顧麗琴，濮陽(yáng)隆翔，謝 芳

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)不僅與患者遺傳易感性相關(guān)，還與機(jī)體的免疫狀態(tài)和腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞表面低表達(dá)或不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)分子使T細(xì)胞缺乏活化必需的第一信號(hào)，以致難以介導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答[1]。以自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)為代表的固有免疫應(yīng)答主要針對(duì)MHC分子下調(diào)或缺失的惡變細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞[2]；因此，NK細(xì)胞及其固有免疫應(yīng)答在抗腫瘤免疫中的作用不可或缺[3-4]。

2012年，Topalian等[5]和Brahmer等[6]共同報(bào)道了抗PD-L1、PD-1單抗治療腫瘤的臨床研究成果，使針對(duì)免疫卡控點(diǎn)的免疫治療成為腫瘤治療的新熱點(diǎn)。但僅部分腫瘤晚期患者在抗PD-L1或PD-1抗體治療后腫瘤出現(xiàn)部分或完全消退[7]，這提示針對(duì)PD-1/PD-L1分子及信號(hào)的腫瘤免疫治療可能還存在其他機(jī)制。作為腫瘤免疫治療的“明星分子”P(pán)D-1/PD-L1分子在NK細(xì)胞及其抗腫瘤免疫中的作用尚不明確。因此，該文現(xiàn)就PD-1/PD-L1分子和NK細(xì)胞的生物學(xué)特征、PD-1/PD-L1分子在NK細(xì)胞中的表達(dá)以及對(duì)NK細(xì)胞抗腫瘤免疫的影響作一綜述，探討PD-1/PD-L1分子在調(diào)控NK細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答中的重要作用，為腫瘤免疫治療提供新思路。

1 PD-1/PD-L1分子的生物學(xué)特性

1.1 PD-1/PD-L1分子的發(fā)現(xiàn)PD-L1分子又稱(chēng)B7H1、CD274，屬于B7家族成員，其全長(zhǎng)為290個(gè)氨基酸，包含1個(gè)IgV樣區(qū)、1個(gè)IgC樣區(qū)、1個(gè)跨膜疏水區(qū)和1個(gè)由30個(gè)氨基酸組成的胞內(nèi)區(qū)[8]。PD-L1分子廣泛表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)、T細(xì)胞、NK細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞等免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞[8]，黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、腎細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)中也可見(jiàn)表達(dá)[9-10]。其受體PD-1分子為相對(duì)分子質(zhì)量為(5.0～5.5)×104的Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)成員[11]。其分子結(jié)構(gòu)包括胞外IgV段、跨膜段和胞內(nèi)段；胞內(nèi)段則包含一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)化基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM)。PD-1分子主要表達(dá)于活化T細(xì)胞，為活化T細(xì)胞的標(biāo)志之一[11]。隨著研究的深入，T、B、NK細(xì)胞以及腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)中均發(fā)現(xiàn)PD-1分子的表達(dá)[11]。

1.2 PD-1/PD-L1分子的作用PD-1/PD-L1分子是免疫系統(tǒng)中抑制免疫反應(yīng)、調(diào)控免疫耐受及維持免疫平衡的一對(duì)重要負(fù)性共刺激分子，與CTLA-4、B7-H3、B7-H4等并稱(chēng)為免疫卡控點(diǎn)分子，能從多個(gè)環(huán)節(jié)和信號(hào)通路向T細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)[11-12]。

當(dāng)活化T細(xì)胞表面的PD-1分子與APC表面PD-L1分子結(jié)合后，可通過(guò)抑制PI3K/Akt通路進(jìn)而抑制抗凋亡基因BCL-XL的表達(dá)來(lái)促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡，上調(diào)p27kip1抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖[13]。PD-1/PD-L1信號(hào)還可通過(guò)抑制蛋白激酶Cδ的磷酸化導(dǎo)致T細(xì)胞活化增殖所必需的IL-2分泌下降，使效應(yīng)性T細(xì)胞增殖受抑并滯留在G1期[11,13]。研究還發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1信號(hào)可通過(guò)募集Src同源區(qū)蛋白酪氨酸(src homology 2-containing protein-tyrosine phosphatase 1/2, SHP1/2)的磷酸化[11]，抑制酪氨酸激酶ZAP70的磷酸化，并下調(diào)T細(xì)胞活化必需的第一信號(hào)，介導(dǎo)T細(xì)胞的死亡[11]。SHP1/2的磷酸化還可抑制轉(zhuǎn)錄因子BCL-6的表達(dá)，阻止CD4+T細(xì)胞分化為濾泡性輔助性T細(xì)胞[11]。

