河北中醫(yī)學(xué)院/河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

張彐寧 靳曉飛 張 怡 周曉紅 高維娟(石家莊 050091)

提要 目的：研究黃芪中毛蕊異黃酮不同劑量對腦缺血再灌注(CIR)大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響，為臨床治療提供用藥依據(jù)。方法：將SPF級雄性SD大鼠50只，隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、毛蕊異黃酮低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)。采用改良線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞模型，在體模擬CIR損傷環(huán)境。利用神經(jīng)功能學(xué)評分(Zea Longa)法初步觀察CIR損傷后大鼠神經(jīng)功能表現(xiàn)；鹽酸2,3,5-三苯基四氮(TTC)染色檢測腦梗死體積；尼氏染色觀察尼氏體變化；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組對比，模型組神經(jīng)功能缺損癥狀明顯(P<0.05)，腦梗死體積明顯增大(P<0.05)，尼氏體明顯減少(P<0.05)，凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)明顯增加(P<0.05)，與模型組對比，給予不同劑量毛蕊異黃酮處理后，可見大鼠神經(jīng)功能障礙明顯改善，腦梗死體積明顯減少(P<0.05)；尼氏體明顯增多(P<0.05)；凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)明顯降低(P<0.05)；并且在以上檢測指標(biāo)中，以毛蕊異黃酮高劑量組更為顯著。結(jié)論：黃芪中的毛蕊異黃酮可改善CIR損傷大鼠神經(jīng)功能障礙，減小腦梗死體積，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而毛蕊異黃酮高劑量組作用更為突出。

腦缺血再灌注(CIR)損傷是指腦缺血一定時間恢復(fù)血液供應(yīng)后，其功能不但未能恢復(fù)，卻出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的局部腦組織及其功能受損[1]。CIR損傷是缺血性腦卒中的重要并發(fā)癥。如何有效減輕再灌注造成的傷害，成為臨床和科研領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。近年來隨著醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，人們對CIR損傷的發(fā)生機(jī)制不斷深入探索，并且在CIR損傷的治療過程中愈加重視中醫(yī)中藥的防治作用。補(bǔ)陽還五湯是益氣活血法的代表方，又是治療缺血性腦卒中的常用方，此方證以氣虛為本，血瘀為標(biāo)，治以補(bǔ)氣為主，活血通絡(luò)為輔，方中重用生黃芪為君藥，補(bǔ)益元?dú)?，意在氣旺則血行，瘀去絡(luò)通，在治療氣虛血瘀型中風(fēng)中收到顯著療效[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，黃芪主要活性成分包括黃芪黃酮、黃芪多糖、黃芪皂苷三大類，毛蕊異黃酮作為黃芪黃酮類主要活性成分，具有清除氧自由基、抗炎、抗病毒等作用[3]。本課題組前期在細(xì)胞水平觀察了毛蕊異黃酮對氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞(PC12細(xì)胞系是來源于成年大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞系)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮可顯著提高PC12細(xì)胞活性，減輕PC12細(xì)胞損傷，發(fā)揮保護(hù)作用[4]。本研究意在動物水平探討毛蕊異黃酮是否具有減輕大鼠CIR注損傷的作用。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠，SPF級，5周齡，50只，雄性，體質(zhì)量260～280 g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.2 試劑 毛蕊異黃酮購自上海士峰生物科技有限公司，純度≥98%，批號：18060411；線栓法大鼠腦缺血再灌注模型(MCAO)栓線(250～280 g)購自北京西濃科技有限公司(批號：2636-A3)；鹽酸2，3，5-三苯基四氮(TTC)染液(批號：T8877)購自美國Sigma公司；半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)單克隆抗體(批號：9662S)購自美國CST公司；BCA 蛋白測定試劑盒(批號：PC0020)購自北京索萊寶科技有限公司；甲苯胺藍(lán)染液(批號：20170227)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器 多功能成像系統(tǒng)購自Vilber公司；LI-360型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；Axio Observer 7型全自動倒置熒光顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司；EG1150H型組織包埋機(jī)、RM2255型切片機(jī)購自德國Leica公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組與模型制備 SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、毛蕊異黃酮低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)。采用改良線栓法建立CIR損傷模型：SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，術(shù)前禁食6～8 h，麻醉大鼠采用腹腔注射4%的戊巴比妥鈉，使大鼠呈仰臥位固定于動物手術(shù)臺上，常規(guī)頸部備皮消毒，頸部正中切口，玻璃分針鈍性分離、暴露頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，結(jié)扎并離斷頸外動脈，使線栓由頸外經(jīng)頸總動脈插入到頸內(nèi)動脈約(18±1)mm處，阻塞大腦中動脈2 h，即缺血2 h，之后緩慢拔出線栓，使頸內(nèi)動脈和大腦中動脈恢復(fù)血流，即再灌注開始，再灌注24 h后，根據(jù)神經(jīng)功能學(xué)評分(Zea Longa)標(biāo)準(zhǔn)：在術(shù)后24 h及術(shù)后蘇醒后進(jìn)行觀察評分，0分，無神經(jīng)系統(tǒng)缺損癥狀；1 分，不能完全伸展病灶對側(cè)前爪；2分，行走向病灶對側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走困難，向病灶對側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失；5分，大鼠死亡。0分、4分和5分者剔除，1分、2分、3分者為造模成功，列為實(shí)驗(yàn)對象。假手術(shù)組線栓只插入到頸內(nèi)動脈，而不進(jìn)入大腦中動脈。給藥組在再灌注的同時給予腹腔注射不同劑量(5、10、20 mg/kg)的毛蕊異黃酮處理，腹腔注射給藥體積為8 mL/kg，假手術(shù)組和模型組等體積腹腔注射生理鹽水。

