楊 提，王 雪，楊云云，丁 楠，王學(xué)彬,4#，陳井霞#

(1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院藥劑科，上海200135； 2.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，上海 200433； 3.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016； 4.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院生物藥物系，上海 201203)

慢性膽囊炎一般是由長(zhǎng)期存在的膽囊結(jié)石或急性膽囊炎反復(fù)發(fā)作遷延不愈導(dǎo)致的膽囊慢性炎癥。根據(jù)膽囊內(nèi)是否存在結(jié)石，分為結(jié)石性膽囊炎和非結(jié)石性膽囊炎。目前，慢性膽囊炎以西藥及手術(shù)治療等為主，但結(jié)石殘余率、復(fù)發(fā)率高，手術(shù)并發(fā)癥及再手術(shù)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較高。有研究結(jié)果表明，中藥治療慢性膽囊炎的臨床效果顯著且遠(yuǎn)期療效可觀[1]。中藥膽寧片的主要成分為大黃、虎杖、青皮和山楂等7味中藥，具有消炎利膽、防石護(hù)肝、清熱通下之功效，對(duì)于慢性膽囊炎具有較好的治療效果，是為數(shù)不多的具有防石溶石作用的純中藥制劑。雖然膽寧片在治療慢性膽囊炎和預(yù)防膽固醇結(jié)石形成中有一定的療效，但其作用靶點(diǎn)仍不明確[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析是在系統(tǒng)生物學(xué)與多向藥理學(xué)的基礎(chǔ)上提出的新思想、新策略，能夠系統(tǒng)綜合地觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響，尤其適用于“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的中藥藥理學(xué)研究[3]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討膽寧片治療慢性膽囊炎的藥物作用靶點(diǎn)，為膽寧片后續(xù)藥理作用研究提供基礎(chǔ)理論。

1 資料與方法

1.1 膽寧片活性成分及潛在靶點(diǎn)獲取

膽寧片由大黃、虎杖、青皮、陳皮、郁金、山楂和白茅根等7味中藥組成，通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)和草本組鑒數(shù)據(jù)庫(kù)(HERB)(http://herb.ac.cn/)檢索中藥膽寧片的化學(xué)組分?？诜锢枚?OB)指化合物在給藥后，吸收進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的相對(duì)量，是決定化合物是否具有分子類藥性的關(guān)鍵指標(biāo)；類藥性(DL)反映化合物的結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)，可用于評(píng)估生物分子作為藥物的可能性。因此，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)特點(diǎn)，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為條件，篩選具有生物活性的化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并導(dǎo)入U(xiǎn)niprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org)得到標(biāo)準(zhǔn)化的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息。

1.2 慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

以“gallbladder”和“chronic cholecystitis”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.GeneCards.org)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/)及Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)中檢索，得到慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中，Score值越高，靶點(diǎn)與疾病之間的關(guān)聯(lián)越密切，以相關(guān)性分值≥5分作為篩選條件，對(duì)檢索到的慢性膽囊炎靶點(diǎn)進(jìn)行重整，再合并檢索結(jié)果去重后，最終獲得慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 膽寧片作用于慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用Venny 2.1繪制膽寧片-慢性膽囊炎靶點(diǎn)韋恩圖，得到藥物-疾病共有靶點(diǎn)，即膽寧片治療慢性膽囊炎的作用靶點(diǎn)。

1.4 膽寧片所含化合物與慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將每個(gè)化學(xué)成分與其作用的慢性膽囊炎靶點(diǎn)相聯(lián)系，通過(guò)Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建膽寧片成分-慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)并繪制網(wǎng)絡(luò)圖，利用軟件中的內(nèi)置工具包NetworkAnalyzer分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度和介數(shù)中心度。

1.5 膽寧片治療慢性膽囊炎靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.3”項(xiàng)下所得共有靶點(diǎn)輸入STRING平臺(tái)(http://www.string-db.org/)，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“medium confidence”(>0.4)，其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建膽寧片-慢性膽囊炎靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。再將PPI網(wǎng)路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，通過(guò)Cytoscape 3.7.2內(nèi)置工具包NetworkAnalyzer分析PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選核心靶點(diǎn)，再利用R語(yǔ)言軟件中count.R插件統(tǒng)計(jì)篩選出的核心靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中的出現(xiàn)頻次分布情況。

