蘇 暢，王 宇，鄭玉光，郭 龍，張?zhí)m蘭，3※，鄭開顏※

（1.河北中醫(yī)學院藥學院，石家莊 050200；2.河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，石家莊 050200；3.河北御芝林生物科技有限公司，石家莊 050200）

0 引言

自新型冠狀病毒疫情發(fā)生以來，中醫(yī)藥已經(jīng)廣泛應(yīng)用于新型冠狀病毒的治療，其中多省市推薦的中藥應(yīng)用了荊芥。荊芥為唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifoliaBriq.的干燥地上部分，其干燥的花穗為荊芥穗，辛，微溫，入肝、肺經(jīng)，具有解表祛風，透疹，消瘡的功效[1]，可用于治療感冒、頭痛、麻疹、風疹、瘡?fù)闯跗鸬劝Y[2]，為中醫(yī)臨床常用藥物。荊芥最早以“假蘇”一名載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，“荊芥”之名始載于《吳普本草》，地上部分均可入藥，明清時期，有醫(yī)家選荊芥穗入藥，其余大多時期皆以莖穗同用[3]，現(xiàn)今多將荊芥穗單獨使用。

荊芥在全國大部分地區(qū)均有種植，主產(chǎn)區(qū)分布在河北、山東、河南等地。由于來源廣泛，生態(tài)環(huán)境和栽培技術(shù)等因素對荊芥的產(chǎn)量和質(zhì)量影響較大，荊芥及荊芥穗主含揮發(fā)油類成分[4]，荊芥揮發(fā)油具有抗病毒[5]、抗炎[6]作用。目前，荊芥揮發(fā)油的相關(guān)研究主要集中為單一成分作用及不同提取方法，提取方法主要是超臨界CO2流體萃取法（SFE）和水蒸氣蒸餾法（SD），也有少數(shù)采用微波輔助提取法（MAE），關(guān)于產(chǎn)地對荊芥揮發(fā)油影響的研究少見報道。袁岸等[1]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學對荊芥的揮發(fā)油進行研究，結(jié)果證明其主要成分為薄荷酮、胡薄荷酮等。已有研究表明檸檬烯有抑菌、止咳的功效[8]，β-石竹烯具有鎮(zhèn)痛的功效[9]，氧化石竹烯有抗炎作用[10]，薄荷酮具有利膽、促滲等作用[11-12]，胡薄荷酮具有抗流感病毒的功效[13]，荊芥揮發(fā)油各成分類型及含量間的差異能夠引起藥效的差異。

文章采用最大熵（Maxent）模型結(jié)合地理信息系統(tǒng)（ArcGIS）繪制我國荊芥的適宜生長區(qū)，并采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對部分產(chǎn)地的荊芥和荊芥穗的揮發(fā)油進行定性和定量分析，比較其品質(zhì)的差異，為荊芥種植環(huán)境的選擇、藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集荊芥樣本共12批，記錄經(jīng)緯度，經(jīng)河北中醫(yī)學院鄭玉光教授鑒定為唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifoliaBriq.的干燥地上部分，另查閱中國國家標本資源平臺（NSII,http://www.nsii.org.cn），收集荊芥分布經(jīng)緯度信息，1～12號為實地采集樣本，13～48號來源于NSII，見表1。收集不同產(chǎn)地荊芥，部位為莖和穗，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油并計算得率，見表2。

表1 荊芥樣本位置信息

表2 荊芥及荊芥穗樣品信息和揮發(fā)油得率

1.2 儀器與試劑

儀器：7890B氣相色譜儀（美國安捷倫公司），5977B質(zhì)譜分析儀（美國安捷倫公司），高速離心機（德國eppendorf公司），Sartorius SQP電子天平（北京賽多利斯公司）。

試劑：(-)-薄荷酮購自北京索萊寶科技有限公司，β-石竹烯購自上海安譜實驗科技股份有限公司，(+)-檸檬烯購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，(-)-氧化石竹烯購自Sigma-Aldrich公司，胡薄荷酮購自上海源葉生物科技有限公司，1-辛烯-3-醇購自Aladdin公司，順-茉莉酮購自Aladdin公司，正己烷購自Fisher Chemical公司。

1.3 生境適宜度研究

1.3.1 生態(tài)因子數(shù)據(jù)獲取

查閱中藥資源空間信息網(wǎng)格數(shù)據(jù)庫（http://www.tcm-resources.com），獲得到可能影響荊芥生長的生態(tài)因子，荊芥的生長與地形、氣候、土壤等生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)，最終獲得可能影響荊芥生長的生態(tài)因子55種，見表3。

