朱婭寧，羊桂英，周琪歡，謝曉俊，漆夢(mèng)雯，沈 毅，莫建初

（浙江大學(xué) 昆蟲(chóng)科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)部作物病蟲(chóng)害分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058）

蟻巢傘屬Termitomyces是一類(lèi)與白蟻共生的真菌，隸屬擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota傘菌亞綱Agaricomycetidae離褶傘科Lyophyllaceae[1]，常于雨季自白蟻菌圃?xún)?nèi)破土而出，俗稱(chēng)雞樅菌，其味道鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，但目前尚未開(kāi)發(fā)出可行的人工栽培模式。白蟻菌圃?xún)?nèi)細(xì)菌種類(lèi)相對(duì)豐富，主要有擬桿菌門(mén)Bacteroidetes、厚壁菌門(mén)Firmicute、放線(xiàn)菌門(mén)Actinobacteria、變形菌門(mén)Proteobacteria、螺旋體門(mén)Spirochaetes等，這些細(xì)菌在菌圃中超過(guò)85%[2]。白蟻菌圃由上層至中層，纖維素及半纖維素的相對(duì)含量保持穩(wěn)定，自下層起，約69%不溶碳水化合物消失，并伴隨可溶性單糖及寡糖增加[3-4]。PAULY等[5]研究表明：僅依靠白蟻?zhàn)陨黼y以完全降解木質(zhì)纖維素，推測(cè)菌圃微生物也參與了木質(zhì)纖維素的降解[6]。

蟻巢傘是白蟻菌圃?xún)?nèi)優(yōu)勢(shì)共生真菌，通過(guò)高通量測(cè)序手段證實(shí)菌圃?xún)?nèi)其他雜菌占比僅0.03%，雜菌中常見(jiàn)的有枝孢屬Cladosporium、木霉屬Trichoderma和傘狀霉屬Umbelopsis等[7]。菌圃開(kāi)始消亡后，炭角菌屬Xylaria及其他真菌會(huì)快速取代蟻巢傘占領(lǐng)整個(gè)菌圃[8]。但也有研究證實(shí)：菌圃中存在助益蟻巢傘的真菌，如云南地白蟻 Hypotermes makhamensis菌圃中的真菌Gigantropanus sp.[9]、胖身土白蟻Odontoterme obesus后腸中的構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans[10]，兩者均能與蟻巢傘協(xié)同降解木質(zhì)纖維素。本研究參考SAWHASAN等[9]的對(duì)峙培養(yǎng)手段，探討了菌圃細(xì)菌與蟻巢傘的互作關(guān)系，并使用高效液相色譜法分析了菌圃細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素能力與相應(yīng)生成產(chǎn)物，旨在用“以菌促菌”的新思路探索蟻巢傘生長(zhǎng)出菇的奧秘。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料來(lái)源 供試黑翅土白蟻 Odontotermes formosanus 蟻巢采自福建省三明市大田縣，室內(nèi) 26 ℃避光飼養(yǎng)。供試蟻巢傘分自黑翅土白蟻蟻巢，為實(shí)驗(yàn)室留存蟻巢傘菌株，經(jīng)分子鑒定為T(mén)ermitomyces heimii，GenBank登錄號(hào)為KF302100[11]。菌圃外源細(xì)菌分離自鐵皮石斛Dendrobium officinal，為貝萊斯芽孢桿菌 Bacillus velezensis。

1.1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)基 1/5 LB 固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 2.000 g、酵母提取物 1.000 g、氯化鈉 2.000 g、瓊脂粉14.000 g、蒸餾水1 L，pH 5；1/10 LB固體培養(yǎng)基：除瓊脂粉外，其余依照1/5 LB培養(yǎng)基，配方減半，pH 5。

