李向龍 張中保 張春 鄭登俞 王作平 吳忠義

摘要：為探討花粉管通道法加聚乙二醇（PEG）介導、加細胞穿膜肽（CPPs）介導與直接導入外源基因3種方式間的轉化率差異，對2種玉米自交系材料京2416和京92進行花粉管通道法轉化并統(tǒng)計分析。結果表明，3種方式均能獲得草甘膦抗性植株，在京2416受體中PEG介導較直接導入高0.45百分點，CPPs介導的較直接導入的高0.66百分點，三者間轉化率差異達顯著或極顯著水平;對T0代草甘膦抗性植株PCR進行檢測，發(fā)現因外源基因丟失或沉默，草甘膦抗性植株未必都含有目的基因，因此田間篩選應與PCR檢測相結合;北京市農林科學院房山轉基因基地轉化驗證結果發(fā)現3種導入方式其草甘膦抗性率和轉化率高低順序一致，均為CPPs介導>PEG介導>對照，與海南省三亞市崖城基地轉化相同，且CPPs介導和PEG介導二者間差異極顯著，京2416中二者相差0.26百分點，京92中相差0.36百分點。因此，在花粉管通道法轉化玉米過程中加入介導物質有助于提高轉化率，且加CPPs比加PEG更具有優(yōu)勢。

關鍵詞：玉米;花粉管通道法;介導物質;轉化率;比較分析

中圖分類號：S513.032 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0091-04

收稿日期：2021-08-19

基金項目：北京市農林科學院科技創(chuàng)新能力建設專項（編號：KJCX20200603、KJCX20200205、KJCX20200407）。

作者簡介：李向龍（1981—），男，內蒙古磴口人，碩士，助理研究員，主要從事玉米遺傳育種研究。E-mail：long8888380@126.com。

通信作者：吳忠義，研究員，博士生導師，主要從事玉米分子育種研究。E-mail：zwu22@126.com。

隨著轉基因技術的不斷成熟，眾多轉化方法在玉米遺傳轉化中發(fā)揮了重要的作用。自周光宇報道花粉管通道法轉基因技術以來[1]，該技術在國內被廣泛應用，目前已在水稻、小麥等多種作物中應用，并獲得轉基因陽性株系[2-5]。研究者在玉米中利用花粉管通道法進行轉化時，多以在授粉后的玉米花絲上直接加外源基因為主，但轉化效率不理想。隨著研究的深入，該方法逐漸被優(yōu)化，如在轉化過程中添加聚乙二醇（polyethylene-glycol，PEG）或細胞穿膜肽（cell penetrating peptides，CPPs）作為介導物質，來提高其轉化率。由于PEG作為一種細胞融合劑，可引起細胞膜表面電荷的紊亂并干擾細胞間的識別，從而介導細胞間融合或外源DNA分子進入原生質體[6]，而CPPs作為小分子多肽，可攜帶疏水性大分子（如DNA）進行跨膜轉運并將其帶入細胞[7]。目前劉銅等用這2種方式進行介導轉化，均獲得了陽性植株[8-9]，但二者與直接加外源基因進行導入的轉化效率是否存在差異尚未見報道。本研究以直接滴入外源DNA溶液為對照，通過添加CPPs和PEG等2種方式與對照組進行轉化率差異比較，確定花粉管通道法的最佳導入方法，以期為該方法在玉米遺傳轉化應用中獲得較高轉化率提供技術參考和指導。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 試驗材料 用于轉化的玉米自交系為京2416和京92，由筆者所在課題組的實驗室保存。

1.1.2 試驗時間及地點 018年初在海南省三亞市崖城基地（簡稱“崖城基地”）進行花粉管通道法轉化，2018年6月在北京市農林科學院房山轉基因基地（簡稱“房山基地”）播種T0代，噴施草甘膦除草劑，并對抗性植株自交授粉;為驗證試驗結果，2018年7月在北京基地再次進行轉化，11月將轉化種子在崖城基地進行篩選和檢測。

1.1.3 外源DNA制備 60 ng/μL含抗草甘膦Epsps基因的外源DNA溶液由筆者所在實驗室制備并保存。

1.1.4 試驗試劑 1 mg/mL CPPs由筆者所在實驗室構建并保存;PEG粉劑由生工生物工程（上海）股份有限公司提供;1 mol/L CaCl2溶液由上海金穗生物科技有限公司提供;除草劑選用美國孟山都公司研制的41%草甘膦異丙胺鹽水劑（農達，Rroundup）。