表3 生態(tài)因子信息

1.3.2 生態(tài)因子篩選及生境適宜度劃分

將荊芥的經(jīng)緯度信息及生態(tài)因子數(shù)據(jù)（比例尺為1∶100萬）導(dǎo)入Maxent進行迭代運算，最大迭代次數(shù)為100萬，對所有生態(tài)因子貢獻率進行排序，篩選貢獻率較高的生態(tài)因子。采用ROC（receiver operating characteristic curve）曲線下面積AUC作為評價指標，AUC值接近1，則模型的可信度與精準度高。評價合格后采用ArcGIS將各生態(tài)因子的適宜性疊加，根據(jù)分布點的生境適宜度分為最適宜區(qū)、較適宜區(qū)、不適宜區(qū)3個等級，得到荊芥生境適宜度等級分布圖。

1.4 揮發(fā)油成分測定

GC-MS檢測條件：Agilent HP-5毛細管柱（0.32mm*30m，0.25μm）；載氣N2，體積流量1ml/min；進樣量1μl；進樣口溫度250℃；分流比10∶1。程序升溫：初始溫度80℃，保持3 min，以10℃/min升至110℃，保持3 min，后以10℃/min升至210℃，保持3 min，再以10℃/min升至230℃保持2 min。EI電離源，電離電壓70eV；全掃描方式，質(zhì)量范圍50～500amu；溶劑延遲3min。

精密量取揮發(fā)油50μl，正己烷定容至5ml，即得供試品溶液。譜圖數(shù)據(jù)采用NIST 17數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定荊芥、荊芥穗揮發(fā)油中的成分。精密稱取(-)-薄荷酮500.25mg、β-石竹烯50.11mg、(+)-檸檬烯50.18mg、(-)-氧化石竹烯49.89mg、胡薄荷酮400.33mg、1-辛烯-3-醇5.053mg、順-茉莉酮5.032mg，分別置于10ml容量瓶中，用正己烷溶解并定容，即得混合對照品溶液。采用外標法進行7種成分的定量分析。

1.5 OPLS-DA分析

正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）能夠很好地尋找組間差異性成分。將GC-MS處理的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA軟件，進行OPLS-DA分析，選取VIP＞1的化合物作為差異標志物。

1.6 生態(tài)適宜性區(qū)劃

使用SPSS統(tǒng)計軟件對經(jīng)緯度信息、生態(tài)因子與荊芥揮發(fā)油含量進行相關(guān)分析，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果對揮發(fā)油成分含量有影響的生態(tài)因子進行不同的適宜性等級劃分，應(yīng)用ArcGIS軟件進行空間疊加，得到荊芥的生態(tài)適宜性等級分布圖。

2 結(jié)果

2.1 主要生態(tài)因子

按方法最終得到16個對荊芥生長具有貢獻率的生態(tài)因子，分別為：土壤類型＞最濕月降水量＞季節(jié)降水量變異系數(shù)＞土壤有效水含量等級＞坡向＞溫度季節(jié)性變化的標準差＞海拔＞年均溫變化范圍＞土壤質(zhì)地分類＞酸堿度＞最干季降水量＞最濕季平均溫＞年均降水量＞土壤的陽離子交換能力＞坡度＞最干月降水量，貢獻率最大的5個生態(tài)因子貢獻率分別為40.2%、20.6%、13.8%、8.8%、6.1%，見圖1。

圖1 影響荊芥生長的生態(tài)因子及其貢獻率

2.2 生境適宜度區(qū)劃

荊芥ROC曲線測試集和訓練集的AUC值分別為0.996和0.963，均接近于1，表明Maxent模擬效果好，生境適宜度研究準確度好，具有很高的參考價值。荊芥在我國的生境適宜度等級劃分見圖2。由圖2可知，荊芥在我國種植的最適宜區(qū)主要在東部，包括：遼寧西南部、北京、天津、河北南部、山東西北部、河南北部、海南北部，此外內(nèi)蒙古東部、安徽北部也為最適宜區(qū)。新疆、青海、西藏大部分地區(qū)不適宜荊芥的種植。

圖2 荊芥生境適宜度等級劃分（審圖號GS（2019）1831號）

2.3 總揮發(fā)油含量分析

采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，比較揮發(fā)油得率可知：安徽亳州、山東菏澤、河北安國產(chǎn)荊芥揮發(fā)油總含量高，西藏日土、河北承德產(chǎn)荊芥揮發(fā)油總含量低。河北安國產(chǎn)荊芥穗總揮發(fā)油含量高，西藏日土、河北承德產(chǎn)荊芥穗總揮發(fā)油含量低。荊芥穗中總揮發(fā)油的含量明顯高于荊芥中總揮發(fā)油的含量。

