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染48 h對A549細胞遷移和侵襲的影響

與空白對照組和shRNA-NC組比較，MNX1-AS1-shRNA組細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)顯著降低，而MNX1-AS1-shRNA+miR-218-5p抑制劑組細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)均顯著高于MNX1-AS1-shRNA組(P<0.05；圖5)。

圖2 MNX1-AS1靶向調(diào)控miR-218-5pA為生物信息學(xué)預(yù)測MNX1-AS1與miR-218-5p的結(jié)合位點；B為雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CMNX1-AS1與miR-218-5p的靶向調(diào)控；C為RNA pull down實驗證實MNX1-AS1與miR-218-5p的相互作用。a為P<0.05，與miR-NC組比較；b為P<0.05，與Biotin-NC組比較。

圖3 MNX1-AS1對A549細胞增殖的影響a為P<0.05，與空白對照組比較；b為P<0.05，與shRNA-NC組比較；c為P<0.05，與MNX1-AS1-shRNA組比較。

圖4 MNX1-AS1對A549細胞凋亡的影響

3 討 論

肺癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤前列[5]。靶向治療可有效提高患者的療效并延長生存期，因此備受關(guān)注[6]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA具有非常重要的生物學(xué)功能，包括調(diào)控蛋白編碼基因上游啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄，干擾比鄰蛋白編碼基因表達，作為小分子miRNA等的前體分子等[7-8]。lncRNA可調(diào)控癌細胞的生長、分化和新陳代謝等過程，扮演著抑癌和癌基因的角色[9]。周玫余等[10]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SFTA1P在NSCLC組織中的表達低于癌旁組織，同時在NSCLC A549細胞中低表達，過表達SFTA1P可以抑制A549細胞的增殖、侵襲、遷移。lncRNA、TUC338、MIR4435-2HG等均在肺癌中特異性高表達，并參與調(diào)控癌細胞的增殖活性、侵襲、遷移能力[11-12]。MNX1-AS1已被報道參與多種腫瘤的

圖5 Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染48 h對A549細胞遷移和侵襲的影響(結(jié)晶紫，200×)a為P<0.05，與空白對照組比較；b為P<0.05，與shRNA-NC組比較；c為P<0.05，與MNX1-AS1-shRNA組比較。

發(fā)生發(fā)展過程，如MNX1-AS1在宮頸癌組織及細胞中表達均上調(diào)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)[13]。Gao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MNX1-AS1可通過抑制miR-4443促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。Yang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MNX1-AS1在肺腺癌中高表達，與患者的臨床進展及不良預(yù)后密切相關(guān)。而Liu等[16]則指出，MNX1-AS1/miR-527/BRF2軸作為一個新的信號通路，通過調(diào)控肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，參與肺癌的進展。本研究結(jié)果顯示，MNX1-AS1在肺癌細胞中高表達，干擾MNX1-AS1的表達能夠抑制A549細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。但目前關(guān)于MNX1-A1在肺癌中的作用及機制的相關(guān)研究較少，其機制尚不清楚。

miR-218-5p被報道在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌的作用，如在膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)，通過靶向調(diào)控HMGB1的表達抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲及遷移并誘導(dǎo)凋亡[17]；miR-218-5p能夠靶向結(jié)合EGFR抑制肺癌細胞的增殖和遷移，在肺癌的進展中發(fā)揮重要作用[18]。Zhang等[19]指出，lncRNA LINC-PINT通過靶向調(diào)控miR-218-5p/程序性細胞死亡4(PDCD4)抑制肺癌細胞的增殖、細胞周期、遷移和侵襲。上述研究提示miR-218-5p在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用。MNX1-AS1能夠靶向調(diào)控miR-218-5p，介導(dǎo)結(jié)直腸癌和膀胱癌細胞的增殖、遷移和凋亡等參與癌癥的進展[20-21]。本研究采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚏NA pull down實驗證實MNX1-AS1能夠靶向負調(diào)控miR-218-5p的表達，同時下調(diào)miR-218-5p能夠挽救沉默MNX1-AS1所引起的細胞活性、遷移和侵襲能力的降低以及凋亡率的升高，提示MNX1-AS1靶向負調(diào)控miR-218-5p介導(dǎo)肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡，與現(xiàn)有其他腫瘤相關(guān)的研究結(jié)果一致。

綜上，MNX1-AS1靶向調(diào)控miR-218-5p的表達影響NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲、凋亡等生物學(xué)特性。MNX1-AS1/miR-218-5p通路可能是肺癌診療的新靶標(biāo)之一。但本研究尚未深入分析miR-218-5p的下游靶基因，因此關(guān)于miR-218-5p下游靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需進一步探究，以便更好地分析MNX1-AS1/miR-218-5p在肺癌中的作用機制。