徐思琪 張世勇 陳校輝 王明華 鐘立強(qiáng) 李聯(lián)泰 邊文冀

摘要：為建立一種準(zhǔn)確和快速鑒定斑點叉尾遺傳性別方法，根據(jù)其性別連鎖SNP（single nucleotide polymorphism）位點，設(shè)計外圍引物、SNP特異性延伸引物和DNA探針。性別連鎖SNP特異性引物延伸反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增終產(chǎn)物與DNA探針雜交，并應(yīng)用基于免疫膠體金技術(shù)的核酸檢測試紙檢測性別連鎖SNP，從而實現(xiàn)遺傳性別分子水平的可視化鑒定。結(jié)果顯示，該方法能夠準(zhǔn)確地鑒定斑點叉尾的遺傳性別，與基于性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法所得結(jié)果一致，表明斑點叉尾性別連鎖SNP特異性引物延伸反應(yīng)聯(lián)合基于免疫膠體金技術(shù)的核酸試紙能夠準(zhǔn)確、快速地完成斑點叉尾的遺傳性別鑒定。

關(guān)鍵詞：斑點叉尾;遺傳性別鑒定;特異性引物延伸反應(yīng);性別連鎖SNP;免疫膠體金

中圖分類號： S965.128文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0189-05

收稿日期：2021-08-17

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項目（編號：PZCZ201741）;國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-46）;江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20191487）。

作者簡介：徐思琪（1996—），女，吉林通化人，碩士研究生，研究方向為魚類遺傳育種。E-mail：121972467@qq.com。

通信作者：張世勇，E-mail：shiyongzhang@hotmail.com;邊文冀，E-mail：js6060@sina.com。

斑點叉尾（Ictalurus punctatus）隸屬鲇形目科，原產(chǎn)于北美，是一種世界性淡水養(yǎng)殖魚類[1]。由于斑點叉尾對不同環(huán)境有較強(qiáng)適應(yīng)能力，已引種至多個國家開展人工養(yǎng)殖。我國于1984年首次引種斑點叉尾，此后30余年間，根據(jù)其生物學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)的本土化研究，極大地促進(jìn)了我國斑點叉尾產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。斑點叉尾雌雄魚生長具有較大差異，雌魚達(dá)到一定規(guī)格后，生長減慢，卵巢發(fā)育加快，較大的卵巢組織一定程度上降低了其食用比例，導(dǎo)致雌魚的市場需求不高[3]。因此，為提高斑點叉尾養(yǎng)殖效益，有必要開展全雄品種選育研究。

性逆轉(zhuǎn)是培育魚類全雄或全雌品種的必要途徑，性逆轉(zhuǎn)的開展要求精準(zhǔn)的遺傳性別鑒定方法予以輔助。隨著分子標(biāo)記技術(shù)在魚類中的應(yīng)用，已鑒別出大量魚類RFLP（restriction fragment length polymorphism）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、SSR（simple sequence repeats）、SNP（single nucleotide polymorphism）等性別特異性分子標(biāo)記。1991年，Devlin等采用RFLP分子標(biāo)記技術(shù)首次獲得大鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）性別特異分子標(biāo)記[4]。使用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)鑒定出性別特異分子標(biāo)記的物種主要有虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[5]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[6]等;AFLP分子標(biāo)記技術(shù)鑒定出性別特異分子標(biāo)記的物種主要有：三刺魚（Gasterosteus aculeatus）[7]、金槍魚（Thunnus orientalis）[8]等;SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定出性別特異分子標(biāo)記的物種主要有：尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[9]、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[10]、斑點叉尾[11]等。隨著高通量測序技術(shù)地進(jìn)步，基于測序技術(shù)篩選性別特異性分子標(biāo)記已成為目前最主流的方法。近年，基于高通量測序技術(shù)陸續(xù)在大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossus）[12]、大口鲇（Silurus meridionalis）[13]、斑點叉尾[14]等物種中鑒定出多個性別連鎖SNPs標(biāo)記。根據(jù)魚類性別特異性分子標(biāo)記開發(fā)出多種遺傳性別鑒定方法，但大部分性別鑒定方法耗時、耗力，且需要借助較為精密的儀器。

