顧麗琴，濮陽隆翔，謝 芳

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移及復發(fā)不僅與患者遺傳易感性相關，還與機體的免疫狀態(tài)和腫瘤微環(huán)境密切相關。腫瘤細胞表面低表達或不表達主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)分子使T細胞缺乏活化必需的第一信號，以致難以介導有效的抗腫瘤免疫應答[1]。以自然殺傷細胞(NK細胞)為代表的固有免疫應答主要針對MHC分子下調或缺失的惡變細胞及病毒感染細胞[2]；因此，NK細胞及其固有免疫應答在抗腫瘤免疫中的作用不可或缺[3-4]。

2012年，Topalian等[5]和Brahmer等[6]共同報道了抗PD-L1、PD-1單抗治療腫瘤的臨床研究成果，使針對免疫卡控點的免疫治療成為腫瘤治療的新熱點。但僅部分腫瘤晚期患者在抗PD-L1或PD-1抗體治療后腫瘤出現(xiàn)部分或完全消退[7]，這提示針對PD-1/PD-L1分子及信號的腫瘤免疫治療可能還存在其他機制。作為腫瘤免疫治療的“明星分子”PD-1/PD-L1分子在NK細胞及其抗腫瘤免疫中的作用尚不明確。因此，該文現(xiàn)就PD-1/PD-L1分子和NK細胞的生物學特征、PD-1/PD-L1分子在NK細胞中的表達以及對NK細胞抗腫瘤免疫的影響作一綜述，探討PD-1/PD-L1分子在調控NK細胞抗腫瘤免疫應答中的重要作用，為腫瘤免疫治療提供新思路。

1 PD-1/PD-L1分子的生物學特性

1.1 PD-1/PD-L1分子的發(fā)現(xiàn)PD-L1分子又稱B7H1、CD274，屬于B7家族成員，其全長為290個氨基酸，包含1個IgV樣區(qū)、1個IgC樣區(qū)、1個跨膜疏水區(qū)和1個由30個氨基酸組成的胞內區(qū)[8]。PD-L1分子廣泛表達于抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)、T細胞、NK細胞以及內皮細胞、胰島細胞等免疫細胞和非免疫細胞[8]，黑色素瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌、胃癌、腎細胞癌等腫瘤細胞胞膜和胞質中也可見表達[9-10]。其受體PD-1分子為相對分子質量為(5.0～5.5)×104的Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)成員[11]。其分子結構包括胞外IgV段、跨膜段和胞內段；胞內段則包含一個免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)和免疫受體酪氨酸轉化基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM)。PD-1分子主要表達于活化T細胞，為活化T細胞的標志之一[11]。隨著研究的深入，T、B、NK細胞以及腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)中均發(fā)現(xiàn)PD-1分子的表達[11]。

1.2 PD-1/PD-L1分子的作用PD-1/PD-L1分子是免疫系統(tǒng)中抑制免疫反應、調控免疫耐受及維持免疫平衡的一對重要負性共刺激分子，與CTLA-4、B7-H3、B7-H4等并稱為免疫卡控點分子，能從多個環(huán)節(jié)和信號通路向T細胞傳遞抑制性信號[11-12]。

當活化T細胞表面的PD-1分子與APC表面PD-L1分子結合后，可通過抑制PI3K/Akt通路進而抑制抗凋亡基因BCL-XL的表達來促進效應性T細胞凋亡，上調p27kip1抑制效應性T細胞的增殖[13]。PD-1/PD-L1信號還可通過抑制蛋白激酶Cδ的磷酸化導致T細胞活化增殖所必需的IL-2分泌下降，使效應性T細胞增殖受抑并滯留在G1期[11,13]。研究還發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1信號可通過募集Src同源區(qū)蛋白酪氨酸(src homology 2-containing protein-tyrosine phosphatase 1/2, SHP1/2)的磷酸化[11]，抑制酪氨酸激酶ZAP70的磷酸化，并下調T細胞活化必需的第一信號，介導T細胞的死亡[11]。SHP1/2的磷酸化還可抑制轉錄因子BCL-6的表達，阻止CD4+T細胞分化為濾泡性輔助性T細胞[11]。

