石嘉寧， 徐 佳， 孔夢(mèng)圓， 王寧寧， 田艷杰， 崔彩霞， 周晨妍

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院河南省合成生物學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453003

在自然界的可再生資源中，木聚糖的含量?jī)H次于纖維素［1-2］。作為半纖維素主要組成成分的木聚糖，由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在自然條件下很難降解，它的降解需要多種酶的共同參與。木聚糖酶主要存在于植物、動(dòng)物和微生物中，木聚糖酶通過隨機(jī)的方式作用于木聚糖主鏈，將其降解為木糖和低聚木糖［3-6］。木聚糖酶在許多行業(yè)都有廣泛的應(yīng)用，包括食品工業(yè)［7-9］、動(dòng)物飼料生產(chǎn)［10］和紙漿生物漂白［11-12］等。

CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.cazy.org）分析顯示，在糖苷水解酶（GH）第62、51、43、11、10、9、5等家族均有歸類的木聚糖酶［13-14］。不同家族木聚糖酶在結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)及適用領(lǐng)域上均存在較大差異［15］，其中GH10家族由一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，該結(jié)構(gòu)域由pI在8.0～9.5之間的連接肽連接，在結(jié)構(gòu)上呈“桶狀”結(jié)構(gòu)。

麥?zhǔn)辖惶鎲伟ˋlteromonas macleodii）是本實(shí)驗(yàn)室在煙臺(tái)近海分離出的一株海洋微生物，課題組從麥?zhǔn)辖惶鎲伟蚪M中分析到木聚糖酶XynZT-3基因的存在，已將該基因序列在Genbank登錄，登錄編號(hào)為MT 814 837。本研究對(duì)木聚糖酶XynZT-3基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及相應(yīng)的表達(dá)條件優(yōu)化，以期為該酶的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Alteromonas macleodii（麥?zhǔn)辖惶鎲伟〩Y35由實(shí)驗(yàn)室保存，克隆宿主Escherichia coli（大腸桿菌）DH5α購(gòu)自Novagen公司，Pichia pastoris（畢赤酵母）GS115及pPIC9K表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)買于Invitrogen公司。

T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、E×Taq DNA聚合酶、DNA Marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖糖苷（IPTG）：TaKaRa生物技術(shù)有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒及DNA小量抽提試劑盒、卡那霉素：上海生工生物工程有限公司；根據(jù)Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)配制酵母培養(yǎng)基BMMY、BMGY、YPD、MD。

Tprofessional 96 PCR分析儀：德國(guó)Biometra公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-2）：北京市六一儀器廠；電轉(zhuǎn)化儀（GenePulserII）：美國(guó)BIO-RAD公司；紫外可見分光光度計(jì)UV759：上海佑科儀器儀表有限公司低溫恒溫槽（DC-0506）：上海比朗儀器有限公司。

1.2 序列分析

查閱網(wǎng)站（https：／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa_automat.pl？page＝／NPSA／npsa_sopma.html）對(duì)酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用網(wǎng)站（https：／／swissmodel.expasy.org／）對(duì)酶蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過網(wǎng)站（http：／／pfam.xfam.org／search／＃tabview＝tab1）預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)域。采用軟件DNAMAN 9.0繪制進(jìn)化樹、分析同源序列。通過網(wǎng)站（https：／／web.expasy.org／protparam／）理論等電點(diǎn)常數(shù)（pI）和計(jì)算分子量（MW），利用NetNGlyc1.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）對(duì)潛在的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 密碼子優(yōu)化及目的基因合成

不同物種對(duì)密碼子的使用頻率不同，為了將目的基因后期能在畢赤酵母中較好表達(dá)，通過網(wǎng)站（http：／／www.jcat.de／）對(duì)木聚糖酶基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，原始序列中GC含量為45.8%，優(yōu)化后GC含量為48.7%，交由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行目的基因的合成。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)A．macleodii木聚糖酶基因序列xynZT-3，以及P．pastoris表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出兩條引物。

1.5 重組載體的構(gòu)建

以合成的目的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，制備1%瓊脂糖凝膠觀察擴(kuò)增情況，目的條帶割膠回收、雙酶切和連接［16］。連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)E．coli DH5α，對(duì)長(zhǎng)出的克隆子，提取質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 重組菌的構(gòu)建

大量提取表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，SalⅠ線性化酶切后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增情況，并割膠回收。將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到GS115感受態(tài)中，在含有不同濃度G418的YPD平板上進(jìn)行重組菌的篩選。

1.7 重組菌搖瓶培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)

