陸夢(mèng)如，釗巖，李何鵬，唐健，梁津瑜

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530007；2.濟(jì)南市第三人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250132)

重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)是一種自身免疫性疾病，主要是由于血液中出現(xiàn)多種不同成分抗體，此類抗體可對(duì)神經(jīng)-肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)造成損害，使得終板電位不足，繼而導(dǎo)致信號(hào)傳遞過程受阻，引發(fā)肌無(wú)力[1-2]。隨著病情的不斷惡化，患者逐漸出現(xiàn)眼瞼下垂、肢體無(wú)力、構(gòu)音障礙、吞咽困難等臨床表現(xiàn)，對(duì)患者的生活質(zhì)量和身心健康造成嚴(yán)重?fù)p害[3-5]。臨床上約80%的MG患者血清中可檢測(cè)到AChR-Ab，且不同分型MG患者血清中AChR-Ab滴度高低不等[6-8]。MG患者治療后，血清AChR-Ab抗體滴度降幅越大，臨床癥狀改善效果越佳，AChR-Ab水平變化對(duì)診斷及判斷MG患者病情嚴(yán)重程度具有重要的臨床意義[9]。MG患者通常伴有胸腺瘤，AChR-Ab和連接素抗體(titin antibodies，Titin-Ab)在神經(jīng)疾病的發(fā)生機(jī)制中至關(guān)重要，MG合并胸腺瘤的患者體內(nèi)AChR-Ab、Titin-Ab通常高度表達(dá)[10]。目前檢測(cè)出多種特異性抗體與MG的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。本研究擬探討血清AChR-Ab與Titin-Ab對(duì)MG患者的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性納入2019年6月至2021年6月廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院及濟(jì)南市第三人民醫(yī)院收治的86例MG患者作為研究對(duì)象(MG組)，并擇取同期80名健康體檢對(duì)象作為對(duì)照組。MG組中，男性54例，女性32例；年齡20～70歲，平均(43.92±8.73)歲；病程3 ～21個(gè)月，平均(18.34±6.28)個(gè)月。根據(jù)改良Osserman臨床分型分為眼肌型組51例，全身型組35例(ⅡA型8例，ⅡB型20例，Ⅲ型2例，Ⅳ型5例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)MG組患者均符合《中國(guó)重癥肌無(wú)力診斷和治療指南(2020版)》[12]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，伴有典型MG癥，低頻重復(fù)神經(jīng)電刺激波幅降幅>10%及新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性；(2)無(wú)膽堿酯酶抑制劑或其他免疫抑制治療史；(3)臨床資料完整；(4)未合并惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)由其他原因?qū)е碌难奂÷楸曰颊撸?2)Guillain-Baeea綜合征患者；(3)多發(fā)性肌炎、慢性脫髓鞘性多發(fā)神經(jīng)病患者；(4)臨床資料不完整無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)者；(5)因甲狀腺功能減退、亢進(jìn)癥及糖尿病等代謝性疾病導(dǎo)致眼肌麻痹和外周神經(jīng)病變的患者；(6)合并處于妊娠期、哺乳期的女性患者。對(duì)照組中，男性42名，女性38名；年齡22～79歲，平均(45.07±8.81)歲。兩組研究對(duì)象年齡、性別比例比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

采集所有研究對(duì)象治療前空腹肘靜脈血15 mL，經(jīng)離心處理后，置于-80 ℃環(huán)境中待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清Titin-Ab、AChR-Ab水平，首先在由聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體，而后通過抗體對(duì)待測(cè)抗原進(jìn)行識(shí)別，并使用辣根過氧化氫(horseradish peroxidase，HRP)、熒光或放射性標(biāo)記的抗體輸出識(shí)別信號(hào)，最后借助信號(hào)強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計(jì)算待測(cè)目標(biāo)抗原濃度。血清Titin-Ab和AChR-Ab檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)ThermoFier公司，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書執(zhí)行，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。結(jié)果判讀：血清Titin-Ab水平>15 U/mL視為Titin-Ab陽(yáng)性，AChR-Ab水平>0.469 nmol/L視為AChR-Ab陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MG組與對(duì)照組血清Titin-Ab與AChR-Ab陽(yáng)性率對(duì)比

