董學(xué)峰，楊亞龍

(泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校內(nèi)科教研室，福建 泉州 362000)

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，受遺傳及環(huán)境等多種因素的介導(dǎo)，由多基因參與調(diào)控，發(fā)病機(jī)制涉及多種炎性細(xì)胞、炎癥因子及細(xì)胞因子[1-2]。近年來，由于生活環(huán)境的變化，哮喘的發(fā)病率呈上升趨勢，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)在全球范圍內(nèi)有近3億哮喘患者，因此尋找治療哮喘的有效方法具有重要意義[3]。miRNA是真核生物內(nèi)源性具有調(diào)控功能的微小非編碼RNA，通過靶向mRNA的轉(zhuǎn)錄后沉默來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4]，miR-204-5p作為一種潛在的癌癥治療分子，多項(xiàng)研究[5-7]表明，其通過外泌體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)可調(diào)控抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。有研究[8]報(bào)道，miR-204-5p的過表達(dá)可抑制腫瘤轉(zhuǎn)換生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖和ECM的沉積，有效預(yù)防哮喘氣道重塑。TLR2為參與非特異性免疫的TLRs家族成員之一，其與TLR4可識(shí)別侵入的微生物病原體，促進(jìn)機(jī)體炎性細(xì)胞及炎癥因子的釋放，是哮喘易感性的主要影響因素[9]。本研究旨在通過探討miR-204-5p對哮喘小鼠的炎癥反應(yīng)和氣道重塑的影響及其可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 離心機(jī)(Multifuge X1/X1R Pro，賽默飛)、DNA擴(kuò)增儀(T100，BIORAD)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler 480，羅氏診斷)、激光共聚焦顯微鏡(Echo REVOLUTION，ECHO)、紫外分光光度計(jì)(U-3900/3900H，日立)酶標(biāo)儀(Multiskan FC，賽默飛)、灰度分析軟件(alphaEaseFC，Alpha Innotech)。miR-204-5p激動(dòng)劑(miR-204-5p agomir)，miR-204-5p拮抗劑(miR-204-5p antagomir)(貨號(hào)：miR40000237-4-5、miR30000237-4-5，廣州銳博)，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(貨號(hào)：AR1110，武漢博士德生物工程限公司)，TLR2/ toll樣受體2兔多克隆抗體、TGF-β 1/2兔多克隆抗體、NF-κB p65兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號(hào)：AF8181、AF0297、AF0246、A0208，上海碧云天)，Trizol、TaqManTMMicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq TM(貨號(hào)：RR036A、RR820A，TaKaRa)，小鼠白細(xì)胞介素4(IL-4)ELISA試劑盒、小鼠IL-5 ELISA試劑盒(貨號(hào)：PI612、PI620，上海碧云天)，小鼠IL-13 ELISA試劑盒(貨號(hào)：ml063123，上海酶聯(lián))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只7周齡的SPF級(jí)昆明白雄性小鼠，體重(24.6±3.4)g，購自洛陽普萬泰生物技術(shù)有限公司，室溫保持在(25±2) ℃，濕度保持(55±5)%，動(dòng)物自由飲食，保持12 h/d的晝夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用獲得本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 哮喘小鼠模型建立與分組 挑選10只作為對照組，其余30只小鼠于實(shí)驗(yàn)第1、3、5天腹腔注射200 μL致敏液[3 mg/mL OVA+ 5% Al(OH)3]，1次/d；于第6天開始以25 μL/10 g的劑量致敏液[6 mg/mL OVA+5% Al(OH)3]滴鼻激發(fā)引喘，1次/d，連續(xù)7 d，以激發(fā)時(shí)出現(xiàn)呼吸急促、腹肌抽動(dòng)及肢體呈團(tuán)等癥狀為哮喘模型成功[10]。建模成功后隨機(jī)分為哮喘組、表達(dá)上調(diào)組、表達(dá)下調(diào)組，每組各10只。表達(dá)上調(diào)組小鼠尾靜脈注射 30 mg/kg miR-204-5p agomir干預(yù)；表達(dá)下調(diào)組尾靜脈注射 30 mg/kg miR-204-5p antagomir干預(yù)。對照組及哮喘組小鼠以同種方式注射等量0.9%生理鹽水。干預(yù)結(jié)束后24 h頸椎脫臼法處死小鼠，剪開其頸部皮膚，于氣管正中處剪一小口，插入氣管套管。用磷酸鹽緩沖液對支氣管肺泡進(jìn)行灌洗，來回沖洗3次，收集小鼠肺泡灌洗液(BALF)[11]，并留取小鼠肺組織，放入液氮中速凍，-80 ℃保存。

