呂翠婷，尹 情，韓俊淑，董稚明，郭 煒，沈素朋，梁 佳，郭艷麗

我國食管癌的發(fā)病率和病死率均較高，90%為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[1]。2018年WHO公布的癌癥報(bào)告顯示，我國食管癌患者總數(shù)約占全球食管癌患者的1/2。目前我國在ESCC的診斷和治療方面雖然有了很大進(jìn)展，但ESCC患者的治療效果以及遠(yuǎn)期預(yù)后仍不理想，5年生存率不足20%[2]。近年來大量文獻(xiàn)報(bào)道，長鏈非編碼RNA(lncRNA)的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)[3-5]。LINC00665在乳腺癌[6-7]、前列腺癌[8]、胃癌[9]、膠質(zhì)瘤[10]、結(jié)腸癌[11]、骨肉瘤[12]中均異常表達(dá)，并可通過多種機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其在ESCC中的作用及機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)著重探討LINC00665在ESCC組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況，分析其異常表達(dá)對ESCC細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響及其發(fā)揮作用的可能分子機(jī)制，為ESCC患者的臨床靶向治療提供候選分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012～2015年河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生物樣本庫存檔的98例ESCC標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未行放、化療。每例標(biāo)本均同時(shí)切取癌組織原發(fā)灶及距癌組織2～5 cm處的癌旁組織，一部分手術(shù)切除標(biāo)本保存于-80 ℃低溫冰箱中，用于RNA的提取，另一部分進(jìn)行石蠟包埋，行常規(guī)HE染色，經(jīng)病理醫(yī)師診斷證實(shí)癌組織均為ESCC，癌旁組織均為正常黏膜組織。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株及試劑ESCC細(xì)胞株Kyse150、Kyse170、Eca109、TE13、TE1由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生物樣本庫留存并傳代。Trizol總RNA提取液、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和PARIS均購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse Transcription System A3 500)、雙熒光報(bào)告基因檢測試劑盒和MTS試劑均購自美國Promega公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Transwell小室及Matrigel膠購自美國Corning公司；miR-708-5p mimics購自中國GenePharma公司。本實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Kyse150、Kyse170、Eca109、TE13和TE1細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃ 5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期且細(xì)胞狀態(tài)良好的TE13細(xì)胞，常規(guī)消化并接種于6孔板中(2×105個(gè)/孔)繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長匯合度達(dá)70%～80%時(shí)，按照Lipofectanine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將pcDNA3.1-LINC00665、陰性對照(negative control, NC)或miR-708-5p mimics及相應(yīng)陰性對照(miR-NC)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.2qRT-PCR法檢測LINC00665及miR-708-5p的表達(dá) 按Trizol試劑說明書提取組織及細(xì)胞株中總RNA，參照Promega的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于檢測LINC00665及miR-708-5p的表達(dá)，并以GAPDH或U6作為內(nèi)參照。LINC00665引物序列：上游5′-GGTGCAAAGTGGG AAGTGTG-3′，下游5′-CGGTGGACGGATGAGAAA CG-3′。結(jié)果采用相對定量法，目的基因的相對表達(dá)量用2-△△Ct表示，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt -ΔCt對照。

1.3.3MTS實(shí)驗(yàn)檢測TE13細(xì)胞的增殖能力 將每毫升3×103個(gè)TE13細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別于細(xì)胞貼壁后0、24、48、72和96 h時(shí)在每孔加入20 μL(500 μg/mL)MTS試劑，在37 ℃ 5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測每孔的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測TE13細(xì)胞的侵襲能力 常規(guī)消化并懸浮TE13細(xì)胞于無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度接種于小室上腔(1×105個(gè)/孔)，下腔加入含10%FBS的600 μL RPMI-1640。培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5雙熒光素酶報(bào)告基因分析 將含有LINC00665與miR-708-5p結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域片段插入熒光素酶報(bào)告基因載體pmirGLO構(gòu)建pmirGLO-LINC00665報(bào)告基因質(zhì)粒。同樣用含有DKK3基因3′UTR序列片段(含有miR-708-5p結(jié)合位點(diǎn))構(gòu)建pmirGLO-DKK3報(bào)告基因質(zhì)粒。將相應(yīng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染TE13細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測定相對熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6亞細(xì)胞定位檢測 根據(jù)PARIS試劑盒說明書，從TE13細(xì)胞中分離出細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA后進(jìn)行qRT-PCR分析，以確定表達(dá)LINC00665的亞細(xì)胞分布情況。GAPDH為胞質(zhì)表達(dá)的內(nèi)參照，U6為細(xì)胞核表達(dá)的內(nèi)參照。

1.3.7數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用 分別應(yīng)用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)及Starbase V3.0(https: //starb ase.sysu.edu.cn/)數(shù)據(jù)庫分析LINC00665、miR-708-5p在食管癌組織及正常組織中的表達(dá)情況；應(yīng)用在線網(wǎng)站LncBase(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=site/page&view=software)分析可能與LINC00665結(jié)合的miRNA；應(yīng)用Starbase V3.0、miRDB(http://mirdb.org/)、TargetScan 7.1(https://www.targetscan.org/vert_71/)、RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/)網(wǎng)站預(yù)測miR-708-5p的潛在靶基因。