挑選含有G418（終濃度為1.25 mg／mL）的YPD平板上菌落較大的克隆子［17］，分別接種到30 mL BMGY培養(yǎng)基中，以含有GS115空載體的重組菌做對(duì)照，30℃，220 r／mim搖床培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到A600＝0.6左右時(shí)，離心收集沉淀；加入30 mL BMMY培養(yǎng)基發(fā)酵，30℃，220 r／mim搖床培養(yǎng)，每隔24 h加入150μL甲醇誘導(dǎo)，培養(yǎng)3～7 d，發(fā)酵液離心后取上清，測(cè)木聚糖酶活力。

1.8 木聚糖酶活力測(cè)定

采用DNS法［18］測(cè)定木聚糖酶活力。酶活力單位的定義：在pH 7.0、45℃的反應(yīng)條件下以0.5%樺木木聚糖為底物，反應(yīng)15 min，以每分鐘產(chǎn)生1 μmoL木糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.9 木聚糖酶蛋白電泳分析

將2×SDS蛋白上樣緩沖液加入到處理好的酶液中，混勻后，將其變性（煮沸10 min），離心（10 000 r／mim）10 min，SDS-PAGE電泳檢測(cè)上清，染色1 h（考馬斯亮藍(lán)R-250），脫色后，觀察目的條帶。

1.10 發(fā)酵條件優(yōu)化

選擇誘導(dǎo)溫度（12℃、16℃、20℃、24℃和28℃）、甲醇誘導(dǎo)劑的濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%）、種齡（16 h、20 h、24 h、28 h和32 h）、誘導(dǎo)時(shí)間（3 d、4 d、5 d、6 d和7 d）和誘導(dǎo)pH（pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8和pH 9）這幾個(gè)因素，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)［19-20］，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)重組菌產(chǎn)酶能力采用四因素三水平N＝29的Box-Behnken［21-22］響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究，以誘導(dǎo)溫度、甲醇濃度、種齡和pH為響應(yīng)面自變量設(shè)計(jì)因素水平表（表1）。

表1 響應(yīng)面因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶序列分析

麥?zhǔn)辖惶鎲伟鶫Y35基因組中的木聚糖酶XynZT-3基因序列在Genbank登錄，登錄編號(hào)為MT 814 837。xynZT-3序列全長(zhǎng)為2970 bp，該序列成熟肽編碼989個(gè)氨基酸（圖1），沒有內(nèi)含子和信號(hào)肽區(qū)域，下劃線標(biāo)注的第29至第313氨基酸序列為編碼的GH10家族結(jié)構(gòu)域。xynZT-3預(yù)測(cè)等電點(diǎn)（pI）為4.15，分子量為107.74 kDa，分子式為C4827H7340 N1246O1535S11，預(yù)測(cè)存在7個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)（N5AT，N97ET，N158IT，N563GS，N772YT，N878GS，N968GS）。

圖1 木聚糖酶XynZT-3序列分析

2.2 木聚糖酶氨基酸序列比對(duì)分析

從NCBI中挑選出不同糖苷水解酶家族的木聚糖酶基因序列，利用DNAMAN9.0軟件對(duì)XynZT-3進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹比對(duì)，由圖2可以看出，XynZT-3與GH10家族的木聚糖酶序列屬于一個(gè)分支，由此可進(jìn)一步推斷XynZT-3屬于糖苷水解酶第10家族。

圖2 XynZT-3氨基酸序列進(jìn)化樹分析

2.3 木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)建模

通過對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，木聚糖酶XynZT-3的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由a-螺旋、無規(guī)則卷曲以及延展鏈構(gòu)成，所占比例分別為22.55%、27.81%和41.66%。XynZT-3三維結(jié)構(gòu)建模如圖3所示，XynZT-3具有GH10家族典型的“桶狀”結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

圖3 XynZT-3同源建模三維結(jié)構(gòu)

2.4 重組菌木聚糖酶SDS-PAGE分析及酶活力檢測(cè)

重組菌GS115／xynZT-3與預(yù)測(cè)目的蛋白分子量（107.0 kDa）相同位置處有明顯條帶，對(duì)照菌株GS115／pPIC9K在相應(yīng)位置沒有目的條帶。發(fā)酵液酶活力檢測(cè)，重組菌GS115／xynZT-3發(fā)酵液能明顯檢測(cè)出木聚糖酶活力，而對(duì)照菌株GS115／pPIC9K發(fā)酵液中未檢測(cè)出木聚糖酶活力，說明重組菌成功表達(dá)了目的蛋白（圖4）。