1.1.3 真菌分離培養(yǎng)基 1/5 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)：馬鈴薯 40.000 g、葡萄糖 4.000 g、瓊脂粉 14.000 g、蒸餾水 1 L，pH 5；1/10 PDA：除瓊脂粉外，其余物質(zhì)依照 1/5 PDA培養(yǎng)基，配方減半，pH 5；1/5 改良馬丁固體培養(yǎng)基：蛋白胨 1.000 g、酵母提取物 0.400 g、葡萄糖 4.000 g、磷酸氫二鉀0.250 g、七水硫酸鎂 0.125 g、瓊脂粉 14.000 g、蒸餾水 1 L，pH 5；1/10 改良馬丁固體培養(yǎng)基：除瓊脂粉外，其余物質(zhì)依照1/5 改良馬丁固體培養(yǎng)基，配方減半，pH 5。倒平板時(shí)，向上述培養(yǎng)基中添加無(wú)菌水稀釋后的氨芐青霉素和卡那霉素，至兩者在培養(yǎng)基中終質(zhì)量濃度分別為20.000和50.000 mg·L-1。

1.1.4 其他培養(yǎng)基 玉米麩皮纖維素液體培養(yǎng)基：玉米粉 20.000 g、麩皮 10.000 g (玉米粉及麩皮煮熟后過(guò) 4 層紗布過(guò)濾)、磷酸氫二鉀 1.000 g、七水硫酸鎂 0.500 g、纖維素粉末 5.000 g、蒸餾水 1 L，pH 5；玉米麩皮雙倍瓊脂固體培養(yǎng)基同上述配方配制，不加纖維素粉末、瓊脂粉28.000 g，pH 5。

1.2 微生物分離

1.2.1 采集菌圃 取上、中、下層菌圃各 0.050 g 混合。制備菌圃懸液：取 0.010 g 混合菌圃于 2 mL 離心管，加入1 mL無(wú)菌水，渦旋3次，每次30 s，靜置5 min，取上清液。同時(shí)，將菌圃懸液系列梯度稀釋為100、10-1、10-2、10-3用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)菌分離 取 300 μL 稀釋梯度為 10-1、10-2、10-3的菌圃懸液，加入 1/5 LB 固體培養(yǎng)基與 1/10 LB固體培養(yǎng)基后涂布均勻，設(shè)3組重復(fù)，28 ℃避光普通環(huán)境下培養(yǎng)2～3 d，并統(tǒng)計(jì)該培養(yǎng)條件下菌圃細(xì)菌的數(shù)量，菌株純化2次后4 ℃保存。

1.2.3 真菌分離 取小塊菌圃，于 1/5 PDA 培養(yǎng)基、1/10 PDA 培養(yǎng)基、1/5 改良馬丁培養(yǎng)基和 1/10 改良馬丁培養(yǎng)基上，菌圃塊間距為2 cm，設(shè)3組重復(fù)。取300 μL稀釋梯度為100、10-1、10-2的菌圃懸液，分別加入上述培養(yǎng)基后均勻涂布，設(shè)3組重復(fù)，培養(yǎng)條件同1.2.2的細(xì)菌，同時(shí)統(tǒng)計(jì)該培養(yǎng)條件下菌圃真菌的數(shù)量。

1.3 微生物鑒定

1.3.1 細(xì)菌鑒定 提取菌株 DNA，選取通用引物 27F 和 1492R 擴(kuò)增細(xì)菌 16S rRNA 基因片段，擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 次循環(huán)；72 ℃ 5 min。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物送浙江尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在線(xiàn)比對(duì)、鑒定菌株。

1.3.2 真菌鑒定 純化后真菌培養(yǎng)5 d后送浙江尚亞生物技術(shù)有限公司，提取真菌基因組DNA，以其為模版，選取通用引物ITS1與ITS4擴(kuò)增真菌ITS序列，測(cè)序后通過(guò)BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在線(xiàn)比對(duì)、鑒定菌株。

1.4 細(xì)菌對(duì)蟻巢傘生長(zhǎng)影響

1.4.1 制備菌圃細(xì)菌菌液 將分離菌圃細(xì)菌及貝萊斯芽孢桿菌分別接種至玉米麩皮纖維素液體培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r·min-1普通環(huán)境下避光搖培24～28 h后，使用分光光度計(jì)調(diào)整細(xì)菌菌液濃度，選取吸光度D(600)為0.15時(shí)的細(xì)菌菌液作為種子液。取1 mL種子液分別加入100 mL培養(yǎng)基中，條件同上搖培5 d 后，8 000 r·min-1離心 10 min，取上清液備用。

