劉傳杰 朱莉偉 陳殿松 吉 驪 蔣建新

[1.北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國(guó)家林業(yè)和草原局木本香料（華東）工程研究中心，北京 100083；2.廣州德谷個(gè)人護(hù)理用品有限公司，廣東 廣州 510800]

皂素廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中，是糖基化植物的次生代謝產(chǎn)物。其可應(yīng)用于飲料[1]、化妝品[2-3]、醫(yī)藥[4]以及人造板材[5-6]等領(lǐng)域，是許多中藥、中成藥、中草藥、植物藥和天然藥的主要成分，在人造板材工業(yè)上作為乳化劑乳化石蠟效果好，可大幅度提升板材檔次。皂莢皂素是從皂莢屬植物中提取出來(lái)的一種三萜皂苷，其結(jié)構(gòu)中含有糖體、有機(jī)酸等親水性極性基團(tuán)，皂素水溶液振搖后能產(chǎn)生持久的泡沫（類(lèi)似肥皂水溶液泡沫），是一種非離子型表面活性劑，具有顯著的去污[7-8]和抑菌能力[9-10]。目前，生產(chǎn)皂莢皂素的方法主要有水提法和有機(jī)溶劑提取法[11-15]。由于這兩種方法均存在生產(chǎn)工藝粗放的問(wèn)題，導(dǎo)致工業(yè)上生產(chǎn)的皂素產(chǎn)品顏色深、純度低，產(chǎn)品附加值較低，在洗護(hù)、生物醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域的應(yīng)用受到了較大限制。皂莢皂素顏色較深主要有兩方面的原因：一是源于其自身的天然色素充當(dāng)了顯色物質(zhì)，且種類(lèi)復(fù)雜多變，不易分離和純化；二是由皂素加工提取過(guò)程中產(chǎn)生的，如加熱過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)、多糖的水解等。

為拓寬皂素產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域，提升其經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)其顏色品質(zhì)的控制和調(diào)節(jié)勢(shì)在必行。皂素脫色的手段主要有兩種：一種是在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)化生產(chǎn)工藝，減少人為因素，控制色素類(lèi)物質(zhì)的溶出和進(jìn)一步生成；另一種則是通過(guò)加入特定的脫色劑淡化其顏色。常用的脫色方法有物理吸附法、化學(xué)吸附法和化學(xué)氧化脫色法[16-21]。物理吸附法主要是利用分子之間的吸引力對(duì)皂素進(jìn)行分離和純化，從而達(dá)到物理脫色的效果，該方法樣液不易過(guò)濾，皂素?fù)p失較大?；瘜W(xué)吸附法是使用離子交換樹(shù)脂選擇性吸附皂素中存在的一些酚類(lèi)、黃酮類(lèi)和醌類(lèi)色素。相較于物理吸附脫色的方法，化學(xué)吸附法脫色的能力較大，而且目標(biāo)產(chǎn)物的損失也較小，皂素得率較高。色素類(lèi)物質(zhì)一般都含有共軛雙鍵發(fā)色基團(tuán)，因此可以通過(guò)化學(xué)氧化的方法破壞發(fā)色基團(tuán)的共軛雙鍵系統(tǒng)達(dá)到脫色目的。該方法脫色效率高且得到的皂素產(chǎn)品顏色自然均勻。目前，使用較多的化學(xué)氧化脫色劑主要有雙氧水、過(guò)氧化苯甲酰、氯酸鈉、高錳酸鉀、臭氧等。本研究選用過(guò)氧化氫作為脫色劑，對(duì)粗提皂莢皂素進(jìn)行脫色研究，取得了良好的脫色效果，該方法條件溫和、不殘留、處理范圍廣、效率高、不需要專(zhuān)用設(shè)備等，具有廣泛的應(yīng)用前景和工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

皂莢（Gleditsia sinensisLam.）果采摘于河南省三門(mén)峽市凱達(dá)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣有限公司皂莢林種植基地。無(wú)水乙醇、過(guò)氧化氫（30%）、氯化氫、氫氧化鈉、吸附樹(shù)脂（AG501-X8 Resin）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，產(chǎn)品等級(jí)均為分析純。