將性別連鎖SNP特異性引物延伸反應(yīng)與基于免疫膠體金技術(shù)的核酸檢測試紙相結(jié)合，鑒定魚類遺傳性別的方法目前尚未見報道。本研究基于筆者所在課題組前期開發(fā)的斑點叉尾性別連鎖SNP標(biāo)記[14]，設(shè)計SNP位點特異性延伸反應(yīng)引物，并聯(lián)合基于免疫膠體金技術(shù)的核酸檢測試紙，首次建立了快速鑒定斑點叉尾遺傳性別方法。該方法不僅能夠高效、準(zhǔn)確地鑒定出斑點叉尾遺傳性別，還能夠為其他物種遺傳性別鑒定方法的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的試驗魚來自國家級江蘇斑點叉尾遺傳育種中心揚中基地培育的斑點叉尾G3代選育群體。采集180日齡雌雄斑點叉尾各10尾，MS-222（Merck公司，德國）麻醉后解剖，根據(jù)其性腺記錄其性別信息，同時，剪取部分尾鰭組織于1.5 mL離心管中，加入無水乙醇保存。

1.2 基因組DNA提取

取20 mg尾鰭組織，剪碎后置于1.5 mL離心管中。使用DNA Isolation Mini Kit試劑盒（南京諾維贊生物科技有限公司）提取基因組DNA，操作過程按照說明書進(jìn)行。利用Qubit熒光光度計（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）評估DNA質(zhì)量，并在0.6%瓊脂糖凝膠上電泳檢測其完整性。合格的DNA樣本于-20 ℃保存。

1.3 引物設(shè)計

應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫Primer BLAST在線軟件設(shè)計擴(kuò)增斑點叉尾性別連鎖SNP位點（scaffold99_205834 G>A）[14]的外圍引物（WF/WR）、特異性延伸引物（ASE）和DNA探針（ASE-DP）;使用Oligo軟件檢驗ASE引物與DNA探針二級結(jié)構(gòu)間相互關(guān)系，避免產(chǎn)生二聚體。ASE引物3′端最后一個位點為雄性特異性堿基，5′端用6-羧基熒光素（6-FAM）熒光基團(tuán)標(biāo)記，DNA探針3′端用生物素（Biotin）標(biāo)記，引物及探針的合成和標(biāo)記委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成，序列見表1。3FA4C0FF-2B1A-47A8-BBFA-EB7E822326D4

1.4 巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)

第1輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增斑點叉尾性別連鎖SNP位點（scaffold99_205834 G>A）。反應(yīng)總體系：40 μL，其中，2×Phanta Max Master Mix 0 μL（南京諾維贊生物科技有限公司）、模板DNA 1 μL、外圍引物（WF和WR）各1 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，57～53 ℃（每個循環(huán)減1 ℃）退火30 s，72 ℃延伸60 s，每個退火溫度2個循環(huán);94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，15 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

第2輪PCR反應(yīng)為性別連鎖SNP位點特異性引物延伸反應(yīng)，將第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍后用作第2輪PCR反應(yīng)的模板DNA。反應(yīng)總體系：20 μL，其中，2×Phanta Max Master Mix 10 μL、模板DNA 1 μL、ASE延伸引物（ASE）、DNA探針（ASE-DP）各1 μL、ddH2O 7 μL。第2輪PCR反應(yīng)分2步進(jìn)行，第1次擴(kuò)增：95 ℃，5 min;94 ℃30 s，66 ℃ 30 s，20個循環(huán);第2次擴(kuò)增：94 ℃30 s，50 ℃ 30 s，25 個循環(huán)。

1.5 遺傳性別鑒定結(jié)果判讀

本試驗所用核酸檢測試紙及其配伍堿性緩沖液，均購自杭州優(yōu)思達(dá)生物科技有限公司。第2輪PCR完成后，滴加20 μL核酸檢測試紙配伍的堿性緩沖液于微孔板中，在核酸檢測試紙的樣品墊上滴加10 μL第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將已滴加擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸檢測試紙插入含有緩沖液的100 μL微孔板中，保證樣品墊最下端與緩沖液接觸。上述過程完成后10～15 min內(nèi)對試紙顯色結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.6 遺傳性別鑒定準(zhǔn)確性驗證

