芮靖琳 商志浩 黎柳嬌 李牧月 顏春妮 李君 何水輝 范郁山 苗芙蕊

(1廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530000；2廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院)

糖尿病(DM)可視為中醫(yī)“消渴”病范疇，雖然近些年西藥的臨床效果較好，但其藥物的毒副作用及耐藥性等因素仍不容忽視。針灸作為祖國中醫(yī)的重要組成部分在糖尿病的防治中發(fā)揮了極其重要的作用，在《千金要方》《針灸甲乙經》中都記載了諸多關于針灸治療消渴的穴位處方〔1〕。已有研究表明，RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶-增強子結合蛋白同源蛋白(PERK-CHOP)通路是介導內質網應激(ERS)發(fā)生的重要通路之一，當通路被活化，下游的CHOP過表達時能夠引起β細胞內ERS的發(fā)生。本研究對探討針刺對PERK-CHOP通路及胰腺組織中ERS的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 將SPF級雄性SD大鼠(220±20)g 80只，由廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，適應性喂養(yǎng)1 w，隨機選取20只作為對照組，用普通飼料喂養(yǎng)4 w。其余60只用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 w，加低劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射制備STZ-DM大鼠模型，隨機血糖(RBG)≥16.7 mmol/L為STZ-DM大鼠，再隨機分成3組，分別是模型組、針刺治療組和藥物組，每組20只。

1.2主要試劑 山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、檸檬酸鹽緩沖液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、STZ、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、過硫酸銨、甲叉丙烯酰胺購自美國Sigma公司；CHOP、PERK購自Bioworld公司；電化學發(fā)光(ECL)超敏發(fā)光試劑盒、預染蛋白購自Marker Thermo公司；檸檬酸鉛、戊二醛購自上海騰準生物科技有限公司；放射免疫沉淀法(RIPA)細胞裂解液(強)購自碧云天生物技術研究所；Tris堿購自Solarbio公司；丙酮、鋨酸、乙酸鈾購自北京化學試劑公司。

1.3主要儀器 電子天平(德國賽多利斯TE2101-L)、超低溫冰箱(海爾DW-86L490)、電熱恒溫水浴鍋(金壇醫(yī)療HHS-8)、臺式高速冷凍離心機(Thermo FisherST16R)、超凈工作臺(安泰SE-CJ-IFD)、全波長多功能酶標儀(TECAN InfiniteM200 PRO)、凝膠成像分析儀(Carestream MM1000)、半自動輪轉切片機(LeicaRM2245)、組織包埋機(賽默飛世爾Histocentre3)、多用脫色搖床(其林貝爾KB-900)、凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂GelDoc XR+)、全自動組織脫水機(LeicaASP300S)等。

1.4造模方法 對剩余60只大鼠(即造模組)進行造模，喂養(yǎng)期間大鼠們自由飲水、攝食，飼料為配制的高脂高糖飼料，每日常規(guī)更換1次飼料、飲用水及墊料。喂養(yǎng)1個月后，連續(xù)2 d對其進行小劑量STZ(30 mg/kg)腹腔注射，每次操作前12 h嚴格禁食，不需禁水，操作后繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)1 w后，采集尾靜脈血用血糖儀檢測隨機血糖，其值≥16.7 mmol/L者即造模成功。

1.5干預方法 干預期間各組大鼠均為普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水、攝食，每日常規(guī)更換兩次飼料、飲用水及墊料，定期清潔消毒鼠籠及實驗室。(1)針刺治療組：將大鼠固定，撥開局部叢毛，常規(guī)消毒操作穴位后三里、內庭、胰俞(穴位定位參考張露芬教授主編的《實驗針灸學》〔2〕)，選用順和牌0.18×13 mm一次性針灸針針刺，后三里、胰俞直刺3～5 mm，內庭向后方斜刺2 mm，均行小幅度捻轉手法1 min。每次僅選取同一側的后三里和胰俞穴接通G6805Ⅱ型電針治療儀，調至連續(xù)波，電流強度為2 mA，頻率為4 Hz，以大鼠無嘶叫為宜。雙側穴位輪流選取接電，治療15 min/次，1次/d，7 d/w。(2)藥物組：予二甲雙胍100 mg/kg粉末與加溫蒸餾水混合成20 mg/ml濃度的溶液，按大鼠體重所需要的等效藥量灌胃給藥〔3〕。1次/d，7 d/w。(3)模型組和對照組：與針刺治療組同法固定大鼠15 min，不作任何干預處理，1次/d，7 d/w。各組均干預4 w后斷尾采血測隨機血糖。禁食12 h后稱重，用10%水合氯醛腹腔麻醉后，置冰碟上快速取出胰體、胰尾，置液氮中保存。