2.2 TTC染色檢測各組大鼠腦梗死體積 各組大鼠造模給藥完成后，斷頭取材，將完整腦組織放入腦槽內(nèi)置于-20 ℃冰箱，冷凍18 min，做冠狀位切片，每片腦組織厚度約2 mm，置于2% TTC染液中，放入37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min，15 min時翻動1次，取出腦切片，按順序依次擺放，拍照后，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖片并計(jì)算腦梗死體積百分比(%)。

2.3 尼氏染色檢測各組大鼠尼氏體平均吸光度值 各組大鼠斷頭取材，做厚度約4 mm冠狀切片，進(jìn)行組織固定、包埋，切片脫蠟至水，加入1%甲苯胺藍(lán)置于55～60 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min，蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分化，無水乙醇脫水，二甲苯中透明5 min，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察并拍照，Image-Pro Plus 6.0 軟件分析并計(jì)算尼氏體平均吸光度值。

2.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組大鼠Caspase-3蛋白表達(dá) 各組大鼠造模給藥處理后，斷頭取材，每組大鼠選取右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)腦組織50 mg，進(jìn)行組織研磨裂解，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，利用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Caspase-3抗體4 ℃過夜，等滲緩沖鹽溶液(TBST)清洗3次，室溫孵育相應(yīng)二抗1 h，TBST洗去二抗，將PVDF膜置于配制好的ECL化學(xué)發(fā)光液內(nèi)，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像，采用Image J軟件分析，計(jì)算目的條帶/對應(yīng)內(nèi)參的相對表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 Zea Longa法檢測各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)評分結(jié)果 假手術(shù)組無神經(jīng)系統(tǒng)缺損癥狀，評分為0；與假手術(shù)組相比，模型組出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷(P<0.05)；與模型組相比，毛蕊異黃酮中、高劑量組神經(jīng)功能損傷癥狀明顯減輕(P<0.05)，其中高劑量組最為顯著。詳見表1。

表1 Zea Longa法檢測各組大鼠神經(jīng) 功能學(xué)評分結(jié)果

3.2 各組大鼠腦梗死體積的變化 TTC染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組腦梗死體積為0，未見梗死灶，其它各組均有不同程度的腦梗死灶形成。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠可見明顯的梗死灶，TTC染色白色缺血區(qū)明顯，有明顯的梗死灶形成(P<0.05)；與模型組相比，毛蕊異黃酮中、高劑量組腦梗死體積均有所減小，其中高劑量組最為顯著(P<0.05)。見圖1、表2。

注：A，假手術(shù)組；B，模型組；C，毛蕊異黃酮低劑量組；D，毛蕊異黃酮中劑量組；E，毛蕊異黃酮高劑量組。圖1 TTC染色結(jié)果

表1 TTC染色檢測各組大鼠腦梗死體積結(jié)果

3.3 各組大鼠尼氏體的變化 尼氏染色顯示：假手術(shù)組尼氏體豐富，細(xì)胞排列整齊，并且細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多。與假手術(shù)組相比，模型組細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞皺縮，輪廓模糊不清，尼氏體明顯減少，并且平均吸光度值明顯降低 (P<0.05) 。與模型組相比，毛蕊異黃酮中、高劑量組細(xì)胞狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，尼氏體增多，尼氏體平均吸光度值明顯增加，并且毛蕊異黃酮高劑量組更為顯著(P<0.05)。見圖2、表3。

注：A，假手術(shù)組；B，模型組；C，毛蕊異黃酮低劑量組；D，毛蕊異黃酮中劑量組；E，毛蕊異黃酮高劑量組。圖2 尼氏染色結(jié)果

表3 尼氏染色檢測各組大鼠尼氏體平均吸光度值結(jié)果

3.4 各組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達(dá)的變化 Western blot檢測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，模型組凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，毛蕊異黃酮中、高劑量組Caspase-3的表達(dá)明顯降低，且以毛蕊異黃酮高劑量組更為顯著(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 Western blot檢測結(jié)果