2.4 揮發(fā)油成分分析及生境適宜度區(qū)劃的驗證

進行GC-MS分析，得到荊芥、荊芥穗揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖(TIC)，見圖3。所得譜圖經(jīng)NIST 17數(shù)據(jù)庫檢索，與標準圖譜對照、人工譜圖解析，并與文獻比對，從而鑒定荊芥、荊芥穗中的揮發(fā)性成分，部分化合物結(jié)果見表4。分別以7種化合物的峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X）（mg/mL）為橫坐標繪制線性回歸標準曲線。得到回歸方程為1-辛烯-3-醇Y=110 339.73X+126 769.266，r2=0.993 2；檸檬烯Y=748 628.05X+90 783.680，r2=0.994 1；薄荷酮Y=126 935.43X+515.149，r2=0.998 9；胡薄荷酮Y=441 434.34X+367 436.469，r2=0.999 5；β-石竹烯Y=537 022.34X+92 593.938，r2=0.993 6；順-茉莉酮Y=33 208.52X+1 832.733，r2=0.999 2；氧化石竹烯Y=515 602.50X+54 459.665，r2=0.996 2。以外標法計算該化合物在原藥材樣品中的濃度，結(jié)果見表5。

圖3 荊芥不同部位揮發(fā)性化學成分分析GC-MS總離子流

該研究以“18個樣品中含某種成分的樣品數(shù)量多于12個，則認為不含該成分的樣品為特殊樣品，反之相同”為劃分標準，分析揮發(fā)油中的成分種類，見表4。結(jié)果可得：①揮發(fā)油成分中，安徽（S1）、山東（S2）荊芥檢測出成分種類較多。安徽產(chǎn)荊芥未檢出α-葎草烯，山東產(chǎn)荊芥未檢出馬鞭草烯酮，河北承德產(chǎn)荊芥（S3）未檢出β-蓽澄茄油烯。②河北安國產(chǎn)荊芥穗（S14）檢出成分種類較多，西藏產(chǎn)荊芥穗（S15）檢出成分種類較少。四川產(chǎn)荊芥穗（S8）、云南產(chǎn)荊芥穗（S9）未檢出桉油烯醇成分，河北產(chǎn)荊芥穗（S13、S14）檢出β-欖香烯，西藏產(chǎn)荊芥穗（S15）未檢出β-蓽澄茄油烯。

表4 荊芥及荊芥穗揮發(fā)油中主要揮發(fā)性成分

分析7種化合物的含量，見表5。結(jié)果可得：①荊芥中各成分的含量低于荊芥穗中同種成分的含量。②安徽（S1）、山東（S2）荊芥多種成分含量高于其他產(chǎn)地。③河北安國產(chǎn)荊芥穗（S14）各成分含量均較高。云南產(chǎn)荊芥穗（S9）氧化石竹烯、茉莉酮含量較低；湖北產(chǎn)荊芥穗（S12）薄荷酮含量較低；西藏產(chǎn)荊芥穗（S15）β-石竹烯、薄荷酮含量低；河北產(chǎn)荊芥穗（S13、S17）薄荷酮含量高，胡薄荷酮含量低。

綜上，安徽、山東產(chǎn)荊芥檢出成分數(shù)量多且各成分含量較高，質(zhì)量優(yōu)。河北安國產(chǎn)荊芥穗各成分含量較高，質(zhì)量優(yōu)。西藏產(chǎn)荊芥穗檢出成分數(shù)量少，質(zhì)量差。生境適宜度研究結(jié)果顯示河北南部、山東西北部、安徽北部適宜荊芥的種植，西藏地區(qū)不適宜荊芥的種植，表明生境適宜度研究結(jié)果準確可靠。

2.5 OPLS-DA分析

將GC-MS處理的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA軟件，進行PCA分析，結(jié)果見圖4荊芥及荊芥穗明顯分布于兩個區(qū)域，即荊芥與荊芥穗的揮發(fā)油中化學成分存在差異。進一步進行OPLS-DA分析，在建立的正交偏最小二乘判別分析模型中，累計解釋能力參數(shù)RX2和RY2分別為0.77和0.81，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.71，R2和Q2均大于0.5，表示模型的穩(wěn)定性及預(yù)測能力較好。荊芥與荊芥穗樣品點區(qū)分明顯，表明荊芥與荊芥穗揮發(fā)油中的成分有明顯的區(qū)別。做S-plot分析，見圖5，篩選出3個差異化合物。進一步對荊芥及荊芥穗的差異性進行整體分析，得到VIP預(yù)測值，在0.95的置信區(qū)間內(nèi)，選取VIP＞1的化合物作為差異性標志物。結(jié)果顯示，胡薄荷酮的VIP值為2.98，薄荷酮的VIP值為2.88，檸檬烯的VIP值為1.19。因此，根據(jù)正交偏最小二乘判別分析，胡薄荷酮、薄荷酮及檸檬烯為荊芥和荊芥穗的差異化合物，可作為二者區(qū)分的依據(jù)，3種成分的含量差異見表5。