1.4.2 制備玉米麩皮細(xì)菌菌液固體培養(yǎng)基 在直徑 60 mm 培養(yǎng)皿中加入 5 mL 滅菌后菌液上清液，再加入5 mL玉米麩皮雙倍瓊脂固體培養(yǎng)基，搖晃至培養(yǎng)基均勻凝固。接種：滅菌打孔器取直徑為5 mm的蟻巢傘菌餅接入玉米麩皮細(xì)菌菌液固體培養(yǎng)基中，于28 ℃普通環(huán)境下避光培養(yǎng)15 d，不同實(shí)驗(yàn)組設(shè)3組重復(fù)。陽(yáng)性對(duì)照：將滅菌菌液替換為滅菌葡萄糖溶液(20 g·L-1)；陰性對(duì)照：將滅菌菌液替換為無(wú)菌水；中性對(duì)照：將滅菌菌液替換為滅菌后、過(guò)濾后玉米麩皮纖維素液體培養(yǎng)基；雜菌對(duì)照：將滅菌菌液替換為過(guò)濾后貝萊斯芽孢桿菌滅菌菌液。

1.4.3 蟻巢傘生長(zhǎng)情況測(cè)定 蟻巢傘菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定：蟻巢傘在不同玉米麩皮細(xì)菌菌液固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至15 d時(shí)，十字交叉法記錄菌絲直徑，并計(jì)算生長(zhǎng)速率。蟻巢傘生長(zhǎng)形態(tài)觀察：蟻巢傘在玉米麩皮細(xì)菌菌液固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至20 d時(shí)，照相記錄生長(zhǎng)形態(tài)。

1.5 高效液相色譜法測(cè)定細(xì)菌菌液中糖類(lèi)物質(zhì)

1.5.1 待測(cè)液準(zhǔn)備 可溶性糖類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：6 種可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò) (45±1) ℃ 干燥恒量后，分別稱(chēng)取1.000 g (精度0.100 mg)至100 mL容量瓶中，完全溶解后用少量無(wú)菌水定容，過(guò)0.22 μm水系濾頭過(guò)濾。待測(cè)樣品：取滅菌后細(xì)菌上清液，過(guò)0.22 μm水系濾頭過(guò)濾。中性對(duì)照：取滅菌后玉米麩皮液體培養(yǎng)基，過(guò)0.22 μm水系濾頭過(guò)濾。

1.5.2 高效液相色譜法檢測(cè)條件 將可溶性糖類(lèi)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液、待測(cè)樣品及中性對(duì)照送浙江大學(xué)化學(xué)分析測(cè)試平臺(tái)，使用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)儀(HPLC-RID)檢測(cè)糖類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)與含量。儀器及檢測(cè)條件如下：色譜儀為Waters 1525型液相色譜儀；檢測(cè)器為Waters 2414示差折光檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；糖柱為 BENSON 2000-0 BP-OA Organic Acid Column (7.8 mm×300.0 mm，日本)；流動(dòng)相為去離子水；進(jìn)樣量為 50 μL；柱溫為 80 ℃；檢測(cè)器溫度為 40 ℃；流速為 0.8 mL·min-1。

1.6 蟻巢傘與菌圃?xún)?nèi)其他真菌對(duì)峙培養(yǎng)

1.6.1 平板對(duì)峙法[9]將 100 mm 1/5 改良馬丁培養(yǎng)基分為 2 個(gè)半圓區(qū)域，將直徑為 5 mm 的蟻巢傘菌餅接種于一側(cè)中心，28 ℃避光培養(yǎng)10 d后接種雜菌至另一側(cè)，相同條件對(duì)峙培養(yǎng)20 d，設(shè)3組重復(fù)。

1.6.2 菌圃雜菌記錄 移除菌圃?xún)?nèi)蟻王蟻后，在環(huán)境濕度為 100%，溫度為 28 ℃ 避光放置，每隔 24 h拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 白蟻巢菌圃?xún)?nèi)細(xì)菌和真菌的分離鑒定