1.2 儀器

傅里葉變換紅外光譜儀（Bruker-ALPHA，Bruker，德國(guó)）；高效液相色譜儀（Waters 2695，Waters，美國(guó)），配備HPX-87P柱子和2414示差折光檢測(cè)器；自動(dòng)表面張力儀（BZY 系列，上海方瑞儀器有限公司，中國(guó)）；分光輻射亮度計(jì)（PR715，Photo Research，美國(guó)）；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU8010，Hitachi，日本）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 皂莢皂素脫色

皂莢皂素粗品采用無(wú)水乙醇索氏抽提的方法制備，皂莢果去籽、干燥、粉碎后將其放入索氏抽提中，在85 ℃下進(jìn)行抽提12 h，然后將抽提液進(jìn)行濃縮、真空干燥、研磨后得到粗提皂莢皂素（其色度值為L(zhǎng)*: 58.09，a*: 9.60，b*: 3.57）。皂莢果和粗提皂莢皂素的宏觀形貌如圖1所示。稱(chēng)取一定量的粗提皂莢皂素溶于20 mL 90%的乙醇溶液中，用10% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至10，加入皂素質(zhì)量6%的H2O2（30%），在70 ℃水浴的條件下磁力攪拌2 h，然后加入60 mg吸附樹(shù)脂攪拌15 min，反應(yīng)后將反應(yīng)液過(guò)濾，調(diào)節(jié)濾液至中性，加入60 mL丙酮，不停攪拌直至得到固體沉淀，倒掉上層丙酮澄清液，將固體放入60 ℃烘箱，真空干燥得淺黃色粉末即為脫色皂莢皂素樣品，樣品真空密封保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 皂莢果和粗提皂莢皂素圖Fig.1 The pictures of saponin pods and crude saponins

1.3.2 脫色率計(jì)算

參考嚴(yán)峻等[22-24]的方法，使用分光輻射亮度計(jì)對(duì)樣品顏色進(jìn)行測(cè)量，并將測(cè)定記錄的數(shù)據(jù)（L*、a*和b*值）進(jìn)行綜合分析。L*是明度值，表示色彩的明暗度，其范圍為0～100，0時(shí)亮度最低，100 時(shí)亮度最高。a*和b*值是色彩的色度值，其中a*值從紅（正值）到綠（負(fù)值）漸變，b*值則由黃（正值）到藍(lán)（負(fù)值）漸變[25]。L*值是衡量樣品亮度的一個(gè)重要的指標(biāo)，故使用L*值作為脫色效果的衡量標(biāo)準(zhǔn)。脫色率用如下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：表示皂莢皂素脫色前的*值；表示皂莢皂素脫色后的L*值。

1.3.3 表面張力測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[26]中的方法，并做了一定調(diào)整。取適量干燥后的粗提皂莢皂素和脫色皂素樣品配置成0.35 g/L的皂素水溶液，加熱至30 ℃，取一定量的皂素水溶液置于表面皿，采用自動(dòng)表面張力儀測(cè)定溶液表面張力，每個(gè)樣品重復(fù)五次。

1.3.4 泡沫高度測(cè)定

采用量筒震蕩法對(duì)脫色前后皂素的泡沫高度進(jìn)行測(cè)量，準(zhǔn)備潔凈的50 mL具塞量筒若干，取適量干燥后的脫色皂素配置成0.35 g/L的皂素水溶液。在室溫下，取10 mL皂素水溶液加入具塞量筒，劇烈震蕩，觀察泡沫產(chǎn)生的高度作為溶液起泡性能的量度，記下從停止振蕩到泡沫高度衰減到原來(lái)泡沫高度的一半所用的時(shí)間，即半衰期t1/2，用于表征泡沫的穩(wěn)定性[27]，每個(gè)樣品重復(fù)五次。