圖4 重組菌木聚糖酶SDS-PAGE分析

2.5 重組菌發(fā)酵條件優(yōu)化

圖5a可以看出，重組菌GS115／xynZT-3在12 h～30 h時(shí)間處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌體生長(zhǎng)迅速。溫度對(duì)重組菌相對(duì)酶活力的影響如圖5b，木聚糖酶活力隨著誘導(dǎo)溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。相對(duì)酶活力達(dá)到最高時(shí)，誘導(dǎo)溫度為16℃；當(dāng)誘導(dǎo)溫度超過20℃時(shí)，重組酶相對(duì)酶活力急劇下降，僅能保持50%的相對(duì)酶活力。這可能由于低溫對(duì)畢赤酵母發(fā)酵過程中細(xì)胞物質(zhì)及能量代謝有促進(jìn)作用，可提高胞內(nèi)醇氧化酶活力及能量水平［23］。

圖5c顯示：甲醇誘導(dǎo)濃度為1.50%時(shí)，重組菌相對(duì)酶活力最高；當(dāng)甲醇誘導(dǎo)濃度大于2%時(shí)，重組菌相對(duì)酶活力急劇降低。這可能由于pPIC9K載體中有醇氧化酶（AOX I）基因的啟動(dòng)子，屬于可利用甲醇的正常型菌株，低濃度的甲醇對(duì)重組菌有激活作用，可使相對(duì)酶活力增加，高濃度的甲醇對(duì)重組菌有抑制作用，可使相對(duì)酶活力降低［24］。圖5 d顯示重組菌最佳種齡為28 h時(shí)，這與圖5a生長(zhǎng)曲線顯示重組菌培養(yǎng)28 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的末期，此時(shí)菌體活力強(qiáng)，菌體濃度大，適宜接種，結(jié)果相一致。

圖5e顯示：當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為4 d時(shí)，相對(duì)酶活力最高，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間大于5 d時(shí)，相對(duì)酶活力逐漸降低。這可能因?yàn)檎T導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)，使菌體發(fā)生自溶，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白降解被釋放出［25-27］。圖5-f顯示：重組木聚糖酶的相對(duì)酶活力隨著培養(yǎng)基pH值的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。相對(duì)酶活力達(dá)到最高時(shí)，pH為4.0；當(dāng)pH大于7.0時(shí)，相對(duì)酶活力急劇下降。這可能由于酶蛋白自身穩(wěn)定性較差且在中性條件下酸性殘基的表面的空間分布不同，從而使相對(duì)酶活力下降［28-30］。

圖5 單因素優(yōu)化最適條件

2.6 重組菌響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

響應(yīng)面結(jié)果如表2所示。利用Design Expert軟件對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過方差分析（表3）可知，在誤差允許范圍內(nèi)，四個(gè)因素的影響P＞F，因此四個(gè)因素的影響是顯著的，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過最小二乘法法回歸方程得到重組菌GS115／xynZT-3產(chǎn)木聚糖酶的相對(duì)酶活力（Y）對(duì)于誘導(dǎo)溫度（X1）、甲醇濃度（X2）、種齡（X3）和pH（X4）的二次多項(xiàng)回歸模型：相對(duì)酶活力（Y）＝91.20-14.08X1-3.50X2-2.50X3＋1.58X4-1.25X1X2＋4.75X1X3-7.75X1X4＋2.25X2X3＋4.50X2X4＋4.50X3X4-24.14X12＋3.48X22-14.02X32-8.89X42。當(dāng)變量為1時(shí)，線性擬合系數(shù)R2＝0.823 9，誤差平方和為0.647 9，擬合度良好。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)計(jì)劃表

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

模型三維圖如圖6所示，四個(gè)因素在不同的水平對(duì)酶活力均能產(chǎn)生不同的影響，最大值處于三維圖的中心，模擬獲得最佳發(fā)酵條件誘導(dǎo)溫度16℃、甲醇濃1.50%、種齡28 h、pH3.7。在優(yōu)化條件下，實(shí)際酶活力為4.212 U／mL，為預(yù)測(cè)值的87.5%，說明此回歸方程很好地反應(yīng)了實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況。

圖6 響應(yīng)面分析三維圖

3 結(jié)論

對(duì)麥?zhǔn)辖惶鎲伟心揪厶敲竫ynZT-3基因進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示它屬于GH10家族。XynZT-3基因在畢赤酵母GS115中成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。對(duì)重組菌P．pastoris GS115／xynZT-3經(jīng)單因素優(yōu)化及響應(yīng)面分析，在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下，重組菌最優(yōu)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度16℃、甲醇濃1.50%、種齡28 h、pH3.7，培養(yǎng)6 d，在該條件下，重組酶活力為4.212 U／mL。本實(shí)驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室水平上進(jìn)行的，后續(xù)研究可以考慮在發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行產(chǎn)酶條件的進(jìn)一步優(yōu)化。后續(xù)研究也將進(jìn)一步探究重組酶的酶學(xué)特性，采用基因工程研究手段對(duì)該酶分子進(jìn)行進(jìn)一步的改造研究，以期能夠滿足食品工業(yè)的應(yīng)用需求。