宋德順，程華

作者單位：青島市第八人民醫(yī)院內(nèi)鏡診療科，山東 青島 266100

結(jié)腸癌發(fā)病率、死亡率分別在全球癌癥排名中位列第三和第四位［1］。由于生活方式、飲食習(xí)慣、生活條件的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率、死亡率呈逐年上升趨勢。早期結(jié)腸癌缺乏特征性癥狀，不易發(fā)現(xiàn)，且手術(shù)治療效果不佳和化療耐藥，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題［2］。因此，探討結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制、尋找新的治療策略迫在眉睫，對提高結(jié)腸癌的診斷、治療和預(yù)后意義重大。環(huán)狀RNA（circRNA，circular RNA）由單個具有基因調(diào)控潛能的mRNA 前體反向剪接而成。越來越多的證據(jù)表明，circRNA 與人類疾病尤其是癌癥關(guān)系密切，由于其性質(zhì)穩(wěn)定，circRNA 具有潛在生物標志物作用［3-4］。研究顯示，circRNA 肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MYLK）在前列腺癌中顯著上調(diào)并促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，提示肌球蛋白輕鏈激酶（circMYLK）可能是一種致癌基因［5］。序列分析發(fā)現(xiàn)，微小RNA-497-5p（miR-497-5p）與circMYLK 存在理論互補結(jié)合位點。miR-497-5p 已被證實在結(jié)腸癌中表達下調(diào)，上調(diào)miR-497-5p 表達抑制結(jié)腸癌進展［6］。然而，circ?MYLK能否靶向miR-497-5p參與結(jié)腸癌進展尚未可知。因此，于2019 年3 月至2020 年1 月本研究旨在通過體外細胞實驗揭示circMYLK 在結(jié)腸癌中的作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料結(jié)腸癌細胞SW480、SW620、Caco-2以及正常結(jié)腸上皮細胞NCM460購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基購于美國Gibco 公司；胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液購于北京索萊寶生物科技公司；Taqman miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol 試劑購于美國Invitrogen 公司；Prime?Script RT reagent Kit、SYBR Green Master Mix 購于大連TaKaRa 生物公司；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）、放射免疫沉淀試驗（RIPA）緩沖液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白分析試劑盒、購于南京凱基生物公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購于美國BD 公司；兔源細胞周期蛋白D1（cyclinD1）單克隆抗體、兔源P21 單克隆抗體、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）單克隆抗體、兔源MMP-9 單克隆抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶（GAP?DH）單克隆抗體、山羊抗兔IgG 購于上海艾博抗公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) SW480、SW620、Caco-2 細胞均采用RPMI-1640 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，NCM460 細胞采用DMEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)所有培養(yǎng)基中均補充10%的胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和100 μg/mL 的鏈霉素。當細胞生長至匯合度80%時，按照1∶4 比例進行消化傳代。

1.2.2實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測circ?MYLK 和miR-497-5p 表達 采用TRIzol 試劑分別提 取NCM460、SW480、SW620、Caco-2 細 胞 中 總RNA。用Taqman miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA轉(zhuǎn)化為cDNA。用3 U/mg RNase R 于37 ℃條件下孵育總RNA 15 min，利用PrimeScript RT reagent Kit 將mRNA 轉(zhuǎn)化為cDNA。以cDNA 為擴增模板，利用SYBR Green Master Mix 進行RT-qPCR 擴增。以GAPDH、U6為內(nèi)參照基因，2-ΔΔCt法分析circMYLK和miR-497-5p 的相對表達水平。circMYLK 正向引物序列5’-CAATCTTCTTATGCGGCGG-3’，反向引物序 列5’-GTACCGGCGCAGTCAGG-3’；miR-497-5p正向引物序列5’-AGCGAAGTTTTGAGCCGATC?GGGC-3’，反向引物序列5’-GCCGTGAGTCAGAG?GTGGT-3’；GAPDH 正 向 引 物 序 列5’-ATCCAC?GGGAGAGCGACAT-3’，反向引物序列5’-CAGCT?GCTTGTAAAGTGGAC-3’；U6 正 向 引 物 序 列5’-ACAGATCTGTCGGTGTGGCAC-3’，反向引物序列5’-GGCCCCGGATTATCCGACATTC-3’。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染、細胞分組 按照2×105個/孔的密度將對數(shù)期SW480 細胞接種6 孔板，當細胞50%匯合時更換不含血清培養(yǎng)基進行細胞轉(zhuǎn)染。首先，取50 pmol 的待轉(zhuǎn)染物陰性對照（si-NC）、干擾circ?MYLK（si-circMYLK）、過表達對照（miR-NC）、miR-497-5p 模 擬 物（miR-497-5p mimics）、干 擾circ?MYLK+抑制物對照（si-circMYLK+anti-miR-NC）、干擾circMYLK+ miR-497-5p 抑制物（si-circMYLK+an?ti-miR-497-5p）與適量無血清培養(yǎng)基混合，使其總體積 為25 μL，記 為 混 合 物A。取1 μL 的Lipo?fectamine 3000 與24μL 無血清培養(yǎng)基混合，記為混合物B。室溫靜置5 min 后，將混合物A 和緩和物B混合均勻，記為混合物C。將混合物C 加入到細胞匯合度為50%的培養(yǎng)基中，6 h 后更換為含血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h 時收集細胞，RT-qPCR 測定轉(zhuǎn)染效果，合格后進行后續(xù)實驗。