正常生理?xiàng)l件下，PD-1/PD-L1信號(hào)通路的激活可啟動(dòng)多條抑制信號(hào)及通路發(fā)揮抑制T細(xì)胞活化、生存、增殖、遷移并誘導(dǎo)效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡[11,13]，以維持免疫平衡，避免自身免疫性疾病的發(fā)生。免疫性腦脊髓膜炎、免疫性糖尿病的動(dòng)物模型也證實(shí)PD-1/PD-L1信號(hào)通路的缺失會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[14]。在感染性免疫以及移植免疫中，PD-1/PD-L1信號(hào)通路的激活可有效調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，避免T細(xì)胞對(duì)組織的持續(xù)性損傷[15]。

1.3 PD-1/PD-L1分子與腫瘤繼黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌之后，胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、腎透明細(xì)胞癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、子宮頸癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等眾多腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)存在PD-L1分子的過(guò)表達(dá)，且其與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[5, 16-17]。深入研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1分子與活化T細(xì)胞中的PD-1分子相互作用，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的活化、增殖、遷移并誘導(dǎo)效應(yīng)性T細(xì)胞的凋亡[5]。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)PD-1配基化所致的SHP1/2磷酸化不僅下調(diào)TCR信號(hào)，還可抑制STAT1并活化Foxp3，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)轉(zhuǎn)化[11]。Foxp3為T(mén)regs重要的轉(zhuǎn)錄因子，PD-L1分子及信號(hào)對(duì)腫瘤患者Tregs的維持、誘導(dǎo)和擴(kuò)增起著極為重要的作用[18]。由此可見(jiàn)，PD-1/PD-L1分子及信號(hào)是協(xié)助腫瘤細(xì)胞逃逸免疫監(jiān)視，繼續(xù)生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的重要因素。

近來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中過(guò)表達(dá)的PD-L1分子還通過(guò)逆向信號(hào)調(diào)控Ki-67從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤干細(xì)胞的維持[19]；Wang等[20]認(rèn)為PD-L1分子及信號(hào)還參與了乳腺癌抗凋亡及耐藥機(jī)制。

2 NK細(xì)胞的生物學(xué)特性

2.1 NK細(xì)胞的簡(jiǎn)介NK細(xì)胞起源于骨髓，因其胞質(zhì)內(nèi)含有較大顆粒，又被稱(chēng)為大顆粒淋巴細(xì)胞，約占外周血淋巴細(xì)胞的15%。除了骨髓和外周血外，NK細(xì)胞還分布于淋巴結(jié)、脾臟、肺、肝臟及胎盤(pán)等免疫和非免疫組織[2]。NK細(xì)胞與T細(xì)胞和B細(xì)胞不同，其特征性表達(dá)CD16、CD56以及CD96分子，同時(shí)具有“身份識(shí)別”和殺傷能力。其表面還存在識(shí)別MHC分子并抑制其具有殺傷能力的抑制性受體，即能識(shí)別自身細(xì)胞而避免“誤殺”[3-4]。當(dāng)細(xì)胞受病毒感染或細(xì)胞突變導(dǎo)致MHC分子下調(diào)或不表達(dá)，NK細(xì)胞表面抑制性受體的抑制能力減弱，活化性受體激活并通過(guò)分泌穿孔素和顆粒酶清除病毒感染細(xì)胞或突變的細(xì)胞；由此，NK細(xì)胞所介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答在感染免疫和腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用[3-4]。

2.2 NK細(xì)胞的類(lèi)型與功能以NK細(xì)胞為代表的固有免疫應(yīng)答的啟動(dòng)是由其表面抑制性受體和活化性受體及其信號(hào)的相互協(xié)調(diào)與平衡所決定。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)NK 細(xì)胞表面受體有數(shù)十種，其主要來(lái)源于IgSF和C型凝集素超家族(C type lectin domain family, CLSF)[4]。這兩種超家族又各自包含抑制性受體和活化性受體，其中，IgSF中有可與MHCⅠ類(lèi)分子相互作用的自然殺傷細(xì)胞抑制性受體(killer cell inhibitory receptor, KIR)；也有促進(jìn)NK細(xì)胞活化啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答的自然細(xì)胞毒性受體(natural cytotoxicity receptors, NCR)，如NKp46、NKp44和NKp30[3]。CLSF成員中CD94分子以二硫鍵與2型跨膜分子NKG家族中不同成員形成異源二聚體，既有起抑制作用的CD94-NKG2A，又有起活化作用的CD94-NKG2C；人白細(xì)胞抗原E(human leukocyte antigen E, HLA-E)則是這兩組受體的共同配體[21]。