1.6 基因本體(GO)與京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

GO對(duì)基因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述，將基因功能分為3個(gè)部分，即細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)和生物過(guò)程(BP)[4]。KEGG是一個(gè)整合基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫(kù)[5]。應(yīng)用R語(yǔ)言軟件中Cluster Profiler GO.R插件及Perl語(yǔ)言對(duì)膽寧片活性成分及藥物-疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集，對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析，得到膽寧片治療慢性膽囊炎的生物功能和信號(hào)通路。

1.7 膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape 3.7.2內(nèi)置工具分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度、介度及緊密度等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結(jié)果

2.1 膽寧片的主要活性成分和潛在靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和HERB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)中藥膽寧片大黃、虎杖、青皮、陳皮、郁金、山楂和白茅根分別進(jìn)行檢索，篩選OB≥30%且DL≥0.18的活性成分及相應(yīng)的作用靶點(diǎn)，得到活性成分32種，潛在作用靶點(diǎn)251個(gè)。

2.2 慢性膽囊炎相關(guān)疾病靶點(diǎn)獲取

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)及Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索關(guān)鍵詞“gallbladder”和“chronic cholecystitis”以獲取疾病靶點(diǎn)，合并搜索結(jié)果后刪除重復(fù)靶點(diǎn)，得到361個(gè)慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 膽寧片活性成分與慢性膽囊炎的共有靶點(diǎn)

將上述篩選所得的膽寧片活性成分靶點(diǎn)與慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)取交集，并通過(guò)Venny 2.1繪制韋恩圖，得到膽寧片治療慢性膽囊炎的作用靶點(diǎn)60個(gè)(見圖1)及其對(duì)應(yīng)的潛在活性化合物24種，根據(jù)共有靶點(diǎn)與活性化合物化合物可知所屬中藥名稱，見表1。

圖1 膽寧片活性成分-慢性膽囊炎靶點(diǎn)韋恩圖Fig 1 Wayne diagram of active ingredients of Danning tablets-chronic cholecystitis targets

2.4 膽寧片靶點(diǎn)-慢性膽囊炎相互作用網(wǎng)絡(luò)

將候選化學(xué)成分與慢性膽囊炎靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建膽寧片成分靶點(diǎn)-慢性膽囊炎靶點(diǎn)群網(wǎng)絡(luò)，得出膽囊片靶點(diǎn)-慢性膽囊炎網(wǎng)絡(luò)主要由84個(gè)節(jié)點(diǎn)(24個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，60個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和257條邊組成，其中三角形節(jié)點(diǎn)表示膽寧片藥物活性成分，圓形節(jié)點(diǎn)表示膽寧片可能是通過(guò)這些基因治療慢性膽囊炎，連接化合物與靶點(diǎn)的每條邊表示膽寧片活性成分與慢性膽囊炎靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，見圖2。在膽寧片靶點(diǎn)-慢性膽囊炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，膽寧片中有24種主要成分作用于慢性膽囊炎相關(guān)靶點(diǎn)，充分體現(xiàn)了其多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。其主要的化合物有槲皮素(quercetin)、柚皮素(naringenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、川陳皮素(nobiletin)、木犀草素(luteolin)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、毒扁豆次堿(physovenine)、橘皮素(tangeretin)和大黃酸(rhein)等，所屬活性成分可能膽寧片是治療慢性膽囊炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 膽寧片活性成分-慢性膽囊炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of active ingredients of Danning tablets-chronic cholecystitis targets

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物-疾病共有靶點(diǎn)60個(gè)輸入STRING平臺(tái)得到膽寧片-慢性膽囊炎共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖(40個(gè)節(jié)點(diǎn)，455條邊)，見圖3。應(yīng)用R語(yǔ)言count.R統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)頻率前15位的蛋白靶點(diǎn)，其中出現(xiàn)頻率較高的有腫瘤蛋白p53(TP53)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)等，見圖4。

圖3 膽寧片與慢性膽囊炎共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Network diagram of protein-protein interaction (PPI) of shared targets of Danning tablets and chronic cholecystitis