1.2.4CCK-8法檢測細胞活力 按照5×103個/孔的密度將各轉(zhuǎn)染組細胞接種96 孔板，在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 時各取出一板細胞，按照10μL/孔加入CCK-8 試劑，暗室孵育1 h 后，采用酶標儀測定細胞在450 nm 處的光密度（optical density，OD）值以反映細胞的增殖活性。

1.2.5Transwell 實驗檢測細胞遷移和侵襲能力遷移實驗時取200 μL 無血清培養(yǎng)液稀釋的各組細胞懸液（2×105個/毫升）加入到Transwell 上腔室，取600μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入到24 孔下室作為趨化劑。37 ℃孵育24 h 后，用棉簽擦去上室未遷移細胞，用1%多聚甲醛固定至下室膜，0.5%結(jié)晶紫染色，然后在光學(xué)顯微鏡下隨機選擇五個視野計數(shù)和拍照，以其均數(shù)表示細胞遷移細胞數(shù)。侵襲實驗時采用涂有基質(zhì)膠的Transwell 小室，其余步驟同遷移實驗。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測Cy?clinD1、P21、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平 采用放射免疫沉淀試驗緩沖液提取總蛋白，BCA 蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%牛血清白蛋白室溫封閉膜1 h后，將膜至于稀釋的一抗溶液中4 ℃孵育過夜，再用稀釋的二抗室溫孵育膜1 h。用電化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒進行顯影、曝光。以GAPDH 為內(nèi)參，用Bio-Rad Quantity One 軟件分析對單個蛋白條帶進行灰度分析。

1.2.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?Starbase 數(shù)據(jù)庫在線分析顯示circMYLK 與miR-497-5p 存在連續(xù)互補結(jié)合位點。將含有miR-497-5p 預(yù)測結(jié)合位點或預(yù)測結(jié)合位點突變序列的circMYLK 克隆到pGL3-REPORT 雙熒光素酶載體中，獲得熒光素酶報告基因載體WT-circMYLK 和MUT-circMYLK。以Lipo?fectamine 3000 作為轉(zhuǎn)染試劑，將WT-circMYLK 和MUT-circMYLK 分別與miR-497-5p mimics 或miRNC 轉(zhuǎn)染到SW480 細胞中。培養(yǎng)48 h 后收集細胞，使用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)測定熒光素酶活性。為確定circMYLK 對miR-497-5p 表達的調(diào)控作用，將pcDNA、pcDNA-circMYLK、si-NC、si-circMYLK 分別轉(zhuǎn)染SW480 細胞，轉(zhuǎn)染48 h 時，檢測各組細胞miR-497-5p的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計分析。每組設(shè)置3 個平行實驗，重復(fù)3 次。計量資料滿足正態(tài)性和方差齊性用±s形式表示。采用t檢驗比較兩組間差異；采用單因素方差分析比較多組間差異，進一步多重比較采用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circMYLK 和miR-497-5p 在結(jié)腸癌細胞中的表達結(jié)腸癌細胞SW480、SW620、Caco-2 中circ?MYLK 表達較正常結(jié)腸上皮細胞NCM460 顯著升高（P<0.05），miR-497-5p 表達較NCM460 細胞顯著降低（P<0.05）。見表1。選擇SW480 細胞進行后續(xù)研究。

