謝興旺 柯超 周紅見(jiàn) 裴勝利 (武漢市第三醫(yī)院胃腸外科，湖北 武漢 430060)

直腸癌是常見(jiàn)癌癥，其發(fā)病率和死亡率極高，直腸癌細(xì)胞凋亡減少、遷移、侵襲能力增加是直腸癌快速進(jìn)展的重要原因〔1〕。小金丹出自《外科證治全生集》，具有消腫、解毒、化痰、活血等功效，由地龍、木鱉子、五靈脂等組成，現(xiàn)階段臨床上用于甲狀腺瘤、膿腫、慢性肝炎、聚合性痤瘡等治療〔2〕。有研究〔3,4〕顯示，小金丹有抗腫瘤作用，對(duì)肝癌、乳腺癌等有抑制作用。目前尚不清楚小金丹對(duì)直腸癌細(xì)胞遷移等的作用和機(jī)制。Wnt信號(hào)是目前研究較多的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，參與糖尿病、腫瘤、腦卒中等疾病進(jìn)展〔5〕。在腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin過(guò)度激活，抑制Wnt/β-catenin可阻礙腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔6〕。本實(shí)驗(yàn)基于Wnt/β-catenin信號(hào)研究小金丹對(duì)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲、凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等的影響。

1 材料與方法

1.1材料 直腸癌細(xì)胞HR-8348，上海博麥德生物技術(shù)有限公司提供。小金丹提取物由西安高遠(yuǎn)生物科技有限公司提供。小金丹配方：50 g五靈脂、50 g楓香脂、50 g地龍、25 g醋沒(méi)藥、50 g制草烏、25 g醋乳香、25 g酒當(dāng)歸、4 g墨炭、50 g木鱉子，研磨成粉狀，然后將人工麝香研磨，混合，添加4℃預(yù)冷后的乙醇(70%)浸泡，超聲提取，4℃冷浸，提取上清液，過(guò)濾(0.22 μm)，用培養(yǎng)基稀釋成實(shí)驗(yàn)需要的濃度。主要試劑：兔抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、兔抗β-catenin抗體，武漢菲恩生物科技有限公司產(chǎn)品；兔抗c-myc抗體，美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品；兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9抗體，南京歐凱生物科技有限公司產(chǎn)品；兔抗細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；兔抗細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK)2抗體，美國(guó)GeneTex公司產(chǎn)品；兔抗上皮性鈣黏附素(E-cadherin)抗體，北京義翹神州科技股份有限公司產(chǎn)品；兔抗神經(jīng)性鈣黏附素(N-cadherin)抗體，江蘇親科生物研究中心有限公司產(chǎn)品；兔抗Bcl-2抗體，青島捷世康生物科技有限公司產(chǎn)品；Wnt/β-catenin通路激活劑LiCl，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)條件為：37℃，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，將細(xì)胞分成對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、實(shí)驗(yàn)高劑量組(在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)分別給予0、20、40、80 mg/L小金丹處理)、高劑量+LiCl組(在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)給予80 mg/L小金丹和20 mmol/L〔7〕LiCl處理)。

1.3噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)增殖活性 直腸癌細(xì)胞種植到96孔板內(nèi)，分別在細(xì)胞中添加0、5、10、20、40、80、160 mg/L小金丹，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在每個(gè)孔內(nèi)添加MTT工作液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將孔中的上清溶液棄掉，添加150 μl二甲基亞砜，10 min后，上酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度(OD)值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活性。

1.4Western印跡檢測(cè)β-catenin、c-myc、CyclinD1、CDK2、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 直腸癌細(xì)胞種植到6孔板內(nèi)，每個(gè)孔內(nèi)添加106個(gè)細(xì)胞，按照1.2中方法分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，添加含有1%苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)溶液，放在冰上反應(yīng)30 min。刮取細(xì)胞，11 000 r/min離心5 min。吸取上清，放在-80℃保存。利用二喹啉甲酸(BCA)方法檢測(cè)蛋白濃度。在蛋白提取物中添加5倍上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。每個(gè)孔內(nèi)添加60 μg蛋白(20 μl體積)。配制12%分離膠、5%積層膠，在積層膠中用80 V電壓電泳，在分離膠中用120 V電壓電泳，觀察溴酚藍(lán)染料進(jìn)入凝膠的最下端，取出凝膠。裁剪聚偏氟乙烯(PVDF)膜，90 V電壓轉(zhuǎn)膜90 min。將PVDF膜放在5%牛血清白蛋白溶液中，在室溫中結(jié)合1 h。然后將PVDF膜放在一抗內(nèi)，4℃搖床孵育過(guò)夜。PVDF膜放在二抗內(nèi)，在室溫?fù)u床孵育1 h。ECL發(fā)光。以GAPDH作為內(nèi)參，掃描條帶的灰度值，根據(jù)灰度值分析目的蛋白表達(dá)量。β-catenin、N-cadherin、c-myc、CDK2抗體稀釋倍數(shù)為1∶1 200，E-cadherin、MMP-9抗體稀釋倍數(shù)為1∶800，Bax、CyclinD1、Bcl-2抗體稀釋倍數(shù)為1∶1 000，二抗稀釋倍數(shù)為1∶4 000。

1.5PI單染法檢測(cè)周期 直腸癌細(xì)胞種植到6孔板內(nèi)，每個(gè)孔內(nèi)添加106個(gè)細(xì)胞，按照1.2中方法分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇固定，800 r/min離心5 min。吸棄上清。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次。添加碘化丙啶(PI)染色液，在37℃孵育30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)周期。