1.2 轉化流程及導入方式

花粉管通道法的轉化流程為玉米雌穗未吐絲前先套袋，待花絲長至8～10 cm時進行自交授粉并套袋，依據前期對兩受體材料轉化時間經驗，授粉18 h后將雌穗頂部苞葉和花絲同時剪去，為防止溶液外流，將切口處苞葉內花絲剪成凹口再進行滴入。

1.2.1 直接導入 以直接滴入外源DNA溶液為對照，轉化時將溶液稀釋至30 ng/μL，滴入360 μL，每個受體轉化15穗，重復3次。

1.2.2 PEG介導 在50 mL離心管中先加入 4 g PEG、14.6 mL滅菌超純水和0.4 mL的1 mol/L CaCl2，再和外源DNA溶液等體積混勻后進行導入。轉化溶液終濃度、滴入量、轉化穗數及重復次數同“1.2.1”節(jié)。

1.2.3 CPPs介導 將CPPs和外源DNA溶液等體積混合后進行導入。轉化溶液終濃度、滴入量、轉化穗數及重復次數同“1.2.1”節(jié)。

1.3 轉化后代草甘膦篩選

轉化獲得的T0、T1代種子，人工開溝條播，行長4 m，行距30 cm，3次重復。待幼苗生長至3葉1心期噴施草甘膦除草劑，濃度為200 mg/L。噴藥前統(tǒng)計出苗數，噴藥后觀察其藥害反應及抗性，10 d后調查抗性株數，統(tǒng)計草甘膦抗性率。

抗性率=抗性植株數/出苗植株數×100%。

1.4 目的基因的PCR檢測

采用CTAB法[10]提取3種方式獲得的T0、T1代草甘膦抗性植株DNA進行PCR擴增，用于轉基因抗性植株檢測的PCR上游引物為5′-ACAGCACCTTCATCGGCGACGCCTC-3′，下游引物為5′-GCATCTTTCCGTATGATAGGGCATC-3′，目標片段長度為292 bp。PCR擴增體系為20 μL，擴增程序為：95 ℃ ?min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán);72 ℃延伸7 min，獲得PCR產物。對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測Epsps基因，根據目的基因陽性條帶的植株來統(tǒng)計3種導入方式的轉化率。

轉化率=陽性植株數/出苗植株數×100%。

1.5 數據處理

用Microsoft Excel 007軟件和DPS軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同導入方式對幼苗草甘膦抗性表型

由圖1可知，植株對草甘膦藥害反應表現一致，抗性植株葉色及長勢正常，不抗植株葉片先變紫，再變黃，最后整株干枯死亡。對比田間篩選結果，發(fā)現3種方式草甘膦抗性植株和無抗性植株差異特別明顯，且PEG介導和CPPs介導等2種導入方式獲得的抗性植株表現與對照沒有差異;2個受體轉化后代對草甘膦藥害反應一致，抗性植株未出現藥害，葉色鮮綠，植株生長未受影響。

2.2 不同導入方式T0代草甘膦抗性差異比較

由表1可知，T0代2個受體材料間出苗數相差較大，主要是由二者間雌穗結實粒數不同造成的。3種方式在房山基地篩選，都獲得了草甘膦抗性植株，它們在2個受體內的抗性率變化趨勢表現一致，均以加CPPs介導最高，分別為1.12%、1.27%;PEG介導轉化法次之，分別為0.91%、0.95%;對照最低，均不高于0.46%。經過方差分析可知，CPPs介導和PEG介導之間的抗性率在2個受體中分別相差0.21、0.32百分點，達顯著和極顯著水平;2種方式與對照間抗性率差異達極顯著水平，在京2416受體中與對照相比分別高0.66、0.45百分點，在京92受體中分別高0.82、0.50百分點。可見，3種導入方式之間存在差異，且加入介導物質后有助于提升花粉管通道法的轉化效率。

2.3 T0代草甘膦抗性植株Epsps基因的PCR檢測

以受體基因組DNA和水為陰性對照，質粒為陽性對照，對房山基地篩選得到的T0代草甘膦抗性植株進行Epsps基因的PCR檢測。由圖2可知，陰性對照和水均未出現特異性條帶，21株抗草甘膦植株得到的陽性片段中有11株約為292 bp的條帶，與目的基因條帶大小一致，初步證明外源目的基因已成功整合到京92轉基因植株基因組中。