表1 circMYLK和miR-497-5p在結(jié)直腸癌細胞中的表達/±s

表1 circMYLK和miR-497-5p在結(jié)直腸癌細胞中的表達/±s

注：circMYLK 為肌球蛋白輕鏈激酶，miR-497-5p 為微小RNA-497-5p。①與NCM460細胞比較，P<0.05。

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2.2 干擾circMYLK 表達對SW480 細胞增殖、遷移和侵襲的影響si-circMYLK 組SW480 細胞circ?MYLK 的表達水平較si-NC 組顯著降低（t=18.44，P<0.05），表明轉(zhuǎn)染si-circMYLK 后SW480 細胞中circ?MYLK 表達受到抑制。干擾circMYLK 表達后SW480 細胞OD450值、遷移和侵襲細胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋 白 表 達 顯 著 降 低（t=18.97，13.76，15.02，17.73，21.73，31.62，P<0.05），P21 蛋白表達顯著升高（t=24.15，P<0.05）。見表2。

表2 干擾circMYLK表達對SW480細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

表2 干擾circMYLK表達對SW480細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

注：circMYLK 為肌球蛋白輕鏈激酶，CyclinD1 為細胞周期蛋白D1，P21 為周期素依賴激酶抑制劑，MMP-2 為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，MMP-9 為基質(zhì)金屬蛋白酶-9。

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2.3 miR-497-5p 過表達對SW480 細胞增殖、遷移和侵襲的影響miR-497-5p 組SW480 細胞中miR-497-5p表達水平較miR-NC組顯著升高（P<0.05），說明轉(zhuǎn)染miR-497-5p mimics 后SW480 細胞中miR-497-5p 表達得到上調(diào)。過表達miR-497-5p 后SW480 細胞OD450值、遷移和侵襲細胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達顯著降低（t=17.54，8.78，13.17，18.34，17.49，18.60，P<0.05），P21 蛋白表達顯著升高（t=22.14，P<0.05）。見圖1，表3。

表3 miR-497-5p過表達對SW480細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

表3 miR-497-5p過表達對SW480細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

注：miR-497-5p為微小RNA-497-5p，CyclinD1為細胞周期蛋白D1，P21為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9。

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圖1 miR-497-5p過表達對SW480細胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響

2.4 circMYLK 靶向調(diào)控miR-497-5p 的表達StarBase 數(shù)據(jù)庫在線分析顯示，circMYLK 與miR-497-5p 存在理論互補結(jié)合位點，見圖2。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-497-5p mimics 和WT-circ?MYLK共轉(zhuǎn)染組SW480細胞的相對熒光素酶活性較miR-NC 和WT-circMYLK 共轉(zhuǎn)染組顯著降低（t=26.71，P<0.05）；而miR-497-5p mimics 和MUT-circ?MYLK共轉(zhuǎn)染組SW480細胞的相對熒光素酶活性與miR-NC 和MUT-circMYLK 共轉(zhuǎn)染組比較無變化（t=0.98，P>0.05），見表4。pcDNA-circMYLK 組SW480 細 胞miR-497-5p表達0.54±0.05 較pcDNA 組1.00±0.05 顯著降低（t=19.52，P<0.05）；si-circMYLK 組SW480 細 胞miR-497-5p 表達3.07±0.22 較si-NC 組0.98±0.09 顯著升高（t=26.38，P<0.05）；四組總體SW480 細胞miR-497-5p表達比較F=754.12，P<0.001。

表4 雙熒光素酶報告實驗/±s

表4 雙熒光素酶報告實驗/±s

注：miR-NC為過表達對照，miR-497-5p為微小RNA-497-5p。

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圖2 circMYLK的序列中含有與miR-497-5p互補的核苷酸序列

2.5 抑制miR-497-5p 表達逆轉(zhuǎn)了干擾circMYLK表達對SW480 細胞增殖、遷移和侵襲的作用sicircMYLK+anti-miR-497-5p 組SW480 細 胞miR-497-5p 的表達較si-circMYLK+ anti-miR-NC 組顯著降低（t=9.99，P<0.05），細胞OD450值、遷移和侵襲細胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2 和MMP-9 蛋 白 表 達 較si-circ?MYLK+anti-miR-NC 組 顯 著 升 高（t=15.38，16.02，14.32，18.01，20.80，23.30，P<0.05），P21 蛋白表達較si-circMYLK+anti-miR-NC 組顯著降低（t=9.01，P<0.05）。見圖3，表5。

表5 抑制miR-497-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾circMYLK表達對SW480細胞增殖、遷移和侵襲的作用/±s

表5 抑制miR-497-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾circMYLK表達對SW480細胞增殖、遷移和侵襲的作用/±s