KIR、CD94-NKG2A等抑制性受體胞內(nèi)段均含有ITIM，而非抑制性受體則缺乏ITIM，但含有與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互作用的賴氨酸。如CD94-NKG2A中CD94的凝集素樣結(jié)構(gòu)域可識(shí)別HLA-E-MHC先導(dǎo)肽，通過(guò)和先導(dǎo)肽上的氨基酸殘基以及MHC分子α1和α2結(jié)構(gòu)域發(fā)生作用，同時(shí)通過(guò)糖類(lèi)的相互結(jié)合增強(qiáng)與HLA-E-MHC先導(dǎo)肽的相互作用，促使ITIM發(fā)生磷酸化并募集SHP-1/2，下調(diào)NK細(xì)胞的活性。一旦病毒感染或細(xì)胞惡變導(dǎo)致表面MHC I類(lèi)分子表達(dá)下調(diào)或缺失時(shí)，NK細(xì)胞表面與之相結(jié)合的KIRs、CD94-NKG2A等抑制性受體的抑制作用減弱，同時(shí)DNAM-1、CD94-NKG2C和NCRs等活化性受體則與T細(xì)胞受體復(fù)合物ζ鏈相關(guān)分子DAP12結(jié)合，通過(guò)其含有的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)募集ZAP-70等酪氨酸激酶并促使其磷酸化，促進(jìn)活化性受體激活，啟動(dòng)對(duì)病毒和惡變細(xì)胞的清除[22]。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞不但存在復(fù)雜的受體及其信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，還存在著不同亞型。Cooper等[23]根據(jù)特征性標(biāo)志CD56分子表達(dá)程度的不同，將NK細(xì)胞分為CD56bright、CD56dim兩大亞群。其中CD56brightNK細(xì)胞殺傷力較弱，被認(rèn)為是未成熟的NK細(xì)胞，CD56dim則標(biāo)志著NK細(xì)胞分化成熟并具有較強(qiáng)的殺傷能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞表面另一特征性標(biāo)志CD16分子可特異性結(jié)合復(fù)合或單體IgG并介導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity, ADCC)。因此，NK細(xì)胞又被分為兩類(lèi)功能不同的CD56dimCD16+NK細(xì)胞和CD56brightCD16-NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)亞群[3]。

隨著研究的深入，NK細(xì)胞表面不同抑制性受體和活化性受體與NK細(xì)胞的功能存在更為復(fù)雜的相互關(guān)系。僅依靠CD56分子和CD16分子劃分NK細(xì)胞的亞型不能闡述NK細(xì)胞在天然免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制。Chiesa等[24]研究發(fā)現(xiàn)CD56dimNK細(xì)胞在初次和再次感染巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus, CMV)的過(guò)程中表現(xiàn)出不同的免疫應(yīng)答，類(lèi)似適應(yīng)性免疫反應(yīng)。當(dāng)再次感染CMV時(shí)，NK細(xì)胞可快速擴(kuò)增、高表達(dá)活化性受體NKG2C等，并分泌表達(dá)高水平的穿孔素、顆粒酶及IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子，即產(chǎn)生記憶性[25]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)小鼠再次感染CMV后體內(nèi)其LY49+NK細(xì)胞亦表現(xiàn)為具有較強(qiáng)的記憶功能[26]。接下來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)一群分泌IL-10具有抑制NK細(xì)胞活性的NK細(xì)胞亞群[27]。Poznanski等[28]則根據(jù)CD56、CD16分子以及表面其他受體的表達(dá)程度并結(jié)合其不同的功能將NK細(xì)胞分為細(xì)胞毒性、調(diào)節(jié)性和記憶性NK細(xì)胞三類(lèi)。其中CD56dimCD16+細(xì)胞毒性NK細(xì)胞高表達(dá)NCR、KIR等分子。CD56brightCD16-調(diào)節(jié)性NK細(xì)胞低表達(dá)NCR，但高表達(dá)KIR、NKG2A分子。記憶性NK細(xì)胞則高表達(dá)CD57、NKG2C等分子，低表達(dá)NKp30、NKp46分子，不表達(dá)NKG2A分子。這些NK細(xì)胞新亞群在免疫應(yīng)答中的機(jī)制尚未完全明確，使得NK細(xì)胞在固有免疫以及適應(yīng)性免疫中的作用機(jī)制更加復(fù)雜。