2 結(jié)果

2.1 ESCC及癌旁正常組織中LINC00665的表達(dá)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，ESCC組織中LINC00665的表達(dá)量為3.834±2.016，明顯低于癌旁正常組織(7.973±2.752)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.011，P<0.001，圖1A)。與癌旁正常組織相比，98例ESCC組織中86例LINC00665表達(dá)下調(diào)，其中56例表達(dá)下調(diào)達(dá)50%以上(圖1B)。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果同樣顯示LINC00665在食管癌組織中表達(dá)下調(diào)(圖1C)。此外，LINC00665表達(dá)與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及TNM分期有關(guān)(P均<0.05，表1)。

表1 LINC00665表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

圖1 A.qRT-PCR法檢測食管鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常組織中LINC00665的表達(dá)；B.98例食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織中LINC00665表達(dá)量的比值：>1表達(dá)上調(diào)；<1表達(dá)下調(diào)；C.GEPIA數(shù)據(jù)庫分析LINC00665在食管癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2 LINC00665對ESCC細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響qRT-PCR檢測Eca109、TE1、TE13、Kyes150、Kyse170細(xì)胞株中LINC00665的表達(dá)情況，對照組采用10例食管正常黏膜組織cDNA的等比例混合物(Pools)。結(jié)果顯示ESCC細(xì)胞株中LINC00665的表達(dá)量均低于對照組(P<0.05，圖2A)。在LINC00665表達(dá)量最低的TE13細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LINC00665過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-LINC00665，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后LINC00665表達(dá)量顯著升高(P<0.001，圖2B)。分別應(yīng)用MTS及Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測LINC00665對TE13細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LINC00665可明顯降低TE13細(xì)胞的增殖(P<0.05，圖2C)及侵襲能力(P<0.05，圖2D)。

圖2 LINC00665對食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響：A.LINC00665在Eca109、TE1、TE13、Kyes150、Kyse170細(xì)胞中的表達(dá)水平；B.qRT-PCR檢測TE13細(xì)胞中pcDNA3.1-LINC00665的轉(zhuǎn)染效率；MTS及Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測LINC00665對TE13細(xì)胞增殖(C)及侵襲(D)能力的影響

2.3 LINC00665與miR-708-5p的相互作用研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可在細(xì)胞質(zhì)中通過海綿吸附miRNAs而調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，即為競爭內(nèi)源性RNA機(jī)制(ceRNA機(jī)制)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，LINC00665主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖3A)。在線生物信息學(xué)分析網(wǎng)站LncBase預(yù)測顯示，miR-708-5p與LINC00665有潛在的結(jié)合位點(diǎn)(圖3B)。因此，為進(jìn)一步探討LINC00665通過miR-708-5p發(fā)揮ceRNA機(jī)制的可能性，依據(jù)Starbase V3.0數(shù)據(jù)庫分析162例食管癌及11例癌旁正常組織中miR-708-5p的表達(dá)情況，結(jié)果顯示食管癌組織中miR-708-5p表達(dá)明顯上調(diào)(圖3C)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LINC00665可明顯降低TE13細(xì)胞中miR-708-5p的表達(dá)水平(P<0.05，圖3D)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-708-5p mimics組能明顯降低pmirGLO-LINC00665組細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.05，圖3E)。表明LINC00665與miR-708-5p有結(jié)合作用。

圖3 LINC00665競爭結(jié)合miR-708-5p：A.qRT-PCR檢測LINC00665在TE13細(xì)胞中的亞細(xì)胞分布情況；B.LncBase網(wǎng)站預(yù)測LINC00665與miR-708-5p的結(jié)合位點(diǎn)；C.Starbase V3.0數(shù)據(jù)庫分析食管癌及正常組織中miR-708-5p的表達(dá)；D.qRT-PCR檢測LINC00665過表達(dá)對miR-708-5p表達(dá)的影響；E.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-708-5p過表達(dá)對報(bào)告基因熒光活性的影響

2.4 LINC00665競爭性結(jié)合miR-708-5p對DKK3基因表達(dá)的影響運(yùn)用多個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(Starbase V3.0、miRDB、TargetScan 7.1和RNA22)預(yù)測miR-708-5p的潛在靶基因(圖4A)。交集后評分較高的DKK3是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的拮抗基因。本實(shí)驗(yàn)選取DKK3作為靶基因進(jìn)行分析。圖4B顯示DKK3與miR-708-5p的結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-708-5p mimics明顯降低DKK3基因的表達(dá)水平(圖4C)；雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果亦顯示，miR-708-5p過表達(dá)明顯降低了含DKK3 3′UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)片段報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性(圖4D)。結(jié)果表明DKK3是miR-708-5p的直接靶基因。