從斑點叉尾遺傳育種中心樣本庫中隨機(jī)選取96個樣本，應(yīng)用本研究鑒定的方法對96個樣本遺傳性別進(jìn)行鑒定，并將鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中記錄的性別信息進(jìn)行比對，以期檢驗該方法準(zhǔn)確性。此外，應(yīng)用基于斑點叉尾性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法[15]對上述試驗魚的遺傳性別進(jìn)行鑒定，并比較2種方法的鑒定結(jié)果。

1.7 第2輪PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)對鑒定結(jié)果的影響

選擇遺傳性別為雄性的斑點叉尾DNA樣本，在進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng)后，第2輪PCR反應(yīng)程序中第2次擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)由25個循環(huán)逐次遞減5個循環(huán)，直至減少至0個循環(huán)，其他反應(yīng)程序不變。將巢式PCR反應(yīng)產(chǎn)物按照核酸檢測試紙顯色及判讀步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳性別鑒定方法

本研究建立的基于性別連鎖SNP位點特異性引物延伸反應(yīng)的斑點叉尾遺傳性別鑒定方法流程見圖 主要包括：SNP位點外圍引物擴(kuò)增、SNP位點特異性引物延伸反應(yīng)、延伸反應(yīng)產(chǎn)物與DNA探針雜交及顯色反應(yīng)等步驟。外圍引物（WF/R）擴(kuò)增主要完成SNP位點區(qū)間目的片段的大量富集，保證SNP位點特異性引物延伸反應(yīng)的有效性和準(zhǔn)確性。SNP位點特異性延伸反應(yīng)引物（ASE）的3′端為雄性特異堿基，5′端為6-FAM熒光基團(tuán)標(biāo)記，引物能夠與雄性個體在該SNP位點特異性結(jié)合并完成擴(kuò)增反應(yīng)。DNA探針（ASE-DP）的3′端標(biāo)記有Biotin基團(tuán)，從而保證其不能夠完成擴(kuò)增反應(yīng)，僅起到與SNP位點特異性延伸反應(yīng)產(chǎn)物雜交的目的。核酸檢測試紙的檢測區(qū)能夠特異性地識別DNA探針與SNP位點特異性延伸反應(yīng)產(chǎn)物雜交產(chǎn)物，經(jīng)過顯色反應(yīng)可直觀地呈現(xiàn)出不同斑點叉尾個體的遺傳性別信息。

2.2 遺傳性別鑒定結(jié)果及準(zhǔn)確性

本研究分別使用10尾雌雄個體，性別連鎖SNP位點特異性引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物與DNA探針的雜交產(chǎn)物在核酸檢測試紙上的顯色反應(yīng)見圖2。由圖2可知，雌雄個體在質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶，雄性個體在檢測區(qū)顯示紅色條帶，雌性個體在檢測區(qū)不顯色，鑒定結(jié)果與性別連鎖SNP位點測序圖譜一致。為驗證本研究建立的斑點叉尾遺傳性別鑒定方法的準(zhǔn)確性，使用96份未知性別樣本對該方法進(jìn)行測試，結(jié)果表明鑒定結(jié)果與96份樣本在數(shù)據(jù)庫中記錄的性別信息一致，該遺傳性別鑒定方法準(zhǔn)確率為100%。

基于斑點叉尾性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法中，雌性個體的DNA分型結(jié)果具有1個峰值（192 bp），雄性個體的DNA分型結(jié)果具有2個峰值（186、192 bp），其中，186 bp峰值為雄性個體所特有。使用2種方法對96尾斑點叉尾個體的遺傳性別進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示2種方法的鑒定結(jié)果一致，檢測結(jié)果見圖2-c。

2.3 第2輪PCR反應(yīng)循環(huán)次數(shù)對顯色反應(yīng)的影響

第2輪PCR反應(yīng)的第1次擴(kuò)增主要是對第1輪PCR反應(yīng)中剩余外圍引物的消耗，減少其對試驗結(jié)果的干擾。因此，在其他反應(yīng)程序不變情況下，第2次擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為25時檢測線最為清晰，隨著循環(huán)次數(shù)的依次遞減，檢測線顏色逐漸變淺，直至完全消失。