本研究從白蟻蟻巢菌圃中共分離19株細(xì)菌，分屬厚壁菌門(mén)與變形菌門(mén)，在1/5 LB固體培養(yǎng)基中，菌圃中可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)為1.3×108個(gè)·g-1。BLAST比對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因序列，其中15株屬于厚壁菌門(mén)，分別為巨大芽孢桿菌 Bacillus megaterium (4 株)、阿氏芽孢桿菌 Bacillus aryabhattai (3 株)、蠟樣芽孢桿菌 Bacillus cereus (3 株)、蕈狀芽孢桿菌 Bacillus mycoides (1 株)、土楊芽孢桿菌 Bacillus toyonensis(4 株)； 另 外 4 株 屬 于 變 形 菌 門(mén) ， 分 別 為 Burkholderia sp. (待 定) (2 株)、Burkholderia sp. (1 株)和Cupriavidus sp. (1 株)。

本研究從蟻巢中分離出7個(gè)屬，共12種真菌雜菌，在1/5 改良馬丁培養(yǎng)基中，菌圃中可培養(yǎng)真菌數(shù)為2.8×104個(gè)·g-1。通過(guò)BLAST比對(duì)真菌ITS序列，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，分離的真菌分別為短密木霉菌Trichoderma brevicompactum、暗孢節(jié)菱孢菌 Arthrinium phaeospermum、綠木霉菌 Trichoderma virens、Penicillium pimiteouiense、小孢產(chǎn)絲齒菌 Hyphodontia microspora、Coniochaeta fasciculata、歧皺青霉菌Penicillium steckii、 枝 狀 枝 孢 菌 Cladosporium cladosporioides、Cladosporium velox、Paecilomyces sp. 和Ophiostomatales sp.、短密青霉菌 Penicillium brevicompactum。

本研究發(fā)現(xiàn)：使用菌圃碎片進(jìn)行真菌分離時(shí)，木霉屬菌絲快速鋪滿(mǎn)培養(yǎng)基(圖1A)。當(dāng)菌圃懸液稀釋至100再涂布后，培養(yǎng)基中分離得到的雜菌占比較大(圖1B)，稀釋至10-1時(shí)，培養(yǎng)基中分離到的蟻巢傘占比提高(圖1C)，而稀釋至10-2時(shí)，培養(yǎng)基中僅存在蟻巢傘分離株(圖1D)，且對(duì)照組中未分離到雜菌(圖1E)。菌圃雜菌僅在菌圃碎片及100菌圃懸液分離培養(yǎng)基中出現(xiàn)，推測(cè)菌圃?xún)?nèi)雜菌孢子占比較??；菌圃懸液大量稀釋再涂布仍能分離到蟻巢傘，推測(cè)菌圃?xún)?nèi)蟻巢傘孢子占比較大。

圖1 黑翅土白蟻菌圃?xún)?nèi)真菌的分離Figure 1 Fungi separated from the fungus-combs of O. formosanu

2.2 菌圃細(xì)菌菌液對(duì)蟻巢傘生長(zhǎng)影響

2.2.1 菌圃細(xì)菌菌液對(duì)蟻巢傘菌絲體生長(zhǎng)的影響 從表1可知：除巨大芽孢桿菌和阿氏芽孢桿菌外，所有的厚壁菌門(mén)細(xì)菌發(fā)酵液均可極顯著提升蟻巢傘菌絲生長(zhǎng)速率，最高可使生長(zhǎng)速率提升0.033 cm·d-1(P＜0.01)。變形菌門(mén)細(xì)菌 Burkholderia sp. (待定)、Burkholderia sp. 對(duì)蟻巢傘存在輕微抑制作用，但差異不顯著。

表1 不同菌圃細(xì)菌處理對(duì)蟻巢傘菌絲體生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of different bacterium treatments on the mycelium growth of T. heimii

2.2.2 菌圃細(xì)菌菌液對(duì)蟻巢傘形態(tài)的影響 菌圃厚壁菌門(mén)細(xì)菌菌液均能在一定程度上促進(jìn)蟻巢傘生長(zhǎng)。其中巨大芽孢桿菌、阿氏芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵菌液加入培養(yǎng)基后可促使蟻巢傘菌絲糾結(jié)凸起，呈現(xiàn)圓弧狀紐結(jié)(圖2A、圖2B和圖2C)。而其余厚壁菌門(mén)細(xì)菌蕈狀芽孢桿菌和土楊芽孢桿菌發(fā)酵菌液加入后，菌絲雖無(wú)凸起(圖2D和圖2E)，但菌絲生長(zhǎng)面積擴(kuò)大。