MG組患者血清Titin-Ab、AChR-Ab陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 MG組與對(duì)照組血清Titin-Ab與AChR-Ab陽(yáng)性率比較[n(%)]

2.2 眼肌型組和全身型組患者血清Titin-Ab、AChR-Ab陽(yáng)性率對(duì)比

全身型組患者血清AChR-Ab陽(yáng)性率高于眼肌型組(P<0.05)，但兩組間血清Titin-Ab陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 眼肌型組和全身型組患者血清Titin-Ab與AChR-Ab陽(yáng)性率比較[n(%)]

2.3 全身型組中不同Osserman分型患者血清Titin-Ab、AChR-Ab陽(yáng)性率對(duì)比

35例MG全身型患者中，ⅡA型8例，ⅡB型20例，Ⅲ型+Ⅳ型7例，不同Osserman分型MG患者血清Titin-Ab和AChR-Ab陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 全身型組中不同Osserman分型患者血清Titin-Ab、AChR-Ab陽(yáng)性率對(duì)比 [n(%)]

2.4 血清Titin-Ab、AChR-Ab檢測(cè)對(duì)MG的診斷價(jià)值

兩指標(biāo)聯(lián)合診斷MG的靈敏度高于AChR-Ab、Titin-Ab單獨(dú)診斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.979,P<0.05)。見表4。

表4 血清Titin-Ab、AChR-Ab對(duì)MG的診斷價(jià)值(%)

3 討論

MG是一種由多種基因調(diào)控、多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、抗體及補(bǔ)體參與的獲得性免疫性疾病，主要對(duì)NMJ突觸后膜上的信號(hào)傳導(dǎo)造成影響，其中大部分由AChR-Ab介導(dǎo)，具有細(xì)胞免疫依賴性。MG的主要臨床表現(xiàn)為部分或全身骨骼肌無(wú)力和易疲勞，活動(dòng)后明顯加重，經(jīng)抗膽堿酯酶藥物治療后可減輕，臨床上多表現(xiàn)為晨輕暮重[13-14]。流行病學(xué)調(diào)查[15-16]顯示，目前全世界范圍約有70萬(wàn)MG患者，我國(guó)MG發(fā)病率約為0.68/10萬(wàn)。MG在各個(gè)年齡階段均可發(fā)病，并具有顯著的性別特征，女性發(fā)病率為0.76/10萬(wàn)，高于男性的0.60/10萬(wàn)。現(xiàn)階段關(guān)于MG的致病因素尚未完全明確，可能與患者自身免疫異常、環(huán)境及感染等多種因素相關(guān)。目前大部分學(xué)者認(rèn)同攜帶易感基因的個(gè)體極易在環(huán)境因素的影響下出現(xiàn)免疫異常，致使機(jī)體產(chǎn)生相關(guān)抗體攻擊NMJ，引發(fā)骨骼肌無(wú)力。MG不僅因?yàn)榧o(wú)力會(huì)對(duì)患者的運(yùn)動(dòng)造成影響，甚至殘疾，隨著病情的進(jìn)展還會(huì)對(duì)患者的心臟功能產(chǎn)生不良影響，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致死亡。

