黃玉惠，余婧，李景

(成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院病理科，四川 成都 610200)

肺癌是起源于肺支氣管上皮黏膜組織或腺體組織的原發(fā)性癌，依據(jù)病理組織學不同分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌占所有肺癌的85%～90%[1]。肺癌的發(fā)病呈家族聚集性，遺傳、職業(yè)暴露、環(huán)境、不良飲食、吸煙、基因突變等因素均是肺癌發(fā)病的高危因素[2]。早期肺癌的檢出率約為15%，局部晚期或轉(zhuǎn)移期肺癌的診斷率可達75%[3]。早期肺癌多通過手術(shù)切除、化學治療、靶向分子治療等方式進行，晚期肺癌伴轉(zhuǎn)移患者則多采用免疫療法進行治療。盡管靶向分子技術(shù)和精準醫(yī)療在肺癌的臨床診斷和治療中應(yīng)用日漸廣泛，一定程度可提高肺癌患者的生存率，但晚期肺癌生存率仍不足15%[4]。天門冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、嗜鉻粒蛋白A(chromograninA，CGA)和細胞角蛋白7(Cytokeratin 7，CK7)作為腫瘤特異性標志物，被證實可輔助鑒別肺癌組織學類型，幫助明確病情，制定合適的治療方案及預(yù)測預(yù)后[5]。本研究旨在探討天門冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、嗜鉻粒蛋白A(CGA)及細胞角蛋白7(CK7)在肺癌患者中的表達及與臨床病理的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月至2019年11月成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院收治的109例肺癌患者的肺癌組織及癌旁組織為研究對象。109例患者中，男性64例，女性45例；年齡為29～74歲，平均(50.34±6.87)歲；有吸煙史77例，無吸煙史32例；病理類型：肺腺癌31例，肺鱗癌24例，大細胞癌8例，小細胞癌46例；低分化癌23例，中分化癌55例，高分化癌31例；TNM分期：I～II期42例，III～IV期67例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例；手術(shù)治療15例，放療41例，化療53例。納入標準：(1)符合《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)》[6]中指出的肺癌相關(guān)診斷標準，術(shù)中取病理標本，均經(jīng)病理證實為肺癌者；(2)入院前未接受過放、化療、免疫治療等抗腫瘤治療者；(3)年齡≥18周歲。排除標準：(1)合并糖尿病、冠心病等基礎(chǔ)疾病者；(2)重要器官功能不全者；(3)合并其他慢性肺功能疾病者；(4)合并其他惡性腫瘤疾病者。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有患者性別、年齡、吸煙史等一般資料，同時收集其病理類型、腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床資料。對所有患者進行為期兩年的隨訪，隨訪方式包括定期入院復(fù)查隨訪及電話隨訪。

1.2.2 NapsinA、CGA、CK7在肺癌組織及癌旁正常組織表達情況 取肺癌患者癌組織及臨近癌旁組織標本(距腫瘤邊緣5 cm處)[7]，以10%中性甲醛固定后脫水制成石蠟切片，采用免疫組織化學技術(shù)S-P法[8]檢測癌組織及癌旁正常組織中NapsinA、CGA、CK7的陽性表達。將癌組織和癌旁組織標本石蠟切片貼附于預(yù)涂有多聚賴氨酸的載玻片上，加熱至60 ℃烘烤2 h，梯度二甲苯脫蠟至水后浸泡，取出切片置于pH值為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中，加熱至100 ℃維持10 min后冷卻，pH值為7.4的枸櫞酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加兔抗NapsinA(貨號：ab129189，abcam公司)、CGA(貨號：ab92738，abcam公司)、CK7單克隆抗體(貨號：ab68459，abcam公司)，37 ℃條件下孵育1 h，pH值為7.4的枸櫞酸鹽緩沖液再次沖洗3次后滴加生物素標記的相應(yīng)山羊抗兔二抗，37 ℃條件下孵育40 min，pH值為7.4的枸櫞酸鹽緩沖液再次沖洗3次后滴加DAB顯色液，水洗后蘇木素復(fù)染30 s，蒸餾水沖洗5 min后梯度乙醇脫水后透明封片。