菌圃變形菌門(mén)細(xì)菌菌液可在一定程度上抑制蟻巢傘生長(zhǎng)。Burkholderia sp. (待定)細(xì)菌菌液對(duì)蟻巢傘生長(zhǎng)有明顯抑制作用，表現(xiàn)為培養(yǎng)基中蟻巢傘菌絲層幾乎消失(圖2F)。而B(niǎo)urkholderia sp. 和Cupriavidus sp. 細(xì)菌菌液加入后，蟻巢傘菌絲層僅僅輕微變薄(圖2G和圖2H)。

厚壁菌門(mén)細(xì)菌對(duì)蟻巢傘生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，這與加入葡萄糖溶液的陽(yáng)性對(duì)照組相似(圖2I)，較中性對(duì)照(圖2J)和蒸餾水的陰性對(duì)照(圖2K)生長(zhǎng)更旺盛。與菌圃?xún)?nèi)源性細(xì)菌菌液表現(xiàn)有所不同，外源厚壁菌門(mén)細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌菌液既不抑制也不促進(jìn)蟻巢傘的生長(zhǎng)，但對(duì)其有強(qiáng)致畸作用，表現(xiàn)為蟻巢傘菌絲畸變，完全無(wú)法生長(zhǎng)(圖2L)，推測(cè)菌圃外源細(xì)菌對(duì)蟻巢傘生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，白蟻對(duì)其有一定選擇作用。

圖2 不同菌液處理下蟻巢傘形態(tài)變化Figure 2 Morphological changes of T. heimii under fungus-combs bacterial fermented broths treatment

2.3 高效液相色譜分析

由于蟻巢傘利用木質(zhì)纖維素能力較低，偏好利用簡(jiǎn)單糖類(lèi)物質(zhì)[8]，故本研究選取了6種組成相對(duì)簡(jiǎn)單的可溶性糖類(lèi)物質(zhì)，測(cè)定高效液相色譜出峰時(shí)間。表2表明：?jiǎn)翁羌半p糖出峰時(shí)間集中在6～8 min。

表26 種常見(jiàn)的簡(jiǎn)單糖類(lèi)物質(zhì)高效液相色譜出峰時(shí)間Table 2 Retention time of six simple carbohydrates by high performance liquid chromatography (HPLC)

使菌絲紐結(jié)凸起的巨大芽孢桿菌、阿氏芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌菌液在6～8 min有明顯出峰(圖3A、圖3B和圖3C)，對(duì)照表2各糖類(lèi)物質(zhì)的出峰時(shí)間可判斷菌圃細(xì)菌菌液中生成了大量可溶性簡(jiǎn)單糖類(lèi)物質(zhì)，如單糖和雙糖，推測(cè)這些簡(jiǎn)單糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)促進(jìn)蟻巢傘菌絲紐結(jié)凸起有一定作用。而能促進(jìn)蟻巢傘生長(zhǎng)、卻無(wú)法促其菌絲紐結(jié)的蕈狀芽孢桿菌和土楊芽孢桿菌菌液在6～8 min有輕微出峰，同時(shí)在4～5 min有顯著出峰(圖3D和圖3E)，推測(cè)出峰時(shí)間為4～5 min的新生成可溶性糖類(lèi)物質(zhì)僅能促進(jìn)蟻巢傘菌絲生長(zhǎng)而無(wú)法促進(jìn)菌絲紐結(jié)。綜上，出峰時(shí)間為6～8 min的糖類(lèi)物質(zhì)更易被蟻巢傘利用，出峰時(shí)間為4～5 min的糖類(lèi)物質(zhì)次之。前者能助益蟻巢傘菌絲紐結(jié)凸起，在蟻巢傘出菇方面有一定的促進(jìn)作用。

變形菌門(mén)細(xì)菌 Burkholderia sp. (待定)、Burkholderia sp. 和 Cupriavidus sp. 發(fā)酵菌液在 4～5 min 和 6～8 min均有出峰(圖3F、圖3G和圖3H)，本應(yīng)促進(jìn)蟻巢傘生長(zhǎng)，但卻在一定程度上抑制了菌絲生長(zhǎng)，具體表現(xiàn)為菌絲層變薄，甚至幾乎不生長(zhǎng)。可推測(cè)這3種細(xì)菌菌液中均生成了一定的抑制物質(zhì)，其中Burkholderia sp. (待定)發(fā)酵菌液中生成的強(qiáng)抑制物質(zhì)在滅菌后仍有抑制活性，較為穩(wěn)定。