圖4 主成分分析得分

圖5 OPLS-DA分析的S-plot圖

表5 7種化合物的含量測定（n=3） mg/g

2.6 生態(tài)適宜性區(qū)劃

對荊芥揮發(fā)油含量及經(jīng)緯度、生態(tài)因子數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的指標數(shù)據(jù)（P＞0.10）進行Pearson相關(guān)分析，非正態(tài)分布的指標數(shù)據(jù)進行Spearman相關(guān)分析。分析結(jié)果顯示，荊芥揮發(fā)油含量與有機碳含量、最冷季平均溫、最冷月最低溫、最暖月最高溫的相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），相 關(guān) 系 數(shù) 分 別 為0.752、0.604、0.584、0.712。

荊芥揮發(fā)油含量為因變量，有機碳含量、最冷季平均溫、最冷月最低溫、最暖月最高溫4個生態(tài)因子為自變量，進行逐步回歸分析，納入概率值為0.05，剔除概率值為0.10，結(jié) 果 見 表6～8。表6顯 示R為0.752，R2為0.565，說明揮發(fā)油含量能被有機碳含量解釋占56.5%，其他因素及偶然因素的原因占43.5%；表7顯示F=12.989，P＜0.05，說明回歸方程的顯著性具有統(tǒng)計學意義；表8顯示，有機碳含量對揮發(fā)油含量的影響有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），回歸方程為Y=0.780X+0.687。

表6 模型匯總

表7 Anovaa

表8 系數(shù)a

根據(jù)生態(tài)因子對荊芥揮發(fā)油含量的影響，將有機碳含量、最冷季平均溫、最冷月最低溫、最暖月最高溫劃分為不同的適宜性等級，應(yīng)用ArcGIS進行空間疊加，得到荊芥生態(tài)適宜性等級分布，見圖6。結(jié)果顯示，我國中部地區(qū)，包括河北南部、山東、安徽北部等地區(qū)適合荊芥揮發(fā)油含量的積累，青海、西藏地區(qū)不適宜荊芥揮發(fā)油含量的積累。

圖6 荊芥生態(tài)適宜度等級劃分（審圖號GS（2019）1831號）

3 結(jié)論

3.1 荊芥生境適宜度研究

荊芥在我國種植的最適宜區(qū)主要在東部平原地區(qū)，包括：遼寧西南部、北京、天津、河北南部、山東西北部、河南北部、海南北部，內(nèi)蒙古東部、安徽北部也為最適宜區(qū)。河北安國為歷史悠久的的荊芥栽培基地[14]，所產(chǎn)“祁荊芥”質(zhì)量較高，河北為荊芥生長的最適宜種植區(qū)。山西、四川、云南、廣東為荊芥的次適宜生長區(qū)，西北部新疆、青海、西藏地區(qū)不適宜荊芥的種植。主要影響荊芥生長的5個生態(tài)因子為：土壤類型、最濕月降水量、季節(jié)降水量變異系數(shù)、土壤有效水含量等級、坡向。

根據(jù)我國土壤類型的劃分：東部主要為棕壤及紅壤，土壤肥力較大；西部為棕漠土，土壤肥力較小，北部為黑壤。結(jié)合荊芥生境適宜度研究，棕壤適宜荊芥的種植生長，而黑壤及棕漠土不適宜荊芥的種植。干旱是限制植物生長的主要因素，地區(qū)降水量的多少、土壤中含水量的大小與植物生長環(huán)境是否干旱有密切聯(lián)系，我國東部大多為沿海地區(qū)，且地勢較低，土壤含水量較高；西部地勢高且靠近內(nèi)陸，土壤含水量較低。結(jié)合荊芥生境適宜度研究，濕潤地區(qū)適宜荊芥的種植，干旱地區(qū)不適宜荊芥的種植。