為證實(shí)LINC00665的ceRNA機(jī)制，進(jìn)一步實(shí)施了回復(fù)實(shí)驗(yàn)。miR-708-5p過表達(dá)可抵消TE13細(xì)胞中由LINC00665過表達(dá)誘導(dǎo)的DKK3表達(dá)和報(bào)告基因熒光素酶活性的上調(diào)(圖4E、F)。上述結(jié)果表明LINC00665通過靶向miR-708-5p/DKK3軸發(fā)揮ceRNA作用。

圖4 LINC00665通過競爭性結(jié)合miR-708-5p靶向調(diào)控DKK3的表達(dá)：A.Starbase V3.0、miRDB、TargetScan 7.1和RNA22網(wǎng)站預(yù)測LINC00665靶基因的韋恩圖；B.TargetScan 7.1預(yù)測miR-708-5p與DKK3的結(jié)合位點(diǎn)；C.miR-708-5p過表達(dá)對DKK3基因表達(dá)量的影響；D.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-708-5p過表達(dá)對DKK3報(bào)告基因熒光素酶活性的影響；E、F.miR-708-5p過表達(dá)部分挽救了LINC00665過表達(dá)引起的DKK3基因表達(dá)以及基因熒光素酶活性的上調(diào)

3 討論

研究表明LINC00665在多種腫瘤中異常表達(dá)，但其發(fā)揮的功能具有腫瘤特異性，在不同腫瘤中可發(fā)揮抑癌或促癌基因作用[6-12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LINC00665在ESCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均下調(diào)，并且其低表達(dá)與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM分期密切相關(guān)。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LINC00665在體外抑制了TE13細(xì)胞的增殖及侵襲能力。提示LINC00665在ESCC發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著抑癌基因作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，LINC00665作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)，可通過miR-379-5p/LIN28B軸、miR-1224-5p/SND1軸、miR-149-3p/RNF2軸、miR-9-5p/ATF1軸、miR-214-3p/PSMD10/ASF1B軸等分別參與乳腺癌[6]、前列腺癌[10]、胃癌[9]、結(jié)腸癌[11]、多發(fā)骨髓瘤[13]的惡性進(jìn)程，提示ceRNA機(jī)制可能是該lncRNA發(fā)揮其功能的主要作用機(jī)制。lncRNAs的生物學(xué)功能依賴于其亞細(xì)胞定位，分布于細(xì)胞質(zhì)中的lncRNAs能夠通過海綿吸附miRNA發(fā)揮其ceRNA功能[3]。作者通過對LINC00665的亞細(xì)胞分布檢測發(fā)現(xiàn)其在TE13細(xì)胞中也同樣主要定位于細(xì)胞質(zhì)，于是本實(shí)驗(yàn)著重從ceRNA角度探討LINC00665抑制ESCC細(xì)胞增殖、侵襲能力的可能分子機(jī)制。通過生物信息學(xué)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-708-5p與LINC00665有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-708-5p的功能具有腫瘤特異性，在不同腫瘤中發(fā)揮著不同的功能。在膀胱癌[14]、結(jié)腸癌[15]中作為原癌基因促進(jìn)了腫瘤的惡性進(jìn)展；而在肝細(xì)胞癌[16]、卵巢癌[17]、腎細(xì)胞癌[18]中則發(fā)揮抑癌基因作用。而ESCC中miR-708-5p的作用則罕有報(bào)道，僅在Yang等[19]對113例ESCC標(biāo)本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)miR-708-5p表達(dá)明顯上調(diào)。Starbase V3.0數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果亦顯示miR-708-5p在食管癌中表達(dá)上調(diào)。提示miR-708-5p在食管癌中可能發(fā)揮促癌基因功能。同時(shí)，研究顯示，LINC00665過表達(dá)明顯降低了TE13細(xì)胞中miR-708-5p的表達(dá)水平，結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因檢測進(jìn)一步證明了miR-708-5p與LINC00665的結(jié)合作用。提示LINC00665可能通過海綿吸附miR-708-5p發(fā)揮其生物學(xué)功能。

DKK3是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的拮抗基因之一，通過結(jié)合Wnt的共受體LRP5/6使活化的受體復(fù)合物Wnt-Frizzled-LRP5/6無法形成，而特異性阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路[20]。目前研究結(jié)果證明miR-708-5p直接靶向DKK3。同時(shí)，通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)及熒光素酶報(bào)告基因檢測證明LINC00665通過競爭結(jié)合miR-708-5p靶向調(diào)控DKK3的表達(dá)，即LINC00665/miR-708-5p/DKK3軸的存在亦證實(shí)了LINC00665的ceRNA功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LINC00665在ESCC組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。LINC00665過表達(dá)可抑制ESCC細(xì)胞的增殖及侵襲能力，并可通過與miR-708-5p的競爭結(jié)合靶向調(diào)控DKK3基因的表達(dá)，進(jìn)而影響食管癌患者的惡性進(jìn)程。