周奇，王衛(wèi)東

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院介入科，江蘇 無(wú)錫 214002)

膽管癌是惡性程度、死亡率均較高的惡性腫瘤，來(lái)源于膽管體系上皮細(xì)胞。隨著現(xiàn)階段醫(yī)療技術(shù)水平的不斷提高，膽管癌臨床發(fā)現(xiàn)率也在逐年增加，在消化系統(tǒng)檢出惡性腫瘤中增長(zhǎng)最快，居膽道惡性腫瘤第二位，占消化系統(tǒng)惡性腫瘤3%[1]。然而，因膽管癌解剖特殊性，再加上腫瘤惡性程度高，早期缺乏特殊臨床癥狀及特異性檢查手段，疾病起病較為隱匿，早期診斷較為困難，不少膽管癌患者檢出腫瘤時(shí)已出現(xiàn)局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]?，F(xiàn)階段，生物治療已成為膽管癌最具前景的治療策略之一，尋找有效的治療靶點(diǎn)將直接決定生物治療前景[3]。游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAS)是機(jī)體重要代謝物質(zhì)，通過CD36等轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而參與多種生理過程。游離脂肪酸受體4 (free fatty acid receptor 4，F(xiàn)FAR4)即FFAS激活的膜受體之一，又被稱為G蛋白偶聯(lián)受體120，屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors，GPCR)，GPCR表達(dá)失調(diào)與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。肝癌衍生生長(zhǎng)因子(hepatoma-derived growth factor，HDGF)是來(lái)源于人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系的肝素結(jié)合蛋白，在多種胚胎組織中高表達(dá)，參與調(diào)控腎、肺、肝、消化道、心血管等組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)。本研究分析膽管癌癌組織中FFAR4、HDGF的表達(dá)水平，從臨床病理特征及生存情況層面進(jìn)行綜合分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2020年1月南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院80例具有完整生存資料的膽管癌患者膽管癌組織(離腫瘤邊緣向內(nèi)至少1 cm)作為研究對(duì)象，均為術(shù)前未通過化放療或其它特殊治療的膽管癌組織標(biāo)本。所有患者中，男性47例，女性33例；年齡41～78歲，平均(61.54±7.93)歲；腫瘤部位：肝門43例，中下段37例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期37例；病理分化程度：高分化27例，中分化24例，低分化29例。另外取40例行膽管癌根治性手術(shù)患者的癌旁膽管組織作為對(duì)照組(距腫瘤邊緣>3 cm的癌旁膽管組織)，經(jīng)病理確認(rèn)為正常組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合肝門部膽管癌規(guī)范化診治專家共識(shí)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，經(jīng)病理活檢證實(shí)為原發(fā)性膽管癌，于南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院初治；(2)年齡≥18歲；(3)術(shù)前未接受過放化療以及其他生物治療；(4)無(wú)其他腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并自身免疫或血液疾病；(2)合并重要臟器功能障礙；(3)合并其他惡性腫瘤；(4)臨床資料不完整。

1.2 資料收集

收集患者基礎(chǔ)臨床資料，調(diào)查員均經(jīng)統(tǒng)一規(guī)范培訓(xùn)，經(jīng)考核合格后擔(dān)任，對(duì)漏填、錯(cuò)填情況立即補(bǔ)充完成，確保原始資料有效性。一般情況包括性別、年齡等；疾病資料包括腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、神經(jīng)侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。

1.3 儀器與試劑

儀器：石蠟切片機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，S700A)、恒溫水浴箱(上海恒奇儀器儀表有限公司，TX150)、電熱恒溫干燥箱(上海滬升實(shí)驗(yàn)儀器，H/HWHS-100L)、光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯，BX-50)；試劑：FFAR4兔抗人多克隆抗體、HDGF兔抗人多克隆抗體(美國(guó)Immuno Way公司)，SP試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)緩沖液、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)、檸檬酸緩沖液均由北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供。