1.2.2 HE染色觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變 切取適量的肺組織，固定于10%的磷酸鹽緩沖福爾馬林溶液，經(jīng)脫水、包埋后切片(切片厚度為5 μm)，行HE染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 RT-qPCR檢測肺組織中miR-204-5p及TLR2 mRNA水平 取各組小鼠新鮮肺組織50 mg，Trizol法提取組織中的總RNA，分光光度計(jì)測定RNA的濃度。依據(jù)試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系5 μL(5×Prime Script RT Master MiX 2 μL，RNase-free ddH2O 3 μL)，輕柔混勻后加入DNA擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min反轉(zhuǎn)錄，85 ℃ 5 s反轉(zhuǎn)錄酶失活后，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10 μL、PCR正反向引物(10 μM)各0.8 μL、 ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、cDNA 2 μL、滅菌蒸餾水6 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s循環(huán)40次，95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s 融解，50 ℃ 30 s降溫。以相對對量2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以U6為內(nèi)參對miR-204-5p定量，以β-actin為內(nèi)參對TLR2定量。miR-204-5p F：5′-AAC ACG CTT CCC TTT GTC ATC C-3′，R：5′-GCC UAU CCU ACU GUU UCC CUU-3′，擴(kuò)增片段大小256 bp。U6 F：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，R：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′，擴(kuò)增片段大小287 bp。TLR2 F：5′-AGA ATC AAT ACA ATA GAG GGA GAC-3′，R：5′-TCG ACT TTA GAC TTT GGG AC-3′，擴(kuò)增片段大小354 bp。β-actin F：5′-ATG GAT GAC GAT ATC GCT G-3′，R：5′-ATG AGG TAG TCT GTC AGG-3′，擴(kuò)增片段大小382 bp。

1.2.4 Western blot檢測TLR2、TGF-β1及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 分別取各組小鼠的新鮮肺組織100 mg，4 ℃ PBS浸洗5 min，2 000 rpm離心10 min，去上清后加入200 μL RIPA 細(xì)胞裂解液與2 μL蛋白酶抑制劑混勻，4 ℃ 2 000 rpm離心10 min，收集總蛋白懸液。BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒所取組織中各蛋白的表達(dá)濃度。取蛋白溶液每孔上樣50 μL，行SDS-PAGE電泳(12%或15%)，電泳儀分別按 80 V 20 min，120 V 60 min操作，至溴酚藍(lán)剛達(dá)膠底部立刻關(guān)閉電泳儀。PVDF膜置于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡后轉(zhuǎn)膜，裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、PVDF膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板。接通電源，根據(jù)蛋白量大小，決定轉(zhuǎn)膜需要的電壓和時(shí)間。轉(zhuǎn)移結(jié)束后取出PVDF膜，割取待測膜條做免疫印跡：將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50 s后，50%甲醇脫色至背景清晰，PBS反復(fù)洗膜3次，10%脫脂奶粉的PBST封閉液室溫封閉1 h，棄封閉液，以5%脫脂奶粉的PBS配制的一抗(TLR2：1∶1 000、TGF-β1：1∶2 000、NF-κB p65：1∶2 000)，4 ℃孵育過夜?；厥找豢?，加入辣根標(biāo)記二抗(1∶1 000)室溫慢搖下孵育1 h，棄二抗，PBST清洗條帶15 min。以β-actin為內(nèi)參，采取ECL發(fā)光試劑盒顯影成像，然后使用Image J 軟件分析各蛋白的相對表達(dá)。