1.3.5 傅里葉紅外光譜表征

采用紅外光譜儀和KBr壓片的方法進(jìn)行傅里葉紅外光譜測(cè)試表征。將粗提皂莢皂素和脫色皂莢皂素樣品絕干后和KBr充分研磨，置于壓片機(jī)中壓制透明的薄片后進(jìn)行測(cè)試，條件為400～4 000 cm-1。

1.3.6 能譜測(cè)試

將粗提皂莢皂素和脫色皂莢皂素樣品研磨后絕干，將粉末置于導(dǎo)電膠上，并進(jìn)行噴金處理，借助場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡搭載的能譜儀測(cè)試皂素樣品中Fe和Cu的相對(duì)含量。

1.3.7 皂莢皂素水解

精確稱(chēng)取皂莢皂素25 mg，溶于25 mL 0.25 M硫酸中，30 ℃恒溫震蕩0.5 h，100 ℃回流水解2 h。然后將水解液冷卻至室溫，取3 mL上清液于離心管，加入碳酸鈣進(jìn)行中和，調(diào)節(jié)pH至5～7。將中和后的水解液高速離心（12 000 r/min）10 min，然后取1.5 mL上清液加入6 mg吸附樹(shù)脂，吸附1 h。然后過(guò)0.22 μm水系膜后裝入液相小瓶進(jìn)行高效液相色譜分析[分析條件：HPX-87H柱（300×7.8 mm），流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，柱溫為65 ℃，進(jìn)樣量為5 μL[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理時(shí)間對(duì)脫色效果的影響

對(duì)皂莢皂素進(jìn)行脫色處理，不同的處理時(shí)間（編號(hào)1-4）、處理溫度（編號(hào)5-8）和脫色劑用量（編號(hào)9-12）的試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

由表1、2可以看出，在H2O2用量（4%）和處理溫度（70 ℃） 一定的情況下，脫色時(shí)間越長(zhǎng)皂莢皂素的脫色率越高，隨著時(shí)間的增加，皂素水溶液的表面張力呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)。此條件下最小脫色率為62.98%，對(duì)應(yīng)的脫色時(shí)間為1 h，表面張力為41.90 mN/m；最大脫色率為76.50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的脫色時(shí)間為2.5 h，表面張力為43.25 mN/m，值由58.09提高到90.15。2號(hào)樣品表面張力最小為41.55 mN/m，脫色時(shí)間為1.5 h。對(duì)比可知，脫色時(shí)間會(huì)影響皂莢皂素的脫色效果，且脫色的過(guò)程是緩慢進(jìn)行的，并沒(méi)有發(fā)生劇烈脫色反應(yīng)，有利于脫色工藝的控制和進(jìn)一步優(yōu)化。

表1 皂莢皂素脫色試驗(yàn)方案、表面張力和得率Tab.1 Decolorization scheme, surface tension and yield of saponin from Gleditsia sinensis

圖2 不同處理時(shí)間的脫色皂素圖Fig.2 Decolorized saponins with diあerent treatment time

2.2 H2O2用量對(duì)脫色效果的影響

由表1和圖3可以看出，在處理時(shí)間（1.5 h）和處理溫度（70 ℃）一定的情況下，脫色劑用量越多皂莢皂素的脫色率越高而且皂素水溶液的表面張力也呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)。在脫色過(guò)程中，H2O2會(huì)產(chǎn)生游離的羥基自由基，這是一種高度反應(yīng)的、非選擇性的氧化劑，能夠破壞色素類(lèi)物質(zhì)的共軛雙鍵斷裂或者發(fā)生異構(gòu)，從而破壞其發(fā)色基團(tuán)，達(dá)到脫色效果。此條件下最小脫色率為63.68%，對(duì)應(yīng)的脫色劑用量為2%，表面張力為42.15 mN/m；最大脫色率為75.51%時(shí)，對(duì)應(yīng)的脫色劑用量為8%，表面張力為43.60 mN/m，L*值由58.09提高到89.74。此外，當(dāng)脫色劑用量為6%和8%時(shí)，兩種脫色皂素的顏色并無(wú)顯著差異，在考慮成本和安全性的情況下，H2O2用量不宜過(guò)多。

