曹暢達(dá)， 方一銘， 黃 興， 陶宏兵， 鄧小鋒， 謝小保， 趙國(guó)邦*

1.廣東省科學(xué)院微生物研究所華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070；

2.廣東迪美新材料科技有限公司，廣東肇慶526238；3.南順香港集團(tuán)，香港 999077

麥麩（小麥麩皮）是小麥加工制成面粉過(guò)程中的主要副產(chǎn)品，約占小麥種子質(zhì)量的22%［1］。麥麩除了含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素等營(yíng)養(yǎng)物，其中還存在多糖、酚酸等具有獨(dú)特生理活性的物質(zhì)［2］。作為產(chǎn)糧大國(guó)，我國(guó)的小麥年產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)了1.1億噸，每年產(chǎn)生超過(guò)2000萬(wàn)噸的麥麩。然而由于粗纖維含量大、口感差，加之我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品深加工水平不高，大部分麥麩僅被制成畜牧飼料［1-3］，甚至作為垃圾處理。因此，找尋麥麩合理的深加工方法并開(kāi)發(fā)高附加值的產(chǎn)品，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。

許多研究已證實(shí)麥麩中的酚酸類物質(zhì)具有抗氧化、抗癌等多種功效［4-5］。阿魏酸是麥麩中酚酸類物質(zhì)的主要成分，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以占到麩皮干重的0.66%［6］。酚酸的存在形式有游離型，結(jié)合型和束縛型，其中絕大多數(shù)是束縛型酚酸，以醚鍵、酯鍵和糖苷鍵與植物細(xì)胞壁中多糖、木質(zhì)素等大分子相連，屬于不可溶性酚類物質(zhì)［7］。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)微生物發(fā)酵的方法能夠破壞細(xì)胞壁，釋放束縛性酚酸，增加麥麩中游離酚酸，任雪榮［8］等發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵后不僅提高了麥麩的水溶性酚類物質(zhì)含量，還增強(qiáng)了抗氧化能力。使用微生物發(fā)酵的方法也符合綠色低碳的發(fā)展理念。

本研究以麥麩為原料，以阿魏酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)利用微生物發(fā)酵麥麩的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)還原力檢測(cè)試驗(yàn)和自由基清除試驗(yàn)，分析麥麩發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力，為麥麩的深度加工及其在制藥、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥麩：購(gòu)自市場(chǎng)；泡盛曲霉（Aspergillus awamori CGMCC 3.2576）、黑曲霉（Aspergillus niger，ATCC 16404）、米曲霉（Aspergillus oryzae，ATCC 56747）：廣東省微生物菌種保藏中心；PDA培養(yǎng)基：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；硫酸銨、硫酸銅、氯化鈉、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、鹽酸、鐵氰化鉀、氯化鐵：廣州化學(xué)試劑廠；過(guò)氧化氫、甲醇、乙醇、冰醋酸、鄰苯三酚：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；阿魏酸（色譜純）：阿拉??；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、維生素C：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris-HCl、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸：賽默飛。

1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS高速離心機(jī)：上海恒科儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：島津公司（日本）；WBK-6A恒溫水浴鍋、SHP-250生化培養(yǎng)箱：廣州環(huán)凱生物科技有限公司；Re-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；DHG-9076A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Biosafer-10A臺(tái)式凍干機(jī)：南京賽飛生物科技有限公司；UV1901紫外分光光度計(jì)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麥麩發(fā)酵

用100目篩篩去麥麩中的面粉組分，50℃烘干至恒重，粉碎；每個(gè)250 mL錐形瓶加入5 g粉碎的麥麩、0.04 g（NH4）2SO4、0.023 g CuSO4以及9 mL、19 mL或29 mL水，作為發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min。

三種曲霉保存在PDA斜面培養(yǎng)基上，向斜面培養(yǎng)基中加入無(wú)菌水，用接種環(huán)輕刮培養(yǎng)基表面，制得孢子懸液。每個(gè)錐形瓶加入1 mL孢子懸液，置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后50℃烘干。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇發(fā)酵菌種、培養(yǎng)基固液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間四個(gè)因素結(jié)合進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素有三個(gè)水平，采用L9（34）正交表，各因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)各因素取值

1.3.3 游離多酚和結(jié)合型多酚的提取

1.3.3.1 游離多酚的提取

烘干的發(fā)酵麥麩以及未發(fā)酵的麥麩粉碎后以料液比1∶5的比例加入80 wt%的甲醇溶液，室溫浸泡1 h，每份樣品浸提兩次。粗提液12 000 g離心10 min，收集上清液，40℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干燥，而后再凍干備用。

1.3.3.2 結(jié)合型多酚的提取

烘干甲醇提取后的麥麩殘?jiān)? g殘?jiān)?0 mL 2M NaOH溶液室溫處理6 h，提取液中和至中性后，12 000 g離心10 min，收集上清液，40℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干燥，而后再凍干備用。

1.3.4 麥麩提取多酚中阿魏酸含量的檢測(cè)［9］

采用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)兩種多酚提取物中的阿魏酸。游離多酚和結(jié)合型多酚的阿魏酸之和為麥麩中總的阿魏酸含量。色譜柱Aglient TC C18柱（250×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-2%醋酸（68∶32 V／V），流速1 mL／min；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。