3 討論

在本研究之前，筆者所在課題組在斑點叉尾基因組中鑒定出多個性別連鎖SNP位點[14]，由于這些SNP位點均與雄性性別連鎖遺傳，因此，選擇其中1種，利用SNP特異性引物延伸反應(yīng)，并結(jié)合基于免疫膠體金技術(shù)的核酸試紙即可實現(xiàn)斑點叉尾遺傳性別的快速和準(zhǔn)確鑒定。

膠體金免疫層析技術(shù)因其具有高效、簡單、快速的特點而廣泛應(yīng)用于藥殘[16]、毒素[17]、細(xì)菌[18]、病毒[19]等檢測。應(yīng)用膠體金技術(shù)研發(fā)的新型SARS-CoV-2抗原檢測試劑盒可用于COVID-19臨床血清檢測，為病毒早期篩查提供準(zhǔn)確的檢測方法[20-22]。在應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)過程中，以氯金酸（HAuCl4）為還原劑，Au作為膠體顆粒，在堿性緩沖溶液中攜帶負(fù)電荷基團(tuán)，與Biotin單克隆抗體的正電荷基團(tuán)牢固結(jié)合，通過靜電作用形成金標(biāo)Biotin抗體。本試驗中，雄性樣本在核酸檢測試紙的質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)均顯示紅色， 雌性樣本僅在質(zhì)控3FA4C0FF-2B1A-47A8-BBFA-EB7E822326D4

區(qū)顯色，而在檢測區(qū)不顯色，主要是因為特異性延伸引物的3′末端為雄性特異堿基，且5′端標(biāo)記6-FAM基團(tuán)， 該引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物與3′端標(biāo)記Biotin的DNA探針進(jìn)行雜交，形成同時包含Biotin和6-FAM的雙標(biāo)記雜交產(chǎn)物。該雙標(biāo)記雜交產(chǎn)物與固定在檢測區(qū)的6-FAM抗體特異性結(jié)合，同時大量募集金標(biāo)Biotin抗體，從而使檢測區(qū)顯示紅色條帶;固定于質(zhì)控區(qū)的Biotin同樣能夠大量募集金標(biāo)Biotin抗體，使質(zhì)控區(qū)也顯示紅色條帶。

假陽性信號的產(chǎn)生會嚴(yán)重干擾本試驗建立的斑點叉尾遺傳性別鑒定方法的準(zhǔn)確性[23]。本方法在特異性延伸引物與DNA探針的設(shè)計過程，應(yīng)用Oligo軟件檢驗其二級結(jié)構(gòu)間相互關(guān)系，防止由于形成二聚體而出現(xiàn)假陽性信號。在SNP位點外圍引物延伸反應(yīng)完成后，將擴(kuò)增產(chǎn)物適當(dāng)稀釋，從而降低第二輪PCR體系中外圍引物的濃度，同時通過第二輪PCR反應(yīng)的第1次擴(kuò)增對殘留引物再次消耗，最終保證第2次擴(kuò)增中SNP特異性延伸反應(yīng)順利進(jìn)行。

將雄性遺傳性別斑點叉尾個體逆轉(zhuǎn)為生理性別為雌性后，再與正常雄魚雜交，獲得的子代染色體類型包括：XX型（雌性）、XY型（雄性）、YY型（雄性），其中，YY型斑點叉尾與正常雌魚雜交后，子二代即為全雄斑點叉尾[24]。本研究建立的遺傳性別鑒定方法亦可應(yīng)用于XY型、YY型雄性斑點叉尾子代的篩選，將SNP位點特異性延伸引物3′端設(shè)計為雌性個體特異堿基，經(jīng)過特異性引物延伸反應(yīng)和核酸檢測試紙顯色反應(yīng)后，可快速鑒定出XY型子代。

4結(jié)論

本研究成功建立了一種斑點叉尾遺傳性別快速鑒定方法，通過性別連鎖SNP特異性引物延伸反應(yīng)結(jié)合核酸檢測試紙完成對魚類遺傳性別的鑒定尚屬首次，整個過程僅數(shù)小時，且能夠同時檢測多個樣本。在斑點叉尾性別控制育種過程中，使用本研究建立的遺傳性別鑒定方法能夠?qū)崿F(xiàn)對性逆轉(zhuǎn)個體的快速篩選，也能夠為其他魚類的遺傳性別鑒定技術(shù)開發(fā)提供參考。

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