圖3 不同脫色劑用量處理的脫色皂素圖Fig.3 Decolorized saponinstreated with diあerent dosage of decolorizing agent

2.3 處理溫度對(duì)脫色效果的影響

由表1、圖4可知，在脫色劑用量（6%）和處理時(shí)間（1.5 h）一定的情況下，隨著脫色溫度的不斷升高，粗提皂莢皂素的脫色率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，溫度升高后皂素水溶液的表面張力未發(fā)生太大變化。此條件下最小脫色率為75.35%，對(duì)應(yīng)的處理溫度為55 ℃，表面張力為40.9 mN/m；當(dāng)最大脫色率為78.12%，對(duì)應(yīng)的處理溫度為85 ℃，表面張力為42.65 mN/m，L*值由58.09提高到90.83。9號(hào)樣品表面張力最小為40.90 mN/m，脫色溫度為55 ℃。由此可以推測(cè)，脫色劑的反應(yīng)活性會(huì)受到溫度的影響，溫度過(guò)高，脫色劑急劇分解影響脫色效果。此外，還可能是由于過(guò)高的溫度使得反應(yīng)體系發(fā)生了美拉德反應(yīng)，從而影響脫色效果。

圖4 不同處理溫度條件下的脫色皂素圖Fig.4 Decolorized saponins at diあerent treatment temperatures

2.4 脫色前后皂素的泡沫高度

由圖5可以看出，脫色前后皂素水溶液的泡沫高度有著明顯的變化，未脫色皂素的泡沫高度（圖5a）為12 mm，脫色后皂素水溶液（圖5b）的泡沫高度超過(guò)36 mm，且脫色皂素的半衰期t1/2≥12 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未脫色皂素的半衰期t1/2= 40 min，說(shuō)明皂莢皂素脫色工藝對(duì)皂素水溶液的泡沫穩(wěn)定性起到了促進(jìn)作用。脫色皂素的泡沫半衰期顯著高于粗提皂素，加之粗提皂素顏色有了明顯改觀，由紅褐色變成米黃色，實(shí)現(xiàn)了粗提皂莢皂素脫色純化的目的，這有利于拓寬皂莢皂素在生物醫(yī)藥、食品飲料、照相復(fù)印等高端制造領(lǐng)域的應(yīng)用。

圖5 H2O2處理前后皂莢皂素水溶液的泡沫高度圖Fig.5 Foam height map of saponin aqueous solutionbefore H2O2 treatment

2.5 脫色機(jī)理分析

2.5.1 脫色前后皂莢皂素Fe和Cu變化情況

粗提皂素中金屬離子的含量對(duì)皂素的顏色會(huì)有一定的影響，金屬離子吸附在皂素上會(huì)使皂素顏色加深。通過(guò)掃描電子顯微鏡搭載的能譜儀對(duì)皂莢皂素（未脫色樣品）、1號(hào)脫色皂素（脫色率為62.98%）和11號(hào)脫色皂素（脫色率為78.12%）進(jìn)行能譜分析，對(duì)皂莢皂素微區(qū)Fe和Cu及其相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定。由表2可知，與未脫色皂素相比，脫色皂素兩種元素的相對(duì)含量值均有所減少，且脫色率越高，金屬離子相對(duì)含量越低。這可能是因?yàn)榇痔嵩砬v皂素中存在色素類(lèi)雜質(zhì)，該類(lèi)物質(zhì)吸附金屬離子后皂莢皂素顏色變深。經(jīng)H2O2法處理后，其雙鍵系統(tǒng)被破壞，其吸附的金屬離子也隨之被解吸附，相應(yīng)的皂莢皂素顏色變淺。所以在工業(yè)生產(chǎn)中皂莢皂素的粗提或純化過(guò)程應(yīng)盡可能的避免金屬離子的帶入[16]。