注：si-circMYLK+anti-miR-NC 為干擾circMYLK+抑制物對照，si-circMYLK+anti-miR-497-5p 為干擾circMYLK+抑制物miR-497-5p。Cy?clinD1為細胞周期蛋白D1，P21為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶-9。

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圖3 抑制miR-497-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾circMYLK表達對SW480細胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達的作用

3 討論

circRNA 是一種內(nèi)源性RNA，主要在真核轉(zhuǎn)錄組中表達，參與調(diào)控基因表達，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［7］。本研究通過探討circMYLK 在結(jié)腸癌中調(diào)節(jié)機制，以期為未來腫瘤的預(yù)防和治療提供新思路。

circMYLK 是調(diào)節(jié)肌球蛋白功能的重要分子，對細胞骨架、細胞增殖和肌肉收縮均有影響。近年研究發(fā)現(xiàn)，circMYLK 在多種腫瘤進展中發(fā)揮致癌因子作用。例如，circMYLK 在腎細胞癌中表達上調(diào)，cir?cMYLK 高表達與腫瘤體積增加、遠端轉(zhuǎn)移和較差的預(yù)后相關(guān)，沉默circMYLK能夠抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［8］。circMYLK 在喉鱗癌中亦呈表達增加，circ?MYLK 高表達促進喉鱗癌細胞增殖和G1/S 細胞周期過渡，而敲除circMYLK 則有相反的效果［9］。此外，敲除circMYLK對肝細胞進展也具有顯著的抑制作用［10］。與前任研究類似，本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞中circMYLK 表達較正常結(jié)腸上皮細胞NCM460 顯著升高，提示circMYLK高表達可能與結(jié)腸癌細胞的異常生物學(xué)行為有關(guān)。采用結(jié)腸癌細胞SW480 進行功能分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染si-circMYLK 干擾circMYLK可顯著降低SW480 細胞活力、遷移和侵襲能力。P21 是細胞增殖的負性調(diào)控因子，其通過抑制細胞周期依賴性激酶活性具有阻止G1/S 期轉(zhuǎn)換作用，而CyclinD1 則參與G1/S 期轉(zhuǎn)換進而發(fā)揮胞增殖正性調(diào)控作用［11］。MMP-2 和MMP-9 是一類依賴鋅的蛋白酶，其通過降解細胞外基質(zhì)和基底膜膠原蛋白在促進腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾circMYLK可降低CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達水平，提高P21 表達，與功能分析相吻合，這進一步說明circMYLK 在結(jié)腸癌中的致癌作用，干擾circ?MYLK可有效抑制SW480細胞的惡性生物學(xué)行為。

目前，多項研究研究證實circRNA 通過與miR?NA 相互作用，使miRNA 失去自身功能，調(diào)控下游靶基因，從而影響腫瘤的生物學(xué)行為［13-14］。例如cir?cRNA_103809 通過抑制miR-532-3p 表達減輕miR-532-3p 對 叉 頭 樣 轉(zhuǎn) 錄 因 子O4（Forkhead Box O4，F(xiàn)OXO4）的抑制作用進而影響結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和凋亡［15］。為探索circMYLK在結(jié)腸中的作用機制，本研究通過序列分析發(fā)現(xiàn)miR-497-5p 可能含有circMYLK 的結(jié)合位點。miR-497-5p 屬于miR-15/107 簇，已有報道顯示肝細胞癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌中miR-497-5p 表達下調(diào)，過表達miR-497-5p 可降低腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力［16-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細胞中miR-497-5p 表達降低，過表達miR-497-5p 可降低SW480 細胞活力，抑制其遷移和侵襲能力，表明miR-497-5p 在結(jié)腸癌中具有抑癌作用，與Gharib E 等［19］研究結(jié)論相一致。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-497-5p 可降低SW480 細胞中circMYLK-WT 的相對熒光素酶活性，且circ?MYLK 對miR-497-5p 具有負調(diào)控作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-497-5p 表達還可逆轉(zhuǎn)干擾circ?MYLK 對SW480 細胞活力、遷移侵襲和相關(guān)蛋白表達的影響，恢復(fù)細胞的增殖、遷移和侵襲能力，這進一步說明circMYLK 在結(jié)腸癌中的致癌作用與負調(diào)控miR-497-5p表達有關(guān)。

綜上所述，結(jié)腸癌細胞中circMYLK 呈高表達，干擾circMYLK 通過靶向miR-497-5p 能夠抑制結(jié)腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。因此，circMYLK/miR-497-5p 分子軸是結(jié)腸癌的潛在治療靶點，為未來結(jié)腸癌的防治提供了新的方向。