2.6 GO功能分析與KEGG富集分析結(jié)果

通過(guò)GO分析得到BP、CC和MF 3類，并根據(jù)信號(hào)通路中基因所占總體輸入基因的比率進(jìn)行排列，篩選出前15位，見圖5(A—C)。如圖5(A)所示，膽寧片治療慢性膽囊炎主要涉及的BP為上皮細(xì)胞增殖(epithelial cell proliferation)、細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)(cellular response to oxidative stress)和細(xì)胞的化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)(cellular response to chemical stress)等；如圖5(B)所示，治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要作用于核膜(nuclear membrane)、囊腔(vesicle lumen)和頂端質(zhì)膜(apical plasma membrane)等；如圖5(C)所示，主要涉及的MF為受體配體活動(dòng)(receptor ligand activity)、信號(hào)受體活動(dòng)(signaling receptor activity)和生長(zhǎng)因子受體結(jié)合(growth factor receptor binding)等。

根據(jù)通路基因所占總體輸入基因的比率排序，展示排序居前20的信號(hào)通路，見圖5(D)。膽寧片治療慢性膽囊炎的作用靶點(diǎn)主涉及的信號(hào)通路主要包括膀胱癌(bladder cancer)、人巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)等，體現(xiàn)了膽寧片多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，見表2。

2.7 膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖6。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2內(nèi)置的Network Analyzer分析膽寧片治療慢性膽囊炎網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心成分及核心作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明，槲皮素(quercetin)連接度為32，介度為0.242 652，緊密度為0.652 174，預(yù)測(cè)槲皮素為膽寧片治療慢性膽囊炎的主要成分；其次為木犀草素(luteolin)、川陳皮素(nobiletin)和蘆薈大黃素(aloe-emodin)，見表3。TP53在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為22，介度為0.076 612，緊密度為0.571 429，預(yù)測(cè)TP53為膽寧片治療慢性膽囊炎的最主要靶點(diǎn)；Cyclin依賴性激酶抑制劑1(CDKN1A)、G1/S-特異性Cyclin-D1(CCND1)、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶1(RAF1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、VEGFA、腫瘤壞死因子(TNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、受體酪氨酸蛋白激酶2(ERBB2)和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1(RB1)亦為相對(duì)重要的靶點(diǎn)，見表4。

表3 膽寧片主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)Tab 3 Characteristic parameters of network nodes of main active ingredients of cholinester tablets

表4 膽寧片主要活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)Tab 4 Characteristic parameters of targets network nodes of main active ingredients in Danning tablets

3 討論

慢性膽囊炎最典型的癥狀為間歇性膽絞痛，是由膽囊結(jié)石阻塞膽囊管的反復(fù)發(fā)作所致，最終由于膽囊壁的增厚和硬化導(dǎo)致膽囊萎縮并喪失生理功能。我國(guó)缺乏全國(guó)性的慢性膽囊炎、膽石癥流行病學(xué)資料。一項(xiàng)覆蓋24個(gè)省市的針對(duì)體檢人群的調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)不同年齡段人群膽囊結(jié)石的患病率為1.1%～11.2%，50歲以上中老年人為膽囊炎患病的主要人群[6]。慢性膽囊炎容易復(fù)發(fā)，為消化系統(tǒng)疾病中治療費(fèi)用較高的疾病。

膽寧片為臨床治療膽石癥和膽囊炎的有效中藥制劑，具有調(diào)節(jié)膽汁成分、抑制膽石結(jié)石的作用。研究結(jié)果表明，膽寧片可能通過(guò)促進(jìn)膽汁酸、卵磷脂的分泌，降低膽汁黏稠度，減少膽汁中膽固醇的含量[7]；同時(shí)，可降低膽汁中游離膽紅素的含量，從而防止膽色素結(jié)石的形成及增大[8]。

根據(jù)Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析膽寧片成分與疾病靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果表明，槲皮素、木犀草素、川陳皮素和蘆薈大黃素為膽寧片治療慢性膽囊炎的主要成分，其中槲皮素可能是最主要的有效成分。槲皮素是自然界中廣泛存在的多醇羥基黃酮類化合物，具有抗惡性腫瘤、抗氧化、抗炎、抗血栓、抗病毒、心血管保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)活性[9]。慢性膽囊炎多為慢性結(jié)石性膽囊炎，而膽固醇代謝異常引起的膽囊膽固醇結(jié)石是引起慢性膽囊炎的主要病因，槲皮素可以通過(guò)促進(jìn)膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)體內(nèi)膽固醇外排，抑制膽固醇合成的限速酶HMG-CoA還原酶的表達(dá)，進(jìn)而降低總膽固醇及膽固醇酯含量[10-11]。