總體而言，菌圃細(xì)菌發(fā)酵菌液的色譜峰總面積均顯著高于中性對(duì)照(圖3I)，說(shuō)明菌液中可溶性糖含量增加，證實(shí)菌圃細(xì)菌可降解培養(yǎng)基中的木質(zhì)纖維素，并轉(zhuǎn)化生成可溶性糖類(lèi)物質(zhì)。

圖3 菌圃細(xì)菌菌液高效液相色譜分析圖Figure 3 High performance liquid chromatography (HPLC) analysis of bacterial fermentation broths in the termite fungus-combs

2.4 蟻巢傘和菌圃?xún)?nèi)其他真菌對(duì)峙培養(yǎng)

蟻巢傘自身抗雜菌能力較弱，無(wú)法抑制其他菌圃雜菌的生長(zhǎng)(圖4)。此外，菌圃雜菌也無(wú)法促進(jìn)蟻巢傘的生長(zhǎng)，這與SAWHASAN等[9]的結(jié)果相悖，可能是采用不同培養(yǎng)基所導(dǎo)致的。生長(zhǎng)速度越快的雜菌對(duì)蟻巢傘影響越大，表現(xiàn)為蟻巢傘快速被雜菌侵染，無(wú)法正常生長(zhǎng)；生長(zhǎng)速度較慢的雜菌對(duì)蟻巢傘生長(zhǎng)影響較小，但與對(duì)照相比雜菌仍產(chǎn)生了一定的抑制作用。

圖4 蟻巢傘與黑翅土白蟻菌圃?xún)?nèi)其他真菌對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)Figure 4 Antagonistic culture of T. heimii with other fungi separated from the fungus-combs

2.5 白蟻巢群消亡后真菌雜菌生長(zhǎng)情況

菌圃消亡后雜菌將快速侵占菌圃(圖5)。自菌圃消亡后，菌圃?xún)?nèi)幼蟻的活動(dòng)能力降低，在蟻巢消亡后生長(zhǎng)速度較快的真菌如青霉屬Penicillium和木霉屬Trichoderma對(duì)蟻巢的威脅和影響最大，它們將快速生長(zhǎng)、入侵直至菌圃完全被包裹。這些雜菌在自然界中普遍存在，但在有白蟻活動(dòng)的菌圃?xún)?nèi)卻受到抑制、無(wú)法生長(zhǎng)，而自巢群消亡開(kāi)始，雜菌迅速占領(lǐng)菌圃，推測(cè)菌圃的低含水量以及白蟻分泌的部分抑菌物質(zhì)是抑制雜菌生長(zhǎng)的兩大主要原因。

圖5 菌圃消亡后 5 d 內(nèi)菌圃中真菌類(lèi)雜菌生長(zhǎng)情況Figure 5 Fungi growth in 5 days after deaid termite fungus-combs

3 討論

厚壁菌門(mén)為菌圃中的五大主要細(xì)菌類(lèi)群之一，在不同時(shí)期菌圃?xún)?nèi)該門(mén)類(lèi)細(xì)菌占比會(huì)發(fā)生一定變化[12]。在無(wú)蟻巢傘子實(shí)體生長(zhǎng)的黑翅土白蟻蟻巢中，厚壁菌門(mén)細(xì)菌占比較有蟻巢傘子實(shí)體生長(zhǎng)的蟻巢更大[13]，推測(cè)厚壁菌門(mén)細(xì)菌對(duì)蟻巢傘出菇有促進(jìn)作用。本研究也證實(shí)：菌圃厚壁菌門(mén)細(xì)菌菌液確對(duì)蟻巢傘菌絲生長(zhǎng)及紐結(jié)有利，而同屬厚壁菌門(mén)的外源細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌對(duì)蟻巢傘有強(qiáng)致畸作用，推測(cè)為了保證蟻巢傘正常生長(zhǎng)，白蟻對(duì)菌圃?xún)?nèi)微生物有一定選擇性。目前共發(fā)現(xiàn)330種大白蟻亞科Macrotermitinae菌培白蟻[14]，其低齡工蟻以菌圃?xún)?nèi)植物材料以及菌絲瘤(蟻巢傘菌絲及分生孢子糾集而成)為食[8]，菌絲瘤的存在能調(diào)節(jié)白蟻食物組成的碳氮比[15]。作為食物的菌絲瘤若不加以調(diào)控，可能會(huì)無(wú)休止地生長(zhǎng)，影響白蟻?zhàn)陨砩?，因此推測(cè)白蟻可能通過(guò)調(diào)控菌圃?xún)?nèi)細(xì)菌種群來(lái)控制菌絲瘤大小，使其不過(guò)度生長(zhǎng)，易于白蟻食用。