表2 皂莢皂素脫色前后Fe和Cu的相對(duì)含量值對(duì)比Tab.2 Comparison of relative contents of Fe and Cu before and after decolorization of Gleditsia saponin

2.5.2 脫色前后皂莢皂素紅外光譜分析

圖6為粗提皂莢皂素和脫色皂莢皂素的紅外光譜圖?？梢钥闯?，皂莢皂素在3 000～3 700 cm-1之間存在一個(gè)較寬的振動(dòng)峰，對(duì)應(yīng)于糖基和苷元上所連O—H的伸縮振動(dòng)；在1 500～1 800 cm-1之間的光譜區(qū)域?qū)?yīng)COOH的振動(dòng)峰；2 920 cm-1為亞甲基的C—H伸縮振動(dòng)峰；1 725 cm-1和1 635 cm-1的吸收峰表明結(jié)構(gòu)中存在C==O；900～1 130 cm-1中的吸收峰是由C—O—C振動(dòng)引起[29-30]。脫色前后皂莢皂素在2 855 cm-1處發(fā)生了明顯的變化，2 855 cm-1處應(yīng)為脂肪鏈中的C—H振動(dòng)峰，這應(yīng)該是在脫色的過(guò)程中脫去了油脂類(lèi)物質(zhì)。脫色皂素在1 600 cm-1位置處出現(xiàn)了新的峰，而未脫色皂素中1 635 cm-1位置的峰消失，這可能是因?yàn)樯仡?lèi)雜質(zhì)的雙鍵被破壞導(dǎo)致的[20]。

圖6 H2O2處理前后皂莢皂素的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of gleditsia saponin before and after treatment with H2O2

2.5.3 脫色前后皂莢皂素糖含量變化

粗提皂莢皂素和脫色皂莢皂素樣品水解后的糖含量如圖7所示。由圖可知，水解液中主要含有葡萄糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。相比于粗提皂莢皂素原料，脫色皂素各單糖含量均略有增加，皂素水解液中木糖含量最高，均在20%以上。其次是葡萄糖，含量均在15%以上。鼠李糖和阿拉伯糖含量相近，在5%左右?？偺呛孔罡咧禐?號(hào)和10號(hào)脫色樣品，含量為51.05%。這說(shuō)明H2O2法皂素脫色工藝能夠有效去除粗提皂莢皂素中的部分雜質(zhì)，提高脫色皂素產(chǎn)品純度，具有工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。

圖7 皂莢皂素水解后的糖含量趨勢(shì)圖Fig.7 Trend chart of sugar content after hydrolysis ofgleditsia saponin

3 結(jié)論

1）采用H2O2法處理粗提皂素制備脫色皂素產(chǎn)品，該工藝簡(jiǎn)潔、條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短。處理后的皂素顏色為米黃色，顏色自然。通過(guò)綜合評(píng)價(jià)脫色劑用量、脫色溫度、脫色時(shí)間、脫色皂素外觀色貌、表面張力和總糖含量等參數(shù)和性質(zhì)，確定了H2O2法脫色皂莢皂素的優(yōu)化工藝為脫色劑H2O2用量6%、脫色時(shí)間2 h、脫色溫度70 ℃。

2）紅外光譜分析表明：脫色前后樣品的結(jié)構(gòu)基本不變，而且脫色樣品的泡沫高度明顯高于未脫色樣品，說(shuō)明色素類(lèi)的雜質(zhì)不僅會(huì)影響皂素產(chǎn)品的色澤而且會(huì)影響皂素水溶液的表面活性。

3）H2O2脫色反應(yīng)主要破壞的是色素類(lèi)雜質(zhì)的雙鍵，在脫色過(guò)程中，H2O2會(huì)產(chǎn)生游離的羥基自由基，能夠破壞色素類(lèi)物質(zhì)的共軛雙鍵系統(tǒng)。在去除雜質(zhì)和油脂物質(zhì)的同時(shí)，粗提皂莢皂素吸附的Fe和Cu的含量也隨之降低，導(dǎo)致粗提皂莢皂素顏色變淺。