通過(guò)構(gòu)建膽寧片與慢性膽囊炎的共有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，以及膽寧片成分-慢性膽囊炎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，得到膽寧片治療慢性膽囊炎的最主要靶點(diǎn)為TP53，其次為CDKN1A、CCND1、RAF1、EGFR、VEGFA、TNF、MMP9、ERBB2和RB1等。TP53基因表達(dá)異常與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，TP53能結(jié)合并激活細(xì)胞分裂制動(dòng)基因，從而抑制細(xì)胞的增殖和分化。研究結(jié)果表明，少數(shù)慢性膽囊炎壁肥厚伴重度異型上皮增生病例表現(xiàn)出TP53基因陽(yáng)性[12]。在慢性膽囊炎中，TP53基因的轉(zhuǎn)化突變可能與膽囊癌的發(fā)生密切相關(guān)[13]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(CDKN1A)能夠在G1期調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的功能，該基因的表達(dá)受到TP53的嚴(yán)格控制[14]；并且，TP53參與包括鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌和膀胱癌等多種腫瘤的病理生理過(guò)程[15]。然而，CDKN1A在慢性膽囊炎病理生理學(xué)過(guò)程中的作用還未見報(bào)道。

A.GO-BP功能富集；B.GO-CC功能富集；C.GO-MF功能富集；D.KEGG通路富集A.GO-BP function enrichmen; B.GO-CC function enrichment; C.GO-MF function enrichment; D.KEGG pathway enrichment圖5 膽寧片治療慢性膽囊炎潛在靶點(diǎn)的GO功能富集和KEGG通路富集分析氣泡圖Fig 5 Bubble diagram of GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of Danning tablets in the treatment of chronic cholecystitis

本研究根據(jù)GO和KEGG富集分析結(jié)果，可以得出膽寧片在慢性膽囊炎治療中參與的生物過(guò)程和信號(hào)通路。其中主要涉及的生物過(guò)程包括上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞的化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)等；主要參與的信號(hào)通路包括膀胱癌信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路等，涉及CCND1、CDKN1A、EGFR、MYC、TP53和IL-6等靶基因，以上通路與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等密切相關(guān)[16]。IL-6是由184個(gè)氨基酸組成的多功能糖蛋白，在慢性膽囊炎患者的膽汁和血清中呈高表達(dá)狀態(tài)，其作為一種炎癥細(xì)胞因子，反映了機(jī)體對(duì)炎癥及感染的反應(yīng)狀態(tài)[17-18]。膽囊局部的炎癥反應(yīng)是膽囊炎發(fā)病的重要基礎(chǔ)，有效控制炎癥對(duì)治療膽囊炎具有明顯的促進(jìn)作用。EGFR在膽囊癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為70.7%，在膽囊不典型增生組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為85.7%，而在正常膽囊組織中沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá)，推測(cè)EGFR與慢性膽囊炎和膽囊癌的發(fā)生可能有密切關(guān)系[19]。

綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，得到膽寧片治療慢性膽囊炎可能與抗炎、調(diào)節(jié)膽固醇代謝相關(guān)。目前僅通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)膽寧片參與治療慢性膽囊炎的主要靶點(diǎn)、生物過(guò)程和重要信號(hào)通路進(jìn)行探討，為進(jìn)一步闡明膽寧片治療慢性膽囊炎的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。但是，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法自身的局限性以及藥方中各味中藥材組分在煎煮過(guò)程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性，本研究并未將膽寧片原有的活性成分經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝后仍具有活性的代謝物納入分析。本研究主要是以生物信息學(xué)技術(shù)分析結(jié)果為基礎(chǔ)，后續(xù)將在此分析結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選并在動(dòng)物或細(xì)胞水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)而明確膽寧片調(diào)控慢性膽囊炎的主要靶點(diǎn)。