正常生理條件下，PD-1/PD-L1信號通路的激活可啟動多條抑制信號及通路發(fā)揮抑制T細胞活化、生存、增殖、遷移并誘導效應性T細胞凋亡[11,13]，以維持免疫平衡，避免自身免疫性疾病的發(fā)生。免疫性腦脊髓膜炎、免疫性糖尿病的動物模型也證實PD-1/PD-L1信號通路的缺失會導致自身免疫性疾病的發(fā)生[14]。在感染性免疫以及移植免疫中，PD-1/PD-L1信號通路的激活可有效調節(jié)免疫反應的強度，抑制T細胞的活化和增殖，避免T細胞對組織的持續(xù)性損傷[15]。

1.3 PD-1/PD-L1分子與腫瘤繼黑色素瘤、非小細胞肺癌之后，胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、腎透明細胞癌、頭頸部鱗狀細胞癌、食管癌、子宮頸癌、胰腺癌、膠質母細胞瘤等眾多腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)存在PD-L1分子的過表達，且其與腫瘤患者的不良預后密切相關[5, 16-17]。深入研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞表面的PD-L1分子與活化T細胞中的PD-1分子相互作用，進而抑制T細胞的活化、增殖、遷移并誘導效應性T細胞的凋亡[5]。同時，研究還發(fā)現(xiàn)PD-1配基化所致的SHP1/2磷酸化不僅下調TCR信號，還可抑制STAT1并活化Foxp3，誘導CD4+T細胞向調節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Tregs)轉化[11]。Foxp3為Tregs重要的轉錄因子，PD-L1分子及信號對腫瘤患者Tregs的維持、誘導和擴增起著極為重要的作用[18]。由此可見，PD-1/PD-L1分子及信號是協(xié)助腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)視，繼續(xù)生長、浸潤及轉移的重要因素。

近來的研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中過表達的PD-L1分子還通過逆向信號調控Ki-67從而介導腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移以及腫瘤干細胞的維持[19]；Wang等[20]認為PD-L1分子及信號還參與了乳腺癌抗凋亡及耐藥機制。

2 NK細胞的生物學特性

2.1 NK細胞的簡介NK細胞起源于骨髓，因其胞質內含有較大顆粒，又被稱為大顆粒淋巴細胞，約占外周血淋巴細胞的15%。除了骨髓和外周血外，NK細胞還分布于淋巴結、脾臟、肺、肝臟及胎盤等免疫和非免疫組織[2]。NK細胞與T細胞和B細胞不同，其特征性表達CD16、CD56以及CD96分子，同時具有“身份識別”和殺傷能力。其表面還存在識別MHC分子并抑制其具有殺傷能力的抑制性受體，即能識別自身細胞而避免“誤殺”[3-4]。當細胞受病毒感染或細胞突變導致MHC分子下調或不表達，NK細胞表面抑制性受體的抑制能力減弱，活化性受體激活并通過分泌穿孔素和顆粒酶清除病毒感染細胞或突變的細胞；由此，NK細胞所介導的固有免疫應答在感染免疫和腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[3-4]。

2.2 NK細胞的類型與功能以NK細胞為代表的固有免疫應答的啟動是由其表面抑制性受體和活化性受體及其信號的相互協(xié)調與平衡所決定。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)NK 細胞表面受體有數(shù)十種，其主要來源于IgSF和C型凝集素超家族(C type lectin domain family, CLSF)[4]。這兩種超家族又各自包含抑制性受體和活化性受體，其中，IgSF中有可與MHCⅠ類分子相互作用的自然殺傷細胞抑制性受體(killer cell inhibitory receptor, KIR)；也有促進NK細胞活化啟動固有免疫應答的自然細胞毒性受體(natural cytotoxicity receptors, NCR)，如NKp46、NKp44和NKp30[3]。CLSF成員中CD94分子以二硫鍵與2型跨膜分子NKG家族中不同成員形成異源二聚體，既有起抑制作用的CD94-NKG2A，又有起活化作用的CD94-NKG2C；人白細胞抗原E(human leukocyte antigen E, HLA-E)則是這兩組受體的共同配體[21]。