白蟻對(duì)菌圃微生物有一定的選擇性[6，12]，而B(niǎo)urkholderia sp. (待定)雖能強(qiáng)烈抑制蟻巢傘生長(zhǎng)，但由于存在于菌圃?xún)?nèi)，并不會(huì)被“排外”，加之其抑制蟻巢傘生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物非常穩(wěn)定，故Burkholderia sp. (待定)或其代謝產(chǎn)物可考慮為一種生物防治手段，通過(guò)抑制蟻巢傘的生長(zhǎng)，阻礙蟻巢存續(xù)。

木質(zhì)纖維素在歷經(jīng)白蟻腸道微生物作用之后，由菌圃?xún)?nèi)微生物繼續(xù)降解，并最終生成可溶性多糖，供蟻巢傘和白蟻利用[8]。本研究采用pH 5的玉米麩皮纖維素培養(yǎng)基在模擬菌圃環(huán)境的同時(shí)還為菌圃細(xì)菌提供了一定養(yǎng)分，木質(zhì)纖維素的加入則更有利于探索菌圃細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素的能力以及相關(guān)代謝產(chǎn)物對(duì)蟻巢傘生長(zhǎng)的影響。蟻巢傘自身缺少獨(dú)立降解木質(zhì)纖維素的能力，且其分泌的木質(zhì)纖維素降解酶種類(lèi)也較為有限[16]，反觀菌圃?xún)?nèi)細(xì)菌卻能通過(guò)產(chǎn)生大量木質(zhì)纖維素降解酶的方式參與協(xié)同高效降解木質(zhì)纖維素[17]。LI等[3]研究發(fā)現(xiàn)：上、中、下層菌圃分別失去了13%、45%、60%的木質(zhì)素，而葡糖糖卻相應(yīng)地增加了14%、28%、42%。以上研究均與本研究結(jié)果相吻合：菌圃細(xì)菌具有降解木質(zhì)纖維素、生成可溶性單糖和寡糖的能力，菌圃細(xì)菌和蟻巢傘在降解木質(zhì)纖維素方面有上下游協(xié)同作用，且生成的簡(jiǎn)單可溶性糖類(lèi)物質(zhì)如葡萄糖等對(duì)蟻巢傘生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

OTANI等[7]通過(guò)高通量測(cè)序證實(shí)：菌圃?xún)?nèi)蟻巢傘占菌圃真菌的99.90%，而其余20個(gè)屬真菌僅占0.07%。本研究也表明：菌圃中蟻巢傘孢子數(shù)量確實(shí)遠(yuǎn)大于其他真菌，菌圃中存在部分常見(jiàn)的霉菌，在菌圃消亡后將對(duì)菌圃造成一定威脅。同時(shí)OTANI等[7]發(fā)現(xiàn)：大部分雜菌與雞縱菌共培養(yǎng)后生長(zhǎng)受到抑制，但本研究結(jié)果卻與之相悖，蟻巢傘幾乎無(wú)法抑制雜菌生長(zhǎng)。KATARIYA等[18]研究表明：白蟻能夠分泌抗菌肽抑制菌圃雜菌，這與本研究推測(cè)結(jié)果相吻合，即相比蟻巢傘，白蟻才是外來(lái)雜菌的主要防御者。

本研究初步分析了菌圃中單個(gè)微生物對(duì)蟻巢傘生長(zhǎng)的影響。今后需要從多個(gè)菌圃微生物對(duì)蟻巢傘生長(zhǎng)的影響為切入點(diǎn)，深入研究“以菌促菌”的思路，以促進(jìn)人工條件下大量培育蟻巢傘。