1.2.3 免疫組化結(jié)果進行判定 以枸櫞酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，已知肺癌陽性切片作為陽性對照對結(jié)果進行判定。NapsinA、CGA和CK7均定位于細胞質(zhì)中，當細胞質(zhì)被染色成黃色或棕黃色，且呈明顯顆粒狀視為陽性[9]。隨機選擇陽性細胞區(qū)域的10個高倍視野，結(jié)合陽性細胞占比和染色強度對染色結(jié)果進行評分，陽性細胞占比為0%記0分，1～10%記1分，11～50%記2分，50%以上記3分；染色強度無上色記0分，上色較弱記1分，上色程度中等記2分，上色程度較強記3分。總分=陽性細胞占比得分×染色強度得分，將總分為0分判定為陰性(-)，總分為1～2分判定為弱陽性(+)，總分為3～4分判定為陽性(++)，總分在4分以上判定位強陽性(+++)。

1.3 觀察指標

(1)肺癌組織及癌旁組織中NapsinA、CGA、CK7的表達；(2)NapsinA、CGA、CK7表達與臨床病理的關(guān)系；(3)NapsinA、CGA、CK7表達與預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織及癌旁組織中NapsinA、CGA、CK7的表達比較

NapsinA在肺癌組織中陽性率為62.39%，高于癌旁組織的21.10%(P<0.05)；CGA在肺癌組織中的陽性率為57.80%，高于癌旁組織中的27.52%(P<0.05)；CK7在肺癌組織中的陽性率為64.22%，高于癌旁組織的58.72%(P<0.05)。見表1及圖1。

表1 肺癌組織及癌旁正常組織中NapsinA、CGA、CK7的表達[n(%)]

2.2 NapsinA表達與臨床病理的關(guān)系

NapsinA表達與患者性別、年齡、有無吸煙史、治療方式和肺癌分化程度無關(guān)(P>0.05)；與病理類型、TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；病理類型為肺腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者肺組織內(nèi)NapsinA陽性表達率越高。見表2。

表2 NapsinA表達與臨床病理的關(guān)系[n(%)]

2.3 CGA表達與臨床病理的關(guān)系

CGA表達與患者性別、年齡、有無吸煙史、治療方式、肺癌分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)；與病理類型和TNM分期有關(guān)(P<0.05)；病理類型為大細胞癌、小細胞癌、TNM分期越晚的患者肺組織內(nèi)CGA陽性表達率越高。見表3。

表3 CGA表達與臨床病理的關(guān)系[n(%)]

2.4 CK7表達與臨床病理的關(guān)系

CK7表達與患者性別、年齡、有無吸煙史、治療方式和肺癌分化程度無關(guān)(P>0.05)；與病理類型、TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；病理類型為腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者肺組織內(nèi)CK7陽性表達率越高。見表4。

表4 CK7表達與臨床病理的關(guān)系[n(%)]

2.5 NapsinA、CGA、CK7表達與預(yù)后的關(guān)系

NapsinA陽性患者中位生存期為18個月，CGA陽性患者中位生存期為19個月，CK7陽性患者中位生存期為18個月，均低于NapsinA、CGA和CK7陰性的患者(P=0.001、0.001、0.003)。見圖2。