AChR-Ab是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的診斷MG的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。人類肌肉中存在兩種類型的AChR，胎兒型的亞基組成與成人型的亞基組成存在差異。大多數(shù)AChR-Ab的病理表型為IgG1、IgG3亞型，兩種亞型的AChR-Ab均可通過與突觸后膜上的AChR相結(jié)合來(lái)激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使突觸后膜受體數(shù)量減少，進(jìn)而阻斷骨骼肌間神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，MG組患者血清AChR-Ab陽(yáng)性率高于對(duì)照組，且MG組中全身型組患者AChR-Ab陽(yáng)性率高于眼肌型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。既往研究[17-18]顯示，超過85%的全身型MG患者和50%的眼肌型MG患者體內(nèi)AChR-Ab含量均升高，與本研究結(jié)果一致。但是，本研究顯示全身型組內(nèi)ⅡA型，ⅡB型，Ⅲ型+Ⅳ型患者之間血清AChR-Ab陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與各亞組之間患者血清AChR-Ab陽(yáng)性率均已較高有關(guān)。

在MG的發(fā)病過程中，除AChR-Ab之外，遺傳因素、細(xì)胞因子、細(xì)胞免疫、自身抗體作用、補(bǔ)體作用及胸腺異常等多種因素參與。MG患者血清中還可能存在蘭尼堿受體鈣釋放通道抗體(RyR)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋 白4(LRP4) 抗體和骨骼肌受體酪氨酸激酶特異性抗體(Musk)異常，血清中檢測(cè)不到抗體的患者稱為血清抗體陰性MG。同為骨骼肌抗體的Titin-Ab在MG患者中表現(xiàn)出更高的陽(yáng)性[19-20]。Titin是所有已知的蛋白中較大的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為3 000 kD，在肌纖維中起到構(gòu)建蛋白、維持肌絲張力和拉力彈性等作用。大多數(shù)Titin-Ab抗體識(shí)別titin蛋白的特定區(qū)域。Titin-Ab對(duì)MG的特異性和敏感性較高，對(duì)MG疾病診斷、治療及預(yù)后評(píng)估均具有較高的臨床價(jià)值[21-22]。本研究結(jié)果顯示，MG組患者血清Titin-Ab陽(yáng)性率高于對(duì)照組，但是，全身型組和眼肌型組患者之間，以及全身型組內(nèi)ⅡA型，ⅡB型，Ⅲ型+Ⅳ型患者之間血清Titin-Ab陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。既往研究發(fā)現(xiàn)伴有MG的胸腺瘤組織中存在Titin mRNA片段的表達(dá)，能編碼MIR及I帶抗原。這些抗原能致敏T淋巴細(xì)胞，正常胸腺組織中，致敏的T細(xì)胞能被清除，然而胸腺病變的組織中則可能引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞的激活并產(chǎn)生抗體。這就證實(shí)了胸腺瘤組織中微環(huán)境的改變能引起自身免疫翻譯清除機(jī)制發(fā)生障礙，產(chǎn)生Titin抗體。血清Titin-Ab可用于臨床輔助MG診斷，有望成為早期診斷MG和評(píng)估MG預(yù)后情況的新型免疫性指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，兩指標(biāo)聯(lián)合診斷MG的靈敏度高于AChR-Ab、Titin-Ab單獨(dú)診斷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明血清Titin-Ab、AChR-Ab對(duì)MG均具有一定的診斷價(jià)值，兩者聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高靈敏度，有利于輔助臨床評(píng)估MG患者疾病嚴(yán)重程度，盡早采取相應(yīng)措施防止病情進(jìn)一步惡化。本研究還存在較大局限性，樣本量較小，有待進(jìn)一步擴(kuò)大化研究驗(yàn)證結(jié)論，另一方面本研究?jī)H應(yīng)用ELISA法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，后續(xù)研究中可采用放射免疫法、免疫印跡法等對(duì)指標(biāo)進(jìn)行多技術(shù)檢測(cè)以提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，并明確以上指標(biāo)對(duì)不同MG亞型的診斷價(jià)值。

綜上所述，MG患者血清Titin-Ab和AChR-Ab陽(yáng)性率升高，兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，對(duì)MG診斷具有較高的靈敏度及準(zhǔn)確率。