KIR、CD94-NKG2A等抑制性受體胞內段均含有ITIM，而非抑制性受體則缺乏ITIM，但含有與信號轉導分子相互作用的賴氨酸。如CD94-NKG2A中CD94的凝集素樣結構域可識別HLA-E-MHC先導肽，通過和先導肽上的氨基酸殘基以及MHC分子α1和α2結構域發(fā)生作用，同時通過糖類的相互結合增強與HLA-E-MHC先導肽的相互作用，促使ITIM發(fā)生磷酸化并募集SHP-1/2，下調NK細胞的活性。一旦病毒感染或細胞惡變導致表面MHC I類分子表達下調或缺失時，NK細胞表面與之相結合的KIRs、CD94-NKG2A等抑制性受體的抑制作用減弱，同時DNAM-1、CD94-NKG2C和NCRs等活化性受體則與T細胞受體復合物ζ鏈相關分子DAP12結合，通過其含有的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)募集ZAP-70等酪氨酸激酶并促使其磷酸化，促進活化性受體激活，啟動對病毒和惡變細胞的清除[22]。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞不但存在復雜的受體及其信號調節(jié)網(wǎng)絡，還存在著不同亞型。Cooper等[23]根據(jù)特征性標志CD56分子表達程度的不同，將NK細胞分為CD56bright、CD56dim兩大亞群。其中CD56brightNK細胞殺傷力較弱，被認為是未成熟的NK細胞，CD56dim則標志著NK細胞分化成熟并具有較強的殺傷能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)NK細胞表面另一特征性標志CD16分子可特異性結合復合或單體IgG并介導抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity, ADCC)。因此，NK細胞又被分為兩類功能不同的CD56dimCD16+NK細胞和CD56brightCD16-NK細胞免疫調節(jié)亞群[3]。

隨著研究的深入，NK細胞表面不同抑制性受體和活化性受體與NK細胞的功能存在更為復雜的相互關系。僅依靠CD56分子和CD16分子劃分NK細胞的亞型不能闡述NK細胞在天然免疫應答中的作用機制。Chiesa等[24]研究發(fā)現(xiàn)CD56dimNK細胞在初次和再次感染巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV)的過程中表現(xiàn)出不同的免疫應答，類似適應性免疫反應。當再次感染CMV時，NK細胞可快速擴增、高表達活化性受體NKG2C等，并分泌表達高水平的穿孔素、顆粒酶及IFN-γ和TNF-α等細胞因子，即產(chǎn)生記憶性[25]。動物實驗結果亦證實小鼠再次感染CMV后體內其LY49+NK細胞亦表現(xiàn)為具有較強的記憶功能[26]。接下來的研究還發(fā)現(xiàn)一群分泌IL-10具有抑制NK細胞活性的NK細胞亞群[27]。Poznanski等[28]則根據(jù)CD56、CD16分子以及表面其他受體的表達程度并結合其不同的功能將NK細胞分為細胞毒性、調節(jié)性和記憶性NK細胞三類。其中CD56dimCD16+細胞毒性NK細胞高表達NCR、KIR等分子。CD56brightCD16-調節(jié)性NK細胞低表達NCR，但高表達KIR、NKG2A分子。記憶性NK細胞則高表達CD57、NKG2C等分子，低表達NKp30、NKp46分子，不表達NKG2A分子。這些NK細胞新亞群在免疫應答中的機制尚未完全明確，使得NK細胞在固有免疫以及適應性免疫中的作用機制更加復雜。

3 PD-1/PD-L1分子與NK細胞

3.1 PD-1/PD-L1分子對NK細胞的影響近年研究發(fā)現(xiàn)PD-1、CTLA-4、Tim3、TIGIT等免疫卡控點分子在NK細胞中也有表達[3,24]。Hsu等[29]和Kim等[30]的研究發(fā)現(xiàn)PD-1分子僅在成熟CD56dimNKG2A-KIR+CD57+NK細胞中表達，在CD56brightNK細胞中幾乎不表達。與PD-1-NK細胞相比，PD-1+NK細胞的增殖能力、細胞毒性、細胞因子分泌功能均降低，Rambaldi等[31]則認為PD-1/NKG2A途徑則還可誘導Tregs的擴增，進而影響適應性免疫應答。

