河北中醫(yī)學(xué)院/河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
張彐寧 靳曉飛 張 怡 周曉紅 高維娟(石家莊 050091)
提要 目的:研究黃芪中毛蕊異黃酮不同劑量對腦缺血再灌注(CIR)大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響,為臨床治療提供用藥依據(jù)。方法:將SPF級雄性SD大鼠50只,隨機(jī)分為:假手術(shù)組、模型組、毛蕊異黃酮低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)。采用改良線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞模型,在體模擬CIR損傷環(huán)境。利用神經(jīng)功能學(xué)評分(Zea Longa)法初步觀察CIR損傷后大鼠神經(jīng)功能表現(xiàn);鹽酸2,3,5-三苯基四氮(TTC)染色檢測腦梗死體積;尼氏染色觀察尼氏體變化;蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達(dá)。結(jié)果:與假手術(shù)組對比,模型組神經(jīng)功能缺損癥狀明顯(P<0.05),腦梗死體積明顯增大(P<0.05),尼氏體明顯減少(P<0.05),凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)明顯增加(P<0.05),與模型組對比,給予不同劑量毛蕊異黃酮處理后,可見大鼠神經(jīng)功能障礙明顯改善,腦梗死體積明顯減少(P<0.05);尼氏體明顯增多(P<0.05);凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)明顯降低(P<0.05);并且在以上檢測指標(biāo)中,以毛蕊異黃酮高劑量組更為顯著。結(jié)論:黃芪中的毛蕊異黃酮可改善CIR損傷大鼠神經(jīng)功能障礙,減小腦梗死體積,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,而毛蕊異黃酮高劑量組作用更為突出。
腦缺血再灌注(CIR)損傷是指腦缺血一定時間恢復(fù)血液供應(yīng)后,其功能不但未能恢復(fù),卻出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的局部腦組織及其功能受損[1]。CIR損傷是缺血性腦卒中的重要并發(fā)癥。如何有效減輕再灌注造成的傷害,成為臨床和科研領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。近年來隨著醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展,人們對CIR損傷的發(fā)生機(jī)制不斷深入探索,并且在CIR損傷的治療過程中愈加重視中醫(yī)中藥的防治作用。補(bǔ)陽還五湯是益氣活血法的代表方,又是治療缺血性腦卒中的常用方,此方證以氣虛為本,血瘀為標(biāo),治以補(bǔ)氣為主,活血通絡(luò)為輔,方中重用生黃芪為君藥,補(bǔ)益元?dú)?,意在氣旺則血行,瘀去絡(luò)通,在治療氣虛血瘀型中風(fēng)中收到顯著療效[2]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),黃芪主要活性成分包括黃芪黃酮、黃芪多糖、黃芪皂苷三大類,毛蕊異黃酮作為黃芪黃酮類主要活性成分,具有清除氧自由基、抗炎、抗病毒等作用[3]。本課題組前期在細(xì)胞水平觀察了毛蕊異黃酮對氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞(PC12細(xì)胞系是來源于成年大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞系)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮可顯著提高PC12細(xì)胞活性,減輕PC12細(xì)胞損傷,發(fā)揮保護(hù)作用[4]。本研究意在動物水平探討毛蕊異黃酮是否具有減輕大鼠CIR注損傷的作用。
1.1 動物 SD大鼠,SPF級,5周齡,50只,雄性,體質(zhì)量260~280 g,購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0011。
1.2 試劑 毛蕊異黃酮購自上海士峰生物科技有限公司,純度≥98%,批號:18060411;線栓法大鼠腦缺血再灌注模型(MCAO)栓線(250~280 g)購自北京西濃科技有限公司(批號:2636-A3);鹽酸2,3,5-三苯基四氮(TTC)染液(批號:T8877)購自美國Sigma公司;半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)單克隆抗體(批號:9662S)購自美國CST公司;BCA 蛋白測定試劑盒(批號:PC0020)購自北京索萊寶科技有限公司;甲苯胺藍(lán)染液(批號:20170227)購自北京索萊寶科技有限公司。
1.3 儀器 多功能成像系統(tǒng)購自Vilber公司;LI-360型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;Axio Observer 7型全自動倒置熒光顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司;EG1150H型組織包埋機(jī)、RM2255型切片機(jī)購自德國Leica公司。
2.1 實(shí)驗(yàn)分組與模型制備 SD大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、毛蕊異黃酮低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)。采用改良線栓法建立CIR損傷模型:SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,術(shù)前禁食6~8 h,麻醉大鼠采用腹腔注射4%的戊巴比妥鈉,使大鼠呈仰臥位固定于動物手術(shù)臺上,常規(guī)頸部備皮消毒,頸部正中切口,玻璃分針鈍性分離、暴露頸總、頸內(nèi)、頸外動脈,結(jié)扎并離斷頸外動脈,使線栓由頸外經(jīng)頸總動脈插入到頸內(nèi)動脈約(18±1)mm處,阻塞大腦中動脈2 h,即缺血2 h,之后緩慢拔出線栓,使頸內(nèi)動脈和大腦中動脈恢復(fù)血流,即再灌注開始,再灌注24 h后,根據(jù)神經(jīng)功能學(xué)評分(Zea Longa)標(biāo)準(zhǔn):在術(shù)后24 h及術(shù)后蘇醒后進(jìn)行觀察評分,0分,無神經(jīng)系統(tǒng)缺損癥狀;1 分,不能完全伸展病灶對側(cè)前爪;2分,行走向病灶對側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,行走困難,向病灶對側(cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識喪失;5分,大鼠死亡。0分、4分和5分者剔除,1分、2分、3分者為造模成功,列為實(shí)驗(yàn)對象。假手術(shù)組線栓只插入到頸內(nèi)動脈,而不進(jìn)入大腦中動脈。給藥組在再灌注的同時給予腹腔注射不同劑量(5、10、20 mg/kg)的毛蕊異黃酮處理,腹腔注射給藥體積為8 mL/kg,假手術(shù)組和模型組等體積腹腔注射生理鹽水。