3.2 荊芥及荊芥穗成分含量的差異

荊芥穗中總揮發(fā)油含量明顯高于荊芥，根據(jù)正交偏最小二乘判別分析，胡薄荷酮、薄荷酮及檸檬烯為荊芥及荊芥穗的差異化合物。對比3種主要化學成分的含量，結(jié)果顯示，荊芥穗中檸檬烯、胡薄荷酮、薄荷酮的含量均明顯高于荊芥。荊芥穗中β-石竹烯、氧化石竹烯、1-辛烯-3-醇、順-茉莉酮含量高于荊芥中同種成分的含量。綜上，揮發(fā)油得率結(jié)合成分含量分析，荊芥穗質(zhì)量優(yōu)于荊芥。

安徽、山東產(chǎn)荊芥揮發(fā)油含量高，檢出成分種類多，且各成分含量較高；西藏產(chǎn)荊芥揮發(fā)油含量低，檢出成分種類少。以揮發(fā)油得率結(jié)合成分分析為參考，認為安徽產(chǎn)荊芥質(zhì)量優(yōu)。河北安國產(chǎn)荊芥穗揮發(fā)油總含量較高，檢出成分種類多，各成分含量高；西藏產(chǎn)荊芥穗揮發(fā)油總量低，且檢出成分種類少。以揮發(fā)油得率結(jié)合成分分析為參考，認為河北安國產(chǎn)荊芥穗質(zhì)量優(yōu)，西藏日土產(chǎn)荊芥穗質(zhì)量較差。

3.3 荊芥生態(tài)適宜性區(qū)劃

生態(tài)適宜性區(qū)劃研究表明生態(tài)區(qū)的有機碳含量、最冷季平均溫、最冷月最低溫、最暖月最高溫對荊芥中揮發(fā)油含量的積累有顯著影響，且均為正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.752、0.604、0.584、0.712，土壤中有機碳含量對揮發(fā)油含量的影響最大。我國中部地區(qū)，包括河北南部、山東、安徽北部等地區(qū)最適宜荊芥揮發(fā)油含量的積累，青海、西藏地區(qū)不適宜荊芥揮發(fā)油含量的積累。

4 小結(jié)

我國幅員遼闊，地形復(fù)雜，氣候多樣，孕育了異常豐富的中藥資源[15]。荊芥作為臨床中廣泛應(yīng)用的藥材，在預(yù)防、治療、保健等方面有較高的需求量。由于需求量不斷增大，近5年荊芥價格呈平穩(wěn)上漲趨勢，荊芥穗價格持續(xù)高于荊芥，與其質(zhì)量優(yōu)于荊芥有關(guān)，且荊芥穗為人工采收，所需成本較高。荊芥穗價格波動較大，因荊芥為一年生草本，生長周期短，種植面積及氣候等因素對產(chǎn)量影響大，荊芥產(chǎn)量大，則直接加工為全荊芥，少有剪穗。全荊芥受庫存制約，價格平穩(wěn)，而荊芥穗價格受產(chǎn)量影響存在較大波動。

區(qū)劃的定義最早由地理學區(qū)域?qū)W派的奠基人、德國地理學家A.Hettner于18世紀末提出[16]，中藥區(qū)劃研究結(jié)果能因地制宜地指導(dǎo)中藥資源開發(fā)和生產(chǎn)[17]。荊芥產(chǎn)地多，種植廣，但各產(chǎn)區(qū)荊芥品質(zhì)存在差異，應(yīng)依據(jù)土壤、氣候等生態(tài)適宜性的研究結(jié)果，選取最適宜的產(chǎn)地種植高品質(zhì)荊芥。該文通過適宜性區(qū)劃研究表明河北南部、安徽、山東為荊芥種植的最適宜區(qū)，青海、西藏地區(qū)為不適宜區(qū)。揮發(fā)油測定結(jié)果顯示，安徽亳州、山東菏澤產(chǎn)荊芥質(zhì)量優(yōu)，河北安國產(chǎn)荊芥穗質(zhì)量優(yōu)，西藏日土產(chǎn)荊芥穗質(zhì)量差。目前，市場銷售的主流為河北產(chǎn)荊芥，河北荊芥產(chǎn)量占全國荊芥產(chǎn)量的90%以上，由于河北產(chǎn)區(qū)種植面積有限但需求量不斷加大，推斷存在荊芥產(chǎn)區(qū)增多、種植面積擴大的趨勢，根據(jù)研究結(jié)果，安徽、山東可作為產(chǎn)區(qū)，增大種植面積，以提供優(yōu)質(zhì)荊芥藥材。區(qū)劃研究與揮發(fā)油品質(zhì)研究結(jié)果一致，證明研究揮發(fā)油的測定能指導(dǎo)荊芥質(zhì)量標準的劃分，同時，生境適宜度的區(qū)劃研究可為荊芥的種植提供參考。