1.3.5 體外抗氧化檢測(cè)

1.3.5.1 超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)

將1.3.3.1發(fā)酵麥麩的多酚提取物溶于水，配制阿魏酸濃度為5μg／mL、10μg／mL、15μg／mL、20 μg／mL、25μg／mL和30μg／mL的待測(cè)溶液。試管中加入2 900μL的pH＝7的Tris-HCl緩沖液和50 μL的待測(cè)液，再加入50μL的60 mM的鄰苯三酚溶液（溶于0.01 M的鹽酸），迅速混勻，記錄反應(yīng)開(kāi)始后30 s和300 s在325 nm的吸光值，計(jì)算ΔA（A300s—A30s）。以等量的Tris-HCl緩沖液做對(duì)照同法測(cè)得ΔA0。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式：（ΔA0—ΔA）／ΔA0×100%。

1.3.5.2 DPPH自由基清除試驗(yàn)［10］

將1.3.3.1發(fā)酵麥麩的多酚提取物溶于水，配制阿魏酸濃度為5μg／mL、10μg／mL、15μg／mL、20 μg／mL、25μg／mL和30μg／mL的待測(cè)溶液。DPPH溶于80%的甲醇（100μM），黑暗中攪拌16 h，調(diào)節(jié)OD515＝0.70±0.05，制成DPPH工作液。準(zhǔn)確吸取100μL的待測(cè)溶液加入到3.9 mL的DPPH工作液中，黑暗中22℃反應(yīng)2 h，測(cè)定反應(yīng)液的OD515記為Ax，超純水作為空白對(duì)照（A0）。自由基清除率的計(jì)算公式為：（A0—Ax）／A0×100%。

1.3.5.3 羥基自由基清除試驗(yàn)［11］

將1.3.3.1發(fā)酵麥麩的多酚提取物溶于水，配制阿魏酸濃度為5μg／mL、10μg／mL、15μg／mL、20 μg／mL、25μg／mL和30μg／mL的待測(cè)溶液。在試管中依次加入0.5 mL待測(cè)液，0.5 mL的9 mM水楊酸-乙醇溶液，0.5 mL的9 mM FeSO4，0.5 mL的8.8 mM過(guò)氧化氫，混勻，室溫反應(yīng)30 min。反應(yīng)液在510 nm檢測(cè)吸光值（Ax），超純水做對(duì)照（A0），羥基自由基清除率計(jì)算公式：（A0—Ax）／A0×100%。

1.3.5.4 還原力檢測(cè)試驗(yàn)［12］

將1.3.3.1發(fā)酵麥麩的多酚提取物溶于水，配制阿魏酸濃度為5μg／mL、10μg／mL、15μg／mL、20 μg／mL、25μg／mL和30μg／mL的待測(cè)溶液。1 mL的待測(cè)液與1 mL的0.2 M磷酸鹽緩沖液（pH＝6.6）以及1 mL的1%鐵氰化鉀溶液混合，50℃水浴20 min，再加入1 mL的10 wt%三氯乙酸溶液。5000 g離心15 min，取2.5 mL混合液加入0.15 mL 0.1 wt%的FeCl3，0.2 mg／mL的維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照。在700 nm處檢測(cè)吸光值，吸光值越高說(shuō)明還原力越強(qiáng)。

2 結(jié)果和討論

2.1 不同發(fā)酵條件下發(fā)酵麥麩中游離阿魏酸的含量

為優(yōu)化麥麩發(fā)酵工藝，選擇菌種、固液比、溫度和時(shí)間，進(jìn)行四因子三水平正交試驗(yàn)，通過(guò)HPLC檢測(cè)發(fā)酵后麥麩中游離阿魏酸的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1可見(jiàn)，CMV4000探測(cè)器的非均勻性主要表現(xiàn)在列與列之間，行與行之間的非均勻性相對(duì)來(lái)說(shuō)較小。原因在于CMV4000探測(cè)器采用多通道傳輸，各列的列增益存在一定誤差，這在工藝上不可避免。按照傳統(tǒng)的算法，計(jì)算每一個(gè)像素點(diǎn)的校正參數(shù)，所需參數(shù)較多。為減小資源消耗，本文在處理時(shí)按列校正。由于探測(cè)器各個(gè)像素點(diǎn)有獨(dú)立的增益放大器，它們也存在一定差異，同時(shí)數(shù)據(jù)傳輸中不可避免會(huì)引入噪聲，為了消除這些因素的影響，首先對(duì)圖像進(jìn)行濾波[4]。

表2 優(yōu)化發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）可知，極差RA＞RC＞RD＞RB，表明四個(gè)因素中對(duì)阿魏酸產(chǎn)量影響大小的順序?yàn)椋壕N＞時(shí)間＞溫度＞固液比。確定各因素的理論最佳組合為A1B2C3D2，即使用泡盛曲霉，固液比1∶4，28℃下發(fā)酵7 d。對(duì)理論最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，檢測(cè)阿魏酸含量為（164.3±3.1）μg／g，超過(guò)正交試驗(yàn)中的最優(yōu)結(jié)果（A1B2C2D2，155.3μg／g）。