2.2 TTC染色檢測各組大鼠腦梗死體積 各組大鼠造模給藥完成后,斷頭取材,將完整腦組織放入腦槽內(nèi)置于-20 ℃冰箱,冷凍18 min,做冠狀位切片,每片腦組織厚度約2 mm,置于2% TTC染液中,放入37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min,15 min時翻動1次,取出腦切片,按順序依次擺放,拍照后,采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖片并計(jì)算腦梗死體積百分比(%)。
2.3 尼氏染色檢測各組大鼠尼氏體平均吸光度值 各組大鼠斷頭取材,做厚度約4 mm冠狀切片,進(jìn)行組織固定、包埋,切片脫蠟至水,加入1%甲苯胺藍(lán)置于55~60 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min,蒸餾水沖洗,鹽酸酒精分化,無水乙醇脫水,二甲苯中透明5 min,中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察并拍照,Image-Pro Plus 6.0 軟件分析并計(jì)算尼氏體平均吸光度值。
2.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組大鼠Caspase-3蛋白表達(dá) 各組大鼠造模給藥處理后,斷頭取材,每組大鼠選取右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)腦組織50 mg,進(jìn)行組織研磨裂解,提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,將蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,利用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入Caspase-3抗體4 ℃過夜,等滲緩沖鹽溶液(TBST)清洗3次,室溫孵育相應(yīng)二抗1 h,TBST洗去二抗,將PVDF膜置于配制好的ECL化學(xué)發(fā)光液內(nèi),凝膠成像系統(tǒng)掃描成像,采用Image J軟件分析,計(jì)算目的條帶/對應(yīng)內(nèi)參的相對表達(dá)水平。
3.1 Zea Longa法檢測各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分結(jié)果 假手術(shù)組無神經(jīng)系統(tǒng)缺損癥狀,評分為0;與假手術(shù)組相比,模型組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷(P<0.05);與模型組相比,毛蕊異黃酮中、高劑量組神經(jīng)功能損傷癥狀明顯減輕(P<0.05),其中高劑量組最為顯著。詳見表1。
表1 Zea Longa法檢測各組大鼠神經(jīng) 功能學(xué)評分結(jié)果
3.2 各組大鼠腦梗死體積的變化 TTC染色結(jié)果顯示:假手術(shù)組腦梗死體積為0,未見梗死灶,其它各組均有不同程度的腦梗死灶形成。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠可見明顯的梗死灶,TTC染色白色缺血區(qū)明顯,有明顯的梗死灶形成(P<0.05);與模型組相比,毛蕊異黃酮中、高劑量組腦梗死體積均有所減小,其中高劑量組最為顯著(P<0.05)。見圖1、表2。
注:A,假手術(shù)組;B,模型組;C,毛蕊異黃酮低劑量組;D,毛蕊異黃酮中劑量組;E,毛蕊異黃酮高劑量組。圖1 TTC染色結(jié)果
表1 TTC染色檢測各組大鼠腦梗死體積結(jié)果
3.3 各組大鼠尼氏體的變化 尼氏染色顯示:假手術(shù)組尼氏體豐富,細(xì)胞排列整齊,并且細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,輪廓清晰,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多。與假手術(shù)組相比,模型組細(xì)胞數(shù)量較少,細(xì)胞皺縮,輪廓模糊不清,尼氏體明顯減少,并且平均吸光度值明顯降低 (P<0.05) 。與模型組相比,毛蕊異黃酮中、高劑量組細(xì)胞狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn),尼氏體增多,尼氏體平均吸光度值明顯增加,并且毛蕊異黃酮高劑量組更為顯著(P<0.05)。見圖2、表3。
注:A,假手術(shù)組;B,模型組;C,毛蕊異黃酮低劑量組;D,毛蕊異黃酮中劑量組;E,毛蕊異黃酮高劑量組。圖2 尼氏染色結(jié)果
表3 尼氏染色檢測各組大鼠尼氏體平均吸光度值結(jié)果
3.4 各組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達(dá)的變化 Western blot檢測結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比,模型組凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,毛蕊異黃酮中、高劑量組Caspase-3的表達(dá)明顯降低,且以毛蕊異黃酮高劑量組更為顯著(P<0.05)。見圖3、表4。
圖3 Western blot檢測結(jié)果
表4 Western blot檢測各組大鼠Caspase-3相對表達(dá)量結(jié)果
注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與低劑量組比較,△P<0.05。