1.2.5 ELISA法檢測各組小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子濃度 在EP管中加入1 mL BALF，1 000 rpm離心10 min，取上清。采用ELISA試劑盒檢測各細(xì)胞因子濃度：分別取100 μL稀釋樣品與不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)孔，封板膜封孔，室溫孵育2 h，洗板5次并吸干水分后加入生物素化抗體100 μL/孔，封板膜封孔，室溫孵育1 h，洗板5次并吸干水分后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記100 μL/孔，封板膜封孔，室溫避光孵育20 min，洗板5次并吸干水分后加入顯色劑TMB溶液100 μL/孔，封板膜封孔，室溫避光孵育20 min，加入終止液50 μL/孔，混勻后立即測量A450值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般行為特征

對照組小鼠飲食及行為正常，呼吸節(jié)律平穩(wěn)，無異常癥狀；哮喘模型小鼠出現(xiàn)呼吸急促、腹肌抽動(dòng)及肢體呈團(tuán)；miR-204-5p表達(dá)干預(yù)后，表達(dá)上調(diào)組小鼠呼吸急促、腹肌抽動(dòng)現(xiàn)象減輕，表達(dá)下調(diào)組小鼠呼吸急促、腹肌抽動(dòng)等現(xiàn)象加重，出現(xiàn)點(diǎn)頭呼吸現(xiàn)象。

2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變

對照組小鼠肺組織及支氣管結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)輪廓清晰，哮喘組、表達(dá)下調(diào)組小鼠氣道壁嚴(yán)重增厚，細(xì)胞排列雜亂且疏松；表達(dá)上調(diào)組小鼠氣道壁增厚情況明顯減輕，細(xì)胞排列較為整齊，結(jié)構(gòu)較為清晰。見圖1。

2.3 各組小鼠肺組織中miR-204-5p及TLR2mRNA水平

與對照組相比，哮喘組小鼠的miR-204-5pmRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)，TLR2 mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05)；與哮喘組相比，表達(dá)上調(diào)組miR-204-5p mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05)，TLR2 mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)；表達(dá)下調(diào)組miR-204-5p mRNA表達(dá)水平下降(P<0.05)，TLR2 mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺組織中miR-204-5p及TLR2 mRNA水平

2.4 各組小鼠TLR2、TGF-β1及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平

與對照組相比，各組小鼠TLR2、TGF-β1及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均上升(P<0.05)；與哮喘組相比，表達(dá)上調(diào)組TLR2、TGF-β1及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，表達(dá)下調(diào)組TLR2、TGF-β1及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)。見圖2。

2.5 各組小鼠肺組織IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞炎癥因子濃度

與對照組相比，各組小鼠的IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子濃度均上升(P<0.05)；與哮喘組相比，表達(dá)上調(diào)組IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子濃度下降(P<0.05)，表達(dá)下調(diào)組IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子濃度上升(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠肺組織IL-4、IL-5、IL-13細(xì)胞炎癥因子濃度

3 討論

哮喘是常見的呼吸系統(tǒng)慢性氣道疾病，主要表現(xiàn)為氣道表皮細(xì)胞組織得損傷及脫落，且氣道表皮細(xì)胞及組織損傷越嚴(yán)重，氣道得高反應(yīng)會(huì)越明顯；主要發(fā)病原因之一為氣道重塑，氣道平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生在氣道重塑過程中具有重要作用[12]。miRNA是真核生物內(nèi)源性具有調(diào)控功能的微小非編碼RNA，研究[13]發(fā)現(xiàn)，在哮喘的發(fā)病機(jī)制中有多種miRNA參與調(diào)控。相關(guān)研究[8]報(bào)道，miR-204-5p可通過調(diào)節(jié)Six1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，作為預(yù)防哮喘氣道重塑的潛在治療靶點(diǎn)。