經(jīng)HPLC檢測(cè)，未發(fā)酵的麥麩的總阿魏酸含量為1 430.2μg／g，其中游離部分僅為10.7μg／g。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，游離阿魏酸含量提高了約15倍，占麥麩總阿魏酸的11.5%。

2.2 發(fā)酵麥麩多酚提取物的抗氧化能力

2.2.1 超氧陰離子自由基清除率

超氧陰離子自由基（·O-2）能引起脂質(zhì)過(guò)氧化，與衰老密切相關(guān)。鄰苯三酚（pyrogallol）在堿性條件下釋放出超氧陰離子自由基，在325 nm處有吸收峰，有抗氧化劑的存在能使吸光值減?。?3］。不同濃度多酚提取物的超氧陰離子自由基清除率如圖1。隨樣品濃度提高，自由基清除率逐漸提高，最高為66.3%。經(jīng)計(jì)算，多酚提取物的IC50值（自由基清除率為50%對(duì)應(yīng)的濃度，與抗氧化能力成反比）20.9μg阿魏酸／mL。

圖1 多酚提取物的超氧陰離子自由基清除率

2.2.2 DPPH清除率

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的單電子被捕獲，最大吸收光波長(zhǎng)處吸光值下降，故用吸光值下降程度來(lái)評(píng)價(jià)抗氧化能力。圖2為不同濃度多酚提取物的DPPH清除率，多酚提取物對(duì)DPPH有較強(qiáng)的清除能力。阿魏酸濃度為20μg／mL的多酚提取物的DPPH清除率達(dá)到了81.5%，繼續(xù)提高濃度不再有明顯變化（最高82.8%）。多酚提取物的IC50值為7.6μg阿魏酸／mL。

圖2 多酚提取物的DPPH清除率

羥基自由基（·OH）是化學(xué)性質(zhì)最活潑的自由基，對(duì)細(xì)胞的危害性最大。Fe2＋與H2O2反應(yīng)能生成·OH（Fenton反應(yīng)）［14］，可利用該反應(yīng)體系檢測(cè)物質(zhì)羥基自由基清除能力。圖3為不同濃度的多酚提取物對(duì)羥基自由基清除試驗(yàn)的結(jié)果。隨著濃度增加，多酚提取物對(duì)羥基自由基的清除率從23.3%提高到73.4%。經(jīng)計(jì)算，羥基自由基的IC50為18.1 μg阿魏酸／mL，大于DPPH自由基IC50（7.6μg阿魏酸／mL），小于超氧陰離子自由基（20.9μg阿魏酸／mL），故多酚提取物清除各種自由基的能力大小依次為：DPPH自由基＞羥基自由基＞超氧陰離子自由基。

圖3 多酚提取物的羥基自由基清除率

2.2.4 還原力

還原力是衡量抗氧化能力的重要指標(biāo)，還原力表示物質(zhì)提供電子的能力，還原力越強(qiáng)表明抗氧化能力越強(qiáng)。發(fā)酵麥麩的多酚提取物的還原力檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。隨著濃度的增加，多酚提取物溶液的還原力從0.260增長(zhǎng)至1.011。陽(yáng)性對(duì)照，即0.2 mg／mL的維生素C的還原力結(jié)果為0.461，與含10μg／mL阿魏酸的多酚溶液的還原力（OD＝0.451）相近。

圖4 多酚提取物的還原力檢測(cè)

除了阿魏酸，麥麩多酚中還含有香豆酸、丁香酸等其他多種酚酸類物質(zhì)［15］，這些物質(zhì)也具有不同程度的抗氧化能力，因此以上試驗(yàn)實(shí)際檢測(cè)到的是多酚提取物的總抗氧化能力。微生物發(fā)酵不僅能改變材料原有的活性物質(zhì)含量，還可能產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，不同活性物質(zhì)之間相互作用的共同作用可能大于單一物質(zhì)的抗氧化能力，其相關(guān)的發(fā)生機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。此外，不同產(chǎn)地、不同品種小麥加工成的麥麩，酚酸類物質(zhì)組成和含量存在一定差別，發(fā)酵工藝也可能需要適當(dāng)調(diào)整。

3 結(jié)論

本研究以市售小麥麩皮為底物進(jìn)行微生物發(fā)酵，以阿魏酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)探究最優(yōu)發(fā)酵條件，明確了最佳發(fā)酵條件為：接種泡盛曲霉，固液比1∶4，溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間7 d。在此發(fā)酵條件下，發(fā)酵麥麩中的游離阿魏酸含量為164.3

μg／g，占麥麩總阿魏酸的11.5%。提取發(fā)酵麥麩的多酚進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其超氧陰離子清除率、DPPH自由基清除率、羥基自由基和還原力最高分別可達(dá)66.3%、82.8%、73.4%和1.011，表明本研究中的麥麩發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，為將來(lái)開(kāi)發(fā)發(fā)酵麥麩相關(guān)的功效產(chǎn)品提供了依據(jù)。