3 討論

NapsinA屬于天門冬氨酸水解蛋白酶家族中的一員，廣泛表達于II型肺泡表面上皮細胞和肺泡巨噬細胞表面[10]，通過其蛋白水解活性誘導(dǎo)肺表面活性蛋白的合成分泌，進而發(fā)揮維持肺形態(tài)和肺功能的作用[11]，已證實是肺腺癌診斷的特異性標志物[12]。CGA是酸性可溶蛋白的一種，由439個氨基酸分子組成，普遍存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細胞致密核心顆粒中[13]，被廣泛用作神經(jīng)內(nèi)分泌的標志物[14]。CK7是堿性細胞角蛋白的一種，相對分子量約為54 kDa，廣泛存在于正常組織移行上皮及腺山溝細胞內(nèi)，而在非上皮來源的細胞和組織中少量表達或不表達[15]，CK7既往常用于實體瘤轉(zhuǎn)移部位細胞來源的判斷和鑒別[16]。本研究中，肺癌組織NapsinA、CGA、CK7陽性表達高于癌旁組織(P<0.05)，原因可能在于隨著腫瘤進展的加劇，癌細胞不斷增殖、分化、發(fā)育，定位于細胞質(zhì)中的NapsinA、CGA和CK7等腫瘤標記物的表達也隨之發(fā)生變化，NapsinA、CGA和CK7在肺癌細胞質(zhì)中表達水平均隨著癌細胞的快速擴增而顯著增加，電鏡下表現(xiàn)出典型的棕黃色及深褐色顆粒狀染色，陽性細胞占比逐漸大，著色程度逐漸加深，表明NapsinA、CGA、CK7具有作為肺癌早期診斷腫瘤標志物的潛力，可將腫瘤組織和癌旁正常組織進行有效區(qū)分。本研究結(jié)果顯示，病理類型為肺腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者肺組織內(nèi)NapsinA陽性表達率越高；病理類型為大細胞癌、小細胞癌、TNM分期越晚的患者肺組織內(nèi)CGA陽性表達率越高；病理類型為腺癌、TNM分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者肺組織內(nèi)CK7陽性表達率越高。推測原因可能與NapsinA、CK7和CGA自身特性有關(guān)，NapsinA和CK7普遍表達于肺腺癌細胞中，而在鱗癌、小細胞癌等其他類型的肺癌細胞中很少表達或幾乎不表達。CGA主要與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤如大細胞癌、小細胞癌有關(guān)，在腺癌和鱗癌中幾乎不表達[17]，造成不同病理類型的肺癌患者NapsinA、CK7和CGA陽性率不同，表明NapsinA、CK7和CGA對肺癌病理類型的鑒別作用較好。而腫瘤分期越晚、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者肺癌進展越快，腫瘤細胞增殖加快，定位于肺癌細胞質(zhì)中的NapsinA、CK7和CGA陽性率隨之增加，最終導(dǎo)致NapsinA、CK7和CGA陽性率與病理類型、TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移均高度相關(guān)。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，NapsinA、CGA和CK7陽性患者中位生存期均低于NapsinA、CGA和CK7陰性的患者(P<0.05)。TNM分期越晚，腫瘤浸潤越嚴重，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移的可能性更高，肺癌惡性程度也隨之增加[18]，導(dǎo)致NapsinA、CGA和CK7陽性患者生存期更短，預(yù)后明顯低于陰性患者[19]。提示NapsinA、CGA和CK7陽性率不僅與患者的病理類型、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，還可以作為預(yù)測患者預(yù)后的有效分子，對于早期篩查以及預(yù)后評估均具有較好的價值，可能與NapsinA、CGA和CK7分子影響癌細胞增殖、凋亡等細胞周期的調(diào)控機制有關(guān)。NapsinA、CGA和CK7陽性表達增加不僅可影響肺癌細胞的適應(yīng)能力，導(dǎo)致癌細胞增殖加快，增加其粘附能力，還通過刺激細胞內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達誘導(dǎo)局部氧化應(yīng)激損傷，介導(dǎo)癌細胞凋亡抑制，最終加速肺癌進展[20]，影響患者預(yù)后。

綜上所述，與癌旁正常組織相比，肺癌組織中NapsinA、CGA、CK7陽性率更高，且陽性患者預(yù)后較陰性患者更差，與患者病理類型、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有關(guān)，臨床可加強對肺癌患者組織中NapsinA、CGA和CK7表達的監(jiān)測，以提高肺癌的檢出率，評估預(yù)后。