本研究通過探討miR-204-5p對哮喘小鼠的炎癥反應(yīng)和氣道重塑的影響，并對其潛在的分子機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，miR-204-5p的上調(diào)會(huì)抑制TLR2的表達(dá)，且與哮喘組相比，miR-204-5p表達(dá)上調(diào)組TGF-β1及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，miR-204-5p表達(dá)下調(diào)組TGF-β1及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)。氣道平滑肌細(xì)胞增生會(huì)直接導(dǎo)致氣道壁增厚，從而影響氣道反應(yīng)性，使氣流受限。TGF-β1具有強(qiáng)烈的促纖維化作用，可刺激氣道平滑肌細(xì)胞增殖，促使氣道重塑。作為啟動(dòng)及維持氣道重塑的潛在關(guān)鍵因子，TGF-β1通過參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、成纖維細(xì)胞分化等氣道重塑的相關(guān)途徑，并通過激活多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而影響細(xì)胞周期，最終導(dǎo)致氣道重塑的發(fā)生[14]。有研究[15]表明，TGF-β1可通過增強(qiáng)氣道平滑肌細(xì)胞之間的興奮-收縮偶聯(lián)機(jī)制從而上調(diào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad3和TGF-βRⅡ的表達(dá)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖。而NF-κB為多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的樞紐，在調(diào)控哮喘氣道重塑過程中同樣具有重要作用，其活性的增強(qiáng)與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)，可通過調(diào)控細(xì)胞炎癥因子、生長因子、VCAM-1、ICAM-1及MMP等參與哮喘發(fā)病機(jī)制的多個(gè)環(huán)節(jié)。另研究[16]表明，TLR2/MyD88/NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平可有效影響機(jī)體的炎癥反應(yīng)，可參與氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生及發(fā)展。TLR2為參與非特異性免疫的TLRs家族成員之一，是哮喘易感性的主要決定因素，多項(xiàng)研究均表明TLR2可通過介導(dǎo)下游的NF-κB通路和JNK信號(hào)分子參與過敏性氣道炎癥及支氣管哮喘[17]。在本研究中，miR-204-5p的上調(diào)與TLR2的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，且miR-204-5p表達(dá)上調(diào)組TGF-β1及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均下降(P<0.05)，miR-204-5p表達(dá)下調(diào)組TGF-β1及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均上升(P<0.05)。因此推測miR-204-5p可通過調(diào)控TLR2抑制TGF-β1及NF-κB p65的表達(dá)，有效抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。

在過敏性氣道炎癥及支氣管哮喘發(fā)生過程中，TLR2被激活與連接蛋白髓樣分化蛋白的結(jié)合，從而激活下游的信號(hào)傳遞通路，啟動(dòng)細(xì)胞合成及釋放炎性因子[18]，且NF-κB為一種多效轉(zhuǎn)錄因子，可對哮喘氣道炎癥過程中相關(guān)細(xì)胞炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控[19]。本研究結(jié)果顯示，表達(dá)上調(diào)組IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子濃度下降(P<0.05)，表達(dá)下調(diào)組IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子濃度上升(P<0.05)。IL-13、IL-4、IL-5為Th2型細(xì)胞炎癥因子，Th1及Th2趨化因子的表達(dá)水平變化同哮喘患者機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)關(guān)系密切。在哮喘發(fā)病過程中，氣道平滑肌處于活躍狀態(tài)，平滑肌細(xì)胞過度增殖，合成分泌多種因子。在該過程中IL-4、IL-5等細(xì)胞炎癥因子可通過ERK1/2通路與細(xì)胞外基質(zhì)與氣道平滑肌細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合，促使氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，同時(shí)上調(diào)TGF-β1的水平，誘導(dǎo)纖維化的發(fā)生，并且導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[2,20]。因此推測哮喘氣道炎癥的發(fā)生機(jī)制可能為miR-204-5p通過調(diào)控TLR2從而抑制Th2型細(xì)胞的活化及NF-κB的活性，減少IL-13、IL-4、IL-5等炎癥因子的釋放[20]。

綜上所述，miR-204-5p可能通過調(diào)節(jié)TLR2的表達(dá)抑制哮喘小鼠由TGF-β1及NF-κB p65誘導(dǎo)的氣道重塑，有效減輕小鼠的炎癥反應(yīng)，可作為預(yù)防哮喘氣道重塑的潛在治療靶點(diǎn)。