表4 Western blot檢測各組大鼠Caspase-3相對表達(dá)量結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05;與低劑量組比較，△P<0.05。

4 討論

腦缺血再灌注(CIR)損傷可造成腦功能嚴(yán)重受損，當(dāng)腦組織由缺血低灌注轉(zhuǎn)變?yōu)樵俟嘧r，腦細(xì)胞生物電發(fā)生改變，產(chǎn)生病理性慢波，伴隨著缺血再灌注的發(fā)生，病理性慢波持續(xù)并加重，出現(xiàn)一系列病理生理改變[5]。主要涉及的病理生理機(jī)制包括：炎癥反應(yīng)、鈣離子超載、自由基過量生成、興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞凋亡與自噬等[6-9]。細(xì)胞凋亡在CIR病理進(jìn)程中扮演了重要角色，隨著缺血再灌注損傷時間越長，腦組織超微結(jié)構(gòu)開始發(fā)生明顯改變：線粒體腫脹，鈣離子沉積，線粒體嵴斷裂、胞核固縮、染色質(zhì)凝集或邊緣化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度腫脹、尼氏體完整性破壞或消失、細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯破壞，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10]。CIR引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡方式主要以細(xì)胞凋亡為主，發(fā)生的部位主要在缺血病灶中心區(qū)周圍的半暗帶區(qū)域，而缺血半暗帶區(qū)常作為臨床上治療CIR損傷的治療基礎(chǔ)。因此，有效抑制細(xì)胞凋亡對于減輕CIR損傷具有重要意義。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指生物體為維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由嚴(yán)格基因調(diào)控的細(xì)胞自主性有序死亡過程。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號刺激后，凋亡調(diào)控分子間相互作用，產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，誘導(dǎo)蛋白水解酶(caspase)活化，從而裂解關(guān)鍵的細(xì)胞基質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡[11]。在此過程中，Bcl-2蛋白(B淋巴細(xì)胞瘤-2基因)家族的促凋亡蛋白Bax(Bcl-2-associated X蛋白質(zhì))發(fā)生寡聚化并向線粒體外膜聚集，從而改變線粒體膜通透性，使細(xì)胞色素c等促凋亡分子由線粒體膜間隙釋放入細(xì)胞質(zhì)，激活內(nèi)在的凋亡級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致Caspase-3激活，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。Caspase-3蛋白在細(xì)胞凋亡程序中是最主要的終末剪切酶，在包括神經(jīng)元在內(nèi)的許多細(xì)胞類型中充當(dāng)?shù)蛲龅膱?zhí)行者[13]，抑制Caspase-3活化，可阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]，在細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究中常作為重要參考指標(biāo)。

中藥黃芪是臨床常用補(bǔ)氣要藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有補(bǔ)氣活血化瘀之功效。中醫(yī)理論中氣與血之間有著緊密的聯(lián)系，“氣為血之帥”“血為氣之母”“氣能生血”“氣能行血”“氣行則血行”等理論更是闡述了氣血之間的具體關(guān)系，在缺血性腦中風(fēng)的治療過程中，常以黃芪配伍成方，治療中風(fēng)之氣虛血瘀證。補(bǔ)陽還五湯即為治療氣虛血瘀型中風(fēng)的代表方劑，在臨床上應(yīng)用至今，并取得顯著療效[15-16]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪的主要活性成分包括黃酮、皂苷、多糖三大類成分[17]，在調(diào)控自噬、抗炎、抗氧化、促進(jìn)干細(xì)胞增值、調(diào)節(jié)血壓、改善認(rèn)知功能障礙等方面均發(fā)揮著重要作用。其中，黃芪黃酮類成分更是受到越來越多的關(guān)注，毛蕊異黃酮是黃酮類的主要活性成分之一，亦是檢測黃芪質(zhì)量的重要參考指標(biāo)，在抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞增殖、延緩衰老、抗炎、抗心肌肥厚等方面均有應(yīng)用，本課題組前期利用PC12細(xì)胞，在細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮具有抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞凋亡的作用[18]，但其在動物水平是否同樣具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕CIR損傷作用，亟需探索。

因此，本研究通過建立大腦中動脈閉塞模型，模擬CIR損傷環(huán)境，在動物水平，觀察了不同劑量毛蕊異黃酮對CIR大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并初步探討了毛蕊異黃酮拮抗CIR損傷的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 模型組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，腦梗死體積明顯增大，尼氏體明顯減少，凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)明顯增多。當(dāng)給予毛蕊異黃酮處理后，CIR大鼠神經(jīng)功能障礙明顯改善，腦梗死體積明顯減少，尼氏體染色加深明顯增多，凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3表達(dá)明顯降低。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：毛蕊異黃酮可減輕CIR損傷，其分子機(jī)制與毛蕊異黃酮調(diào)控凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3表達(dá)密切相關(guān)。