1.6觀察指標檢測方法 采用RT-PCR和Western印跡檢測各組胰腺組織CHOP、PERK mRNA和蛋白表達，使用電鏡觀測胰腺組織內質網形態(tài)。

1.7統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗，方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1干預后各組胰腺組織CHOP、PERK mRNA及蛋白表達 干預4 w后，模型組CHOP、PERK mRNA及蛋白表達均顯著高于對照組；與模型組比較，針刺治療組、藥物組CHOP、PERK mRNA及蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 各組CHOP和PERK mRNA及蛋白 表達

圖1 各組CHOP和PERK蛋白表達

2.2模型組、針刺治療組電鏡下內質網形態(tài)學改變 模型組胰腺組織的腺泡細胞內酶原顆粒減少(紅色箭頭)；可見內質網極度擴張(黃色箭頭)；細胞核內染色質散在分布核膜上(藍色箭頭)；腺泡細胞內細胞器豐富，未見線粒體水腫腫脹。針刺組胰腺組織的腺泡細胞內酶原顆粒急劇減少(紅色箭頭)；可見內質網輕微擴張(黃色箭頭)；腺泡細胞內細胞器豐富，部分線粒體明顯腫脹(黑色箭頭)。見圖2。

圖2 電鏡下內質網形態(tài)

3 討 論

內質網具有促進合成機體主要蛋白質、部分固醇和脂類，對已合成的蛋白質進行加工折疊和修飾的功能，它的穩(wěn)態(tài)平衡有著十分重要的意義〔4〕。當發(fā)生未折疊蛋白反應(UPR)、內質網的過度負荷反應(EOR)或由于缺乏膽固醇引起的固醇調節(jié)原件結合蛋白質通路調節(jié)的反應時，都可能刺激內質網誘發(fā)ERS，打破平衡穩(wěn)態(tài)〔5〕。其中，PERK-CHOP通路是介導ERS發(fā)生的重要通路之一，當通路被活化，下游的轉錄因子CHOP等蛋白過表達時能夠引起胰島β細胞內ERS的發(fā)生，最終極有可能引起胰島β細胞凋亡，導致2型DM的發(fā)生〔6～10〕。本研究結果說明針刺能夠對PERK、CHOP產生影響并降低其表達，同時改善胰腺組織中的ERS。

DM屬于中醫(yī)“消渴”范疇，是以多飲、多尿、多食、形體消瘦，或尿濁、尿有甜味為主癥的病證。它的發(fā)生常與先天不足和后天飲食、情志、勞欲等因素有關。病變臟腑主要在肺、胃、腎。本實驗中造模大鼠DM的發(fā)生與飲食不節(jié)因素有較大關系，病變臟腑主要涉及胃，久之必定會影響到肺、腎?；静C是陰虛燥熱。后三里(足三里)是足陽明胃經的下合穴，《靈樞·邪氣藏府病形》中提出“合治內府”的理論，故針刺足三里穴能夠增強脾胃功能、補脾益氣，王媛等〔11〕、張月等〔12〕針灸治療T2DM辨證針刺足三里等穴，結果顯示能夠有效改善糖、脂代謝情況，胰島素敏感性指數等。內庭是足陽明胃經的滎穴，《難經·六十八難》中將滎穴的主治特點概括為：“滎主身熱”，故針刺此穴能夠改善因胃火旺盛而導致的多食易饑等癥狀。胰俞，又稱為胃脘下俞、胃管下輸三穴等，屬經外奇穴，為治療DM的經驗穴，正如《備急千金要方·卷二十一》：“消渴咽喉干，灸胃管下輸三穴……穴在背第八椎下，橫三寸間寸灸之?！贝笫蟮囊扔嵛挥诘?胸椎棘突下旁開7 mm，研究表明〔13,14〕針刺胰俞可以有效調節(jié)胰腺的內分泌功能，達到治療胰腺炎、消化不良等疾病和DM的目的。三個穴位配伍已經被證實在治療DM方面有較好的實驗和臨床療效。

綜上，當胰腺組織中發(fā)生ERS時，PERK-CHOP通路也隨之激活并對胰島β細胞的凋亡產生影響。而針刺可以通過干預ERS的發(fā)生，抑制PERK-CHOP通路的活化，從而減少胰島β細胞的凋亡，保護胰腺組織。