3 PD-1/PD-L1分子與NK細(xì)胞

3.1 PD-1/PD-L1分子對(duì)NK細(xì)胞的影響近年研究發(fā)現(xiàn)PD-1、CTLA-4、Tim3、TIGIT等免疫卡控點(diǎn)分子在NK細(xì)胞中也有表達(dá)[3,24]。Hsu等[29]和Kim等[30]的研究發(fā)現(xiàn)PD-1分子僅在成熟CD56dimNKG2A-KIR+CD57+NK細(xì)胞中表達(dá)，在CD56brightNK細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。與PD-1-NK細(xì)胞相比，PD-1+NK細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子分泌功能均降低，Rambaldi等[31]則認(rèn)為PD-1/NKG2A途徑則還可誘導(dǎo)Tregs的擴(kuò)增，進(jìn)而影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

3.2 PD-1/PD-L1分子與NK細(xì)胞的腫瘤免疫臨床研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、腎細(xì)胞癌、多種血液系統(tǒng)腫瘤以及消化系統(tǒng)腫瘤中NK細(xì)胞表面異常表達(dá)PD-1分子，且其含量往往與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，即PD-1分子表達(dá)越高，其預(yù)后越差。PD-1阻斷劑可明顯恢復(fù)NK細(xì)胞的抗腫瘤功能[32-33]。Liu等[32]對(duì)多種消化道腫瘤進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，部分CD56+NK細(xì)胞表達(dá)PD-1分子，阻斷PD-1信號(hào)后，CD56+PD-1+NK細(xì)胞較CD56+PD-1-NK細(xì)胞中CD107a、NKG2D的表達(dá)水平明顯升高，NKG2A的表達(dá)則下降。Liu等的研究結(jié)果亦證實(shí)CD56dimCD16+NK細(xì)胞中PD-1分子表達(dá)水平明顯高于CD56brightCD16-NK細(xì)胞。Huang等[34]認(rèn)為NK細(xì)胞表面PD-1分子與靶細(xì)胞表面PD-L1分子的配基化通過(guò)損傷整合素“由外向內(nèi)”信號(hào)，抑制NK細(xì)胞分泌顆粒酶等細(xì)胞毒作用，降低NK細(xì)胞殺傷腫瘤的能力。Abeyweera等[35]認(rèn)為PD-1分子胞內(nèi)段ITIM是抑制NK細(xì)胞活化的主要機(jī)制。

前列腺癌、肺癌等研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的PD-L1分子通過(guò)抑制NK細(xì)胞表面NKG2D配體顯著影響NK細(xì)胞的殺傷能力[36-37]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，將NK細(xì)胞與PD-L1+腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，NK細(xì)胞的增殖和殺傷功能被明顯抑制。Hsu等[29]認(rèn)為阻斷NK細(xì)胞表面PD-1、TIGIT等免疫卡控點(diǎn)分子是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵。當(dāng)免疫卡控點(diǎn)分子及其信號(hào)受到阻斷，NK細(xì)胞的抗腫瘤活性和增殖能力可得到恢復(fù)[29]，并有效啟動(dòng)NK細(xì)胞的殺傷能力，引發(fā)ADCC，釋放TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子；免疫卡控點(diǎn)分子及其信號(hào)的阻斷還可促進(jìn)以CD8+T細(xì)胞為主抗腫瘤的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞的耗竭[38]。

Dong等[39]在白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)PD-L1-NK細(xì)胞，PD-L1+NK細(xì)胞可有效殺傷髓系白血病細(xì)胞K562。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PD-L1+NK細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞能力。

PD-1/PD-L1分子在不同NK細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況以及在實(shí)體腫瘤和造血系統(tǒng)來(lái)源腫瘤中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)是否存在不同的分子機(jī)制還有待深入分析。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著研究的深入和科技的發(fā)展，腫瘤免疫治療已取得了顯著進(jìn)展，尤其是針對(duì)免疫卡控點(diǎn)PD-1/PD-L1分子的治療延長(zhǎng)了肺癌、黑色素瘤等晚期患者生存時(shí)間。部分患者在免疫治療中存在的低反應(yīng)性又促使針對(duì)PD-1/PD-L1等分子在免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制被深入探究。腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是多基因參與、多步驟發(fā)展的復(fù)雜過(guò)程，是機(jī)體內(nèi)在因素、病毒感染等外界因素聯(lián)合作用逐漸形成，是機(jī)體免疫系統(tǒng)與腫瘤之間清除、平衡和逃逸的博弈。研究免疫卡控點(diǎn)分子PD-1/PD-L1在NK細(xì)胞活化、殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng)中的作用，探討其對(duì)NK細(xì)胞為代表的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答之間的調(diào)控與相關(guān)信號(hào)通路，以期確定這些重要免疫卡控點(diǎn)的表達(dá)規(guī)律，從而制定更為精準(zhǔn)和合理的聯(lián)合免疫治療方案，為惡性腫瘤精準(zhǔn)免疫治療提供新的靶點(diǎn)以及理論基礎(chǔ)。