腦缺血再灌注(CIR)損傷可造成腦功能嚴(yán)重受損,當(dāng)腦組織由缺血低灌注轉(zhuǎn)變?yōu)樵俟嘧r,腦細(xì)胞生物電發(fā)生改變,產(chǎn)生病理性慢波,伴隨著缺血再灌注的發(fā)生,病理性慢波持續(xù)并加重,出現(xiàn)一系列病理生理改變[5]。主要涉及的病理生理機(jī)制包括:炎癥反應(yīng)、鈣離子超載、自由基過量生成、興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞凋亡與自噬等[6-9]。細(xì)胞凋亡在CIR病理進(jìn)程中扮演了重要角色,隨著缺血再灌注損傷時間越長,腦組織超微結(jié)構(gòu)開始發(fā)生明顯改變:線粒體腫脹,鈣離子沉積,線粒體嵴斷裂、胞核固縮、染色質(zhì)凝集或邊緣化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度腫脹、尼氏體完整性破壞或消失、細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯破壞,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10]。CIR引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡方式主要以細(xì)胞凋亡為主,發(fā)生的部位主要在缺血病灶中心區(qū)周圍的半暗帶區(qū)域,而缺血半暗帶區(qū)常作為臨床上治療CIR損傷的治療基礎(chǔ)。因此,有效抑制細(xì)胞凋亡對于減輕CIR損傷具有重要意義。
細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指生物體為維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由嚴(yán)格基因調(diào)控的細(xì)胞自主性有序死亡過程。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號刺激后,凋亡調(diào)控分子間相互作用,產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生化反應(yīng),誘導(dǎo)蛋白水解酶(caspase)活化,從而裂解關(guān)鍵的細(xì)胞基質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[11]。在此過程中,Bcl-2蛋白(B淋巴細(xì)胞瘤-2基因)家族的促凋亡蛋白Bax(Bcl-2-associated X蛋白質(zhì))發(fā)生寡聚化并向線粒體外膜聚集,從而改變線粒體膜通透性,使細(xì)胞色素c等促凋亡分子由線粒體膜間隙釋放入細(xì)胞質(zhì),激活內(nèi)在的凋亡級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致Caspase-3激活,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。Caspase-3蛋白在細(xì)胞凋亡程序中是最主要的終末剪切酶,在包括神經(jīng)元在內(nèi)的許多細(xì)胞類型中充當(dāng)?shù)蛲龅膱?zhí)行者[13],抑制Caspase-3活化,可阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14],在細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究中常作為重要參考指標(biāo)。
中藥黃芪是臨床常用補(bǔ)氣要藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有補(bǔ)氣活血化瘀之功效。中醫(yī)理論中氣與血之間有著緊密的聯(lián)系,“氣為血之帥”“血為氣之母”“氣能生血”“氣能行血”“氣行則血行”等理論更是闡述了氣血之間的具體關(guān)系,在缺血性腦中風(fēng)的治療過程中,常以黃芪配伍成方,治療中風(fēng)之氣虛血瘀證。補(bǔ)陽還五湯即為治療氣虛血瘀型中風(fēng)的代表方劑,在臨床上應(yīng)用至今,并取得顯著療效[15-16]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),黃芪的主要活性成分包括黃酮、皂苷、多糖三大類成分[17],在調(diào)控自噬、抗炎、抗氧化、促進(jìn)干細(xì)胞增值、調(diào)節(jié)血壓、改善認(rèn)知功能障礙等方面均發(fā)揮著重要作用。其中,黃芪黃酮類成分更是受到越來越多的關(guān)注,毛蕊異黃酮是黃酮類的主要活性成分之一,亦是檢測黃芪質(zhì)量的重要參考指標(biāo),在抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞增殖、延緩衰老、抗炎、抗心肌肥厚等方面均有應(yīng)用,本課題組前期利用PC12細(xì)胞,在細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn),毛蕊異黃酮具有抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞凋亡的作用[18],但其在動物水平是否同樣具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕CIR損傷作用,亟需探索。
因此,本研究通過建立大腦中動脈閉塞模型,模擬CIR損傷環(huán)境,在動物水平,觀察了不同劑量毛蕊異黃酮對CIR大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用,并初步探討了毛蕊異黃酮拮抗CIR損傷的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 模型組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀明顯,腦梗死體積明顯增大,尼氏體明顯減少,凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)明顯增多。當(dāng)給予毛蕊異黃酮處理后,CIR大鼠神經(jīng)功能障礙明顯改善,腦梗死體積明顯減少,尼氏體染色加深明顯增多,凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3表達(dá)明顯降低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:毛蕊異黃酮可減輕CIR損傷,其分子機(jī)制與毛蕊異黃酮調(diào)控凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3表達(dá)密切相關(guān)。