1.6膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/PI雙染法檢測(cè)凋亡 直腸癌細(xì)胞種植到6孔板內(nèi)，每個(gè)孔內(nèi)添加106個(gè)細(xì)胞，按照1.2中方法分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，以1倍結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/ml，吸取100 μl細(xì)胞懸浮液，添加5 μl Annexin V-FITC、100 μg/ml PI溶液，在室溫中避光孵育15 min。繼續(xù)添加400 μl 1倍結(jié)合緩沖液，混合后，放在冰上備用。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡變化。

1.7Transwell小室檢測(cè)遷移和侵襲 在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)前，首先用Matrigel將小室包被。其余操作相同。將直腸癌細(xì)胞按照1.2中方法分組處理，懸浮在不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中。在小室的上室內(nèi)添加1×105個(gè)細(xì)胞(200 μl細(xì)胞培養(yǎng)液)，在下室中添加600 μl含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將小室內(nèi)的液體吸棄，用棉簽擦掉沒(méi)有穿膜的細(xì)胞，90%乙醇固定，0.1%的結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞穿膜數(shù)目，即為細(xì)胞遷移/侵襲數(shù)目。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組直腸癌細(xì)胞增殖活性比較 與0 mg/L(0.79±0.08)比較，20、40、80、160 mg/L小金丹處理后的直腸癌細(xì)胞增殖活性(0.66±0.04、0.55±0.03、0.43±0.04、0.32±0.02)顯著降低(P<0.05)；5、10 mg/L(0.76±0.08、0.74±0.08)無(wú)變化。160 mg/L小金丹處理后的直腸癌細(xì)胞存活率低于50%，選擇20、40、80 mg/L小金丹進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2各組β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)量逐漸降低；與高劑量組比較，高劑量+LiCl組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

1～5:對(duì)照組，低劑量組，中劑量組，高劑量組，高劑量+LiCl組；圖2、4、7同圖1 Western印跡檢測(cè)小金丹處理后直腸癌 細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 各組β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)量比較

2.3小金丹調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)抑制直腸癌細(xì)胞增殖和周期進(jìn)展 與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組細(xì)胞增殖活性降低，G0/G1期比例逐漸升高，Cyc-linD1、CDK2蛋白表達(dá)量逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高劑量組比較，高劑量+LiCl組細(xì)胞增殖活性升高，G0/G1期比例降低，CyclinD1、CDK2蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、圖3和表2。

圖2 Western印跡檢測(cè)小金丹處理后的 直腸癌細(xì)胞中CyclinD1、CDK2蛋白表達(dá)

圖3 PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期

表2 各組直腸癌細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期分布和CyclinD1、CDK2蛋白表達(dá)量比較

2.4小金丹調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)抑制直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT 與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組細(xì)胞遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)量逐漸降低，E-cadherin蛋白表達(dá)量逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高劑量組比較，高劑量+LiCl組細(xì)胞遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)量顯著升高，E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4、圖5和表3。

2.5小金丹調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)對(duì)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)量逐漸升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高劑量組比較，高劑量+LiCl組細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)量顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖6、圖7和表4。

圖4 Western印跡檢測(cè)小金丹處理后的直腸癌細(xì)胞中 E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)

圖5 Transwell小室檢測(cè)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲(×200)

表3 各組細(xì)胞遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目和E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)量比較

圖6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)小金丹處理后的直腸癌細(xì)胞凋亡

圖7 Western印跡檢測(cè)小金丹處理后的 直腸癌細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

表4 各組細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白 表達(dá)量比較

3 討 論

小金丹，原書(shū)上記載其可以用于治療乳癖、流柱、乳巖等疾病，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤也有治療作用〔2〕。有實(shí)驗(yàn)〔3,4〕顯示，小金丹可降低乳腺癌、肝癌細(xì)胞增殖、遷移能力。本研究結(jié)果提示小金丹具有抗直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用，這為小金丹治療直腸癌的臨床應(yīng)用提供了理論支撐。

腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為與細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)控因子有關(guān)，細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，其可以分成分裂期和分裂間期，其中細(xì)胞從G0/G1期向S期進(jìn)展是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)〔8〕。CyclinD1、CDK2是細(xì)胞周期的促進(jìn)因子，可促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，進(jìn)而加快細(xì)胞增殖〔9〕。與細(xì)胞凋亡有關(guān)的調(diào)控因子有很多，其中包括Bcl-2蛋白家族，Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡因子，Bcl-2是Bax蛋白家族中的抗凋亡蛋白，二者表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡改變有關(guān)〔10,11〕。MMP-9屬于MMPs家族成員，在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、遷移中發(fā)揮促進(jìn)作用，其能夠?qū)⒓?xì)胞外基質(zhì)降解，進(jìn)而為細(xì)胞遷移提供條件〔12〕。EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期標(biāo)志性事件，是指上皮細(xì)胞特征逐漸消失而間質(zhì)細(xì)胞特征逐漸明顯的過(guò)程，E-cadherin是上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白，N-cadherin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白〔13,14〕。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明小金丹有抗直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

β-catenin是Wnt經(jīng)典信號(hào)通路Wnt/β-catenin的核心蛋白，c-myc是Wnt/β-catenin信號(hào)的下游靶基因〔15～17〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小金丹能夠降低直腸癌細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)量，小金丹可能通過(guò)影響Wnt/β-catenin信號(hào)抑制直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Wnt/β-catenin信號(hào)在腫瘤中過(guò)度表達(dá)，而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)能夠抑制腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移〔18～20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示小金丹通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)激活水平發(fā)揮抗直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的作用，這為研究小金丹抗直腸癌分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。