1.4 方法

取患者組織標(biāo)本，4 μm厚切片，烘烤(60 ℃、20 min)，使用二甲苯脫蠟處理，并使用梯度酒精脫水，PBS清洗(3次)，去離子水沖洗，室溫下，H2O2阻斷(10 min)，PBS清洗(3次)，抗原熱修復(fù)，再次PBS清洗(3次)。置切片于10%的牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)下，孵育(室溫、5 min)，封閉非特異性位點(diǎn)，加入一抗， 孵育(4 ℃、過夜)，PBS清洗(3次)。滴加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素(streptavidin，SP)，孵育(37 ℃、30 min)，PBS清洗(3次)，DAB顯色(10 min)，PBS清洗(3次)，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水(10 min)，進(jìn)行封片，鏡下觀察。

由兩位病理科醫(yī)師光學(xué)顯微鏡下獨(dú)立閱片分析，確定染色與蛋白表達(dá)情況，閱片者閱片和分析前均不了解研究對(duì)象臨床資料，判定結(jié)果意見存在分歧時(shí)經(jīng)協(xié)商達(dá)成一致結(jié)論。高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，注意保證每一視野可觀察細(xì)胞數(shù)≥200個(gè)，F(xiàn)FAR4主要定位于腫瘤組織細(xì)胞質(zhì)中，HDGF主要定位于腫瘤組織細(xì)胞核中，依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和比例評(píng)估[6]：著色：無(wú)、淡黃、棕黃、棕褐分別計(jì)0分、1分、2分、3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例：陰性、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別計(jì)0分、1分、2分、3分、4分；參照著色程度與陽(yáng)性細(xì)胞比例乘積進(jìn)行分級(jí)，<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料通過[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；通過Kaplain-Maier方法描繪生存曲線，計(jì)算生存率，并用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FFAR4、HDGF蛋白在膽管癌組織中的表達(dá)

膽管癌組織FFAR4蛋白、HDGF蛋白高表達(dá)率分別為65.00%、83.75%，高于癌旁組織的17.50%、27.50%(P<0.05)。見表1及圖1。

表1 FFAR4、HDGF蛋白在膽管癌組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 膽管癌組織中FFAR4、HDGF蛋白表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系

不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、神經(jīng)侵犯情況膽管癌組織中FFAR4、HDGF蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低分化、臨床分期Ⅲ-Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者膽管癌組織中FFAR4、HDGF蛋白表達(dá)水平高于中高分化、臨床分期Ⅰ-Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。見表2。

表2 膽管癌組織中FFAR4、HDGF蛋白表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系

2.3 影響膽管癌組織FFAR4、HDGF蛋白表達(dá)的Logistic回歸分析

將上述因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義項(xiàng)納入多因素Logistic回歸模型，以FFAR4、HDGF蛋白情況作為因變量，F(xiàn)FAR4蛋白(低表達(dá)=0，高表達(dá)=1)，HDGF蛋白(低表達(dá)=0，高表達(dá)=1)，以上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義項(xiàng)作為自變量，并進(jìn)行賦值，分化程度(中高分化=0，低分化=1)、臨床分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(陰性=0，陽(yáng)性=1)，Logisitic回歸分析顯示臨床分期高、分化程度低、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是FFAR4、HDGF蛋白高表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響膽管癌組織FFAR4、HDGF蛋白表達(dá)的Logistic回歸分析

2.4 膽管癌癌組織中FFAR4、HDGF蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系分析

隨訪兩年，根據(jù)隨訪情況，繪制兩年無(wú)進(jìn)展生存曲線和總生存曲線，F(xiàn)FAR4蛋白、HDGF蛋白高表達(dá)患者兩年總生存率分別為50.00%(26/52)、55.22%(37/67)，低于FFAR4蛋白、HDGF蛋白低表達(dá)患者的78.57%(22/28)、84.62%(11/13)(P<0.05)。FFAR4蛋白、HDGF蛋白高表達(dá)患者兩年無(wú)進(jìn)展生存率分別為42.31%(22/52)、47.76%(32/67)，低于FFAR4蛋白、HDGF蛋白低表達(dá)患者71.73%(20/28)、76.92%(10/13)(P<0.05)。見圖2-圖5。