3.2 PD-1/PD-L1分子與NK細胞的腫瘤免疫臨床研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、腎細胞癌、多種血液系統(tǒng)腫瘤以及消化系統(tǒng)腫瘤中NK細胞表面異常表達PD-1分子，且其含量往往與腫瘤患者的預后密切相關，即PD-1分子表達越高，其預后越差。PD-1阻斷劑可明顯恢復NK細胞的抗腫瘤功能[32-33]。Liu等[32]對多種消化道腫瘤進行研究發(fā)現(xiàn)，部分CD56+NK細胞表達PD-1分子，阻斷PD-1信號后，CD56+PD-1+NK細胞較CD56+PD-1-NK細胞中CD107a、NKG2D的表達水平明顯升高，NKG2A的表達則下降。Liu等的研究結果亦證實CD56dimCD16+NK細胞中PD-1分子表達水平明顯高于CD56brightCD16-NK細胞。Huang等[34]認為NK細胞表面PD-1分子與靶細胞表面PD-L1分子的配基化通過損傷整合素“由外向內”信號，抑制NK細胞分泌顆粒酶等細胞毒作用，降低NK細胞殺傷腫瘤的能力。Abeyweera等[35]認為PD-1分子胞內段ITIM是抑制NK細胞活化的主要機制。

前列腺癌、肺癌等研究進一步發(fā)現(xiàn)高表達的PD-L1分子通過抑制NK細胞表面NKG2D配體顯著影響NK細胞的殺傷能力[36-37]。動物實驗也發(fā)現(xiàn)，將NK細胞與PD-L1+腫瘤細胞共培養(yǎng)時，NK細胞的增殖和殺傷功能被明顯抑制。Hsu等[29]認為阻斷NK細胞表面PD-1、TIGIT等免疫卡控點分子是腫瘤免疫治療的關鍵。當免疫卡控點分子及其信號受到阻斷，NK細胞的抗腫瘤活性和增殖能力可得到恢復[29]，并有效啟動NK細胞的殺傷能力，引發(fā)ADCC，釋放TNF-α、IFN-γ等細胞因子；免疫卡控點分子及其信號的阻斷還可促進以CD8+T細胞為主抗腫瘤的適應性免疫應答，逆轉T細胞的耗竭[38]。

Dong等[39]在白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，相對PD-L1-NK細胞，PD-L1+NK細胞可有效殺傷髓系白血病細胞K562。體內動物實驗也證實PD-L1+NK細胞具有更強的殺傷腫瘤細胞能力。

PD-1/PD-L1分子在不同NK細胞亞群中的表達情況以及在實體腫瘤和造血系統(tǒng)來源腫瘤中調節(jié)免疫反應是否存在不同的分子機制還有待深入分析。

4 結語

隨著研究的深入和科技的發(fā)展，腫瘤免疫治療已取得了顯著進展，尤其是針對免疫卡控點PD-1/PD-L1分子的治療延長了肺癌、黑色素瘤等晚期患者生存時間。部分患者在免疫治療中存在的低反應性又促使針對PD-1/PD-L1等分子在免疫應答中的作用機制被深入探究。腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉移及復發(fā)是多基因參與、多步驟發(fā)展的復雜過程，是機體內在因素、病毒感染等外界因素聯(lián)合作用逐漸形成，是機體免疫系統(tǒng)與腫瘤之間清除、平衡和逃逸的博弈。研究免疫卡控點分子PD-1/PD-L1在NK細胞活化、殺傷腫瘤細胞效應中的作用，探討其對NK細胞為代表的固有免疫應答和適應性免疫應答之間的調控與相關信號通路，以期確定這些重要免疫卡控點的表達規(guī)律，從而制定更為精準和合理的聯(lián)合免疫治療方案，為惡性腫瘤精準免疫治療提供新的靶點以及理論基礎。