2.4 不同導入方式轉化率差異比較

通過對3種導入方式獲得的T0代草甘膦抗性植株進行PCR檢測，平均轉化率結果見表2。結合表1和表2可知，3種方式的草甘膦抗性株獲得Epsps目的基因陽性條帶數量略有減少，可能與基因的丟失或沉默有關，說明田間篩選應和室內篩選相結合，以增加結果的可靠性。通過方差分析可知，三者在受體間的轉化率高低順序一致，依次為CPPs介導>PEG介導>對照，CPPs、PEG分別比對照高0.63、0.37百分點;同時對PEG和CPPs等2種導入方式進行比較，發(fā)現京2416用CPPs介導的平均轉化率為0.89%，較PEG介導顯著高0.26百分點，京92用CPPs介導的轉化率為1.09%，較PEG介導極顯著高0.36百分點，進一步說明花粉管通道法轉化中用CPPs介導的轉化率高于PEG介導的轉化率。

2.5 不同導入方式對受體轉化率的驗證

為進一步驗證上述試驗結果，2018年7月在北京基地繼續(xù)以京2416和京92為受體，用3種導入方式對2種材料進行花粉管通道轉化，獲得的T0代種子在崖城基地播種后進行草甘膦篩選，取抗性植株的葉片在實驗室內進行PCR檢測（表3）。

由方差分析結果（表3）可知，3種導入方式在崖城基地獲得的T0代植株草甘膦平均抗性率在受體間表現與在房山基地一致，由高到低依次為CPPs介導>PEG介導>對照，且三者間差異達極顯著水平;平均轉化率變化與之相似，CPPs介導和PEG介導等2種方法顯著高于對照，京2416受體中分別高0.61、0.27百分點，京92受體中分別高0.74、0.37百分點，這進一步驗證了花粉管通道法在進行玉米遺傳轉化時，加入介導物質可顯著提高其轉化效率，且CPPs介導轉化率高于PEG介導。

3 結論與討論

本研究在采用花粉管通道法轉化的基礎上，通過外加CPPs、PEG輔助和DNA溶液直接導入3種方式均獲得了草甘膦抗性玉米植株，且三者之間存在顯著或極顯著差異，說明花粉管通道法在轉化時加入CPPs或PEG介導物質有助于提高其轉化效率。3種導入方式均有抗草甘膦除草劑的植株，但是PCR檢測后含有目的基因的陽性植株有所減少，說明草甘膦除草劑篩選出的抗性植株還要結合PCR檢測，這樣才能確保轉化篩選結果的可靠性。

PEG介導、CPPs介導和直接滴入3種導入方法最終都獲得了含Epsps基因的抗性植株，但三者之間有差異，加介導物質的轉化率要高于對照，CPPs介導和PEG介導相比，前者可以獲得更高的轉化率，京2416中二者相差0.26百分點，京92中則相差0.36百分點，說明花粉管通道法在進行玉米轉化時要加入介導物質，且以CPPs介導最佳。

在崖城基地對房山基地轉化的T0代材料進行篩選驗證，發(fā)現3種導入方式的除草劑抗性及遺傳轉化率高低順序未發(fā)生變化，三者間差異達極顯著水平。本試驗為2地2季的統(tǒng)計結果，3種方式在受體間的差異還有待進一步驗證。

花粉管通道法利用植物授粉后所形成的花粉管通道將外源DNA攜帶入胚囊，其優(yōu)點是不再依賴組培再生植株，操作簡單，常規(guī)育種工作者易于掌握[11]。在玉米轉化過程中，其轉化率除受外界環(huán)境因素影響外，更主要的影響因素是轉化方法本身，筆者所在課題組在多年的實際操作中發(fā)現加入介導物質可提高玉米的遺傳轉化效率。

本研究采用的3種導入方法都能獲得草甘膦抗性植株，但PCR檢測時仍存在無陽性條帶的現象，可能是外源DNA進入受體細胞后，在遺傳過程中會被細胞中的核酸酶逐漸降解，進而使得基因沉默或丟失，最終導致目的基因不能都在草甘膦抗性植株中表達，說明在進行轉基因陽性植株檢測時，除草劑篩選要和PCR檢測相互結合起來，避免假陽性的出現。

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