3 討論

膽管癌臨床治療以手術(shù)切除為主，但由于疾病臨床癥狀與體征出現(xiàn)較晚，缺乏特征性，早期診斷較為困難，疾病確診往往已達(dá)中晚期，預(yù)后較差，深入探討膽管癌發(fā)生及發(fā)展機(jī)制，尋找治療新靶點(diǎn)，對(duì)預(yù)防膽管癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有重要價(jià)值[7～8]。

FFAR4屬于GPCR超家族中視紫紅質(zhì)受體家族，激活后可通過Gq/11磷脂酰肌醇、Gα/ 環(huán)腺苷酸信號(hào)通路調(diào)控激素分泌以及細(xì)胞分化；此外，F(xiàn)FAR4通過β抑制蛋白2激活信號(hào)通路，抑制炎癥激活[9]。Cui等[10]發(fā)現(xiàn)，人結(jié)直腸癌中FFAR4的表達(dá)顯著高于癌旁組織，并與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。本研究也顯示膽管癌組織中FFAR4蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織，這可能是由于FFAR4高表達(dá)刺激IκBα第32位絲氨酸磷酸化，誘導(dǎo)PI3K/ AKT-NF-KB通路，增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、白介素-8、前列腺素E2等的分泌，促進(jìn)膽管癌組織血管生成[11]。本研究還顯示，F(xiàn)FAR4蛋白表達(dá)與膽管癌患者臨床分期、組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示FFAR4可能參與了膽管癌發(fā)生發(fā)展過程，究其原因可能為：膽管癌組織FFAR4異常高表達(dá)會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，觸發(fā)一系列胞內(nèi)信號(hào)改變，最終促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，誘發(fā)血管生成及轉(zhuǎn)移等惡性細(xì)胞生物學(xué)行為[12]。本研究中FFAR4高低表達(dá)患者2年總生存率、2年無(wú)進(jìn)展生存率低于FFAR4低表達(dá)患者，提示FFAR4表達(dá)可作為評(píng)估膽管癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)研究[13]表明，HDGF是肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，生物學(xué)功能廣泛，如有絲分裂活性、血管生成等。HDGF過表達(dá)狀態(tài)下，通過結(jié)合體內(nèi)血管生成活性，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，形成腫瘤。本研究中膽管癌組織細(xì)胞較癌旁組織HDGF明顯呈現(xiàn)高表達(dá)，可能是因?yàn)椋阂环矫鍴DGF是促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的有效因子，可促進(jìn)多種組織細(xì)胞增殖分化；另一方面腫瘤細(xì)胞增殖依靠豐富血供，HDGF能促進(jìn)腫瘤增殖及血管生長(zhǎng)，參與腫瘤微血管形成；此外，HDGF過表達(dá)降低Fas表達(dá)活性，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞凋亡。體外研究報(bào)道[14]指出干擾或中和HDGF可顯著抑制腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。本研究分析膽管癌組織中HDGF蛋白表達(dá)水平與腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病理特征相關(guān)，推測(cè)HDGF促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。在膽管癌發(fā)展過程中，各種生長(zhǎng)因子參與細(xì)胞增殖、分裂過程，HDGF高表達(dá)可激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑，促使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子分泌上調(diào)、微血管密度增加，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成，加速腫瘤生長(zhǎng)，并為其血行轉(zhuǎn)移提供條件[15]。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)HDGF高表達(dá)膽管癌患者，兩年無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率較低，預(yù)后較差，這些結(jié)果提示HDGF高表達(dá)可作為判斷膽管癌不良預(yù)后的標(biāo)志物之一，對(duì)患者預(yù)后評(píng)估具有一定指導(dǎo)價(jià)值。本研究分析了膽管癌組織FFAR4、HDGF表達(dá)與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，但并未通過體外研究明確在 FFAR4、HDGF基因敲低情況下人源性膽管癌細(xì)胞增殖、殺傷及遷移能力變化，后續(xù)尚需對(duì)FFAR4、HDGF在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用和作用機(jī)制作進(jìn)一步研究。

綜上，膽管癌組織FFAR4、HDGF呈現(xiàn)高表達(dá)，且其高表達(dá)水平與腫瘤分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，預(yù)示患者不良預(yù)后，二者在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此，干擾FFAR4、HDGF表達(dá)可能是一個(gè)膽管癌治療靶點(diǎn)之一。