劉 瑾， 汪 洋， 賀增洋， 寧 勇， 王國(guó)凱， 王文斌*

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，安徽 合肥 230012)

鐵皮石斛(DendrodiumofficinaleKiumraetMigo)屬于蘭科石斛屬,是一種十分貴重的藥材,中醫(yī)認(rèn)為其具備潤(rùn)肺、養(yǎng)顏、滋陰、清熱等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,鐵皮石斛具有促進(jìn)消化、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗疲勞、降血壓、降血糖等作用[1]。鐵皮石斛種類繁多,主要分布在印度、中國(guó)、澳大利亞、日本等國(guó)家[2]。在我國(guó),石斛種類有近八十余種[3],其中,可作為藥用的石斛有三十多種[4]。

鐵皮石斛對(duì)生長(zhǎng)條件要求極其苛刻[5],在我國(guó),鐵皮石斛主要分布于浙江、廣東、福建等一些溫暖濕潤(rùn)的地區(qū),由于過度開采,野生石斛資源已經(jīng)十分稀少,現(xiàn)如今以人工栽培為主,以云南和浙江為第一組,廣東和安徽為第二組,福建、江西等為第三組,以及四川和重慶為第四組的四個(gè)栽培組為主[6]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、以及血管擴(kuò)張等一系列功能[7]為石斛的主要功能,臨床研究表明,鐵皮石斛對(duì)于特別是由于糖尿病、老年體制衰弱[8]、高血壓[9]以及癌癥放化療[10-11]所引起的身體虛弱有著明顯改善作用。鐵皮石斛作為藥食兩用的藥物，具有良好的藥理活性[12-13],廣泛應(yīng)用于各種食品和保健品中,合理地開發(fā)利用鐵皮石斛就顯得十分重要。

黃酮類化合物作為最常見的多酚類物質(zhì),已發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物已有近萬種。目前鐵皮石斛中總黃酮的提取方法中,加熱回流提取法、浸提、超聲提取法、微波提取法以及酶解法[14-16]是石斛中黃酮的提取方法中常見的方法。本研究綜合單因素結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選霍山鐵皮石斛總黃酮提取工藝。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試藥與試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(武漢天植生物技術(shù)有限公司,批號(hào):CFN98883,純度>98%);霍山鐵皮石斛藥材由公司提供,藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊青山老師鑒定為蘭科植物鐵皮石斛(DendrodiumofficinaleKiumraetMigo);甲醇、乙醇、三氯化鋁、無水乙酸鈉、冰醋酸等試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 KQ2200超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀有限公司);UV-8000紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);AB135-S分析天平(Switzerland);TG16-W高速離心機(jī)(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 顯色劑與緩沖劑的配制 精密稱取2.68 g AlCl3,用80%的乙醇溶液溶解并定容至200 mL,得到0.1 mol/L的三氯化鋁顯色劑。精密稱取無水乙酸鈉5.44 g,用80%的乙醇溶液溶解并定容至200 mL,得到乙酸鈉溶液;用移液管精密量取冰醋酸2.3 mL,用蒸餾水定容至200 mL;將上述兩種溶液混合,得到CH3COONa-CH3COOH緩沖液。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于50 mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液溶解,定容,配成0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品乙醇溶液。

1.2.3 最佳波長(zhǎng)的選擇 精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL,用80%乙醇稀釋至5 mL,分別加入緩沖液1 mL,顯色劑2 mL,放置10 min,進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,確定最佳波長(zhǎng)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于6個(gè)25 mL的容量瓶中,分別加80%乙醇至5 mL,再分別加入緩沖溶液1 mL,顯色劑2 mL,最后再用80%乙醇定容至25 mL,放置10 min。在214 nm處測(cè)量吸光度,平行測(cè)量3次,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 依據(jù)相關(guān)研究資料[17-19],考察甲醇與乙醇兩種不同溶劑對(duì)總黃酮提取率的影響,確定適宜的提取溶劑。研究各單因素試驗(yàn)時(shí),保持基礎(chǔ)條件不變,分別考察不同濃度的乙醇、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.2.6 正交與驗(yàn)證試驗(yàn) 在1.2.5單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上,選擇提取溫度、料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度為考察因素,因素水平見表1,采用正交表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定霍山鐵皮石斛總黃酮的提取條件。根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.4操作方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=50.017X-0.093 5,R2=0.999 8,符合線性關(guān)系。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 不同提取溶劑對(duì)總黃酮提取率的影響 精密稱取霍山鐵皮石斛3份,每份1 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,分別向其中加入50%甲醇溶液、50%乙醇溶液和蒸餾水50 mL,50℃超聲提取70 min,離心,取上清液1 mL于25 mL容量瓶中,加80%乙醇稀釋至5 mL,再分別加入1 mL緩沖液和2 mL顯色劑,定容至25 mL,放置10 min后按1.2.4的方法測(cè)定含量,結(jié)果如圖2所示,甲醇的提取率為2.46%,乙醇提取率為2.43%,考慮到甲醇的毒性較大,價(jià)格較乙醇較貴,故選擇乙醇作為提取溶劑。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同提取溶劑對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響 精密稱取藥材7份,每份1 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液50 mL,50 ℃超聲提取70 min,離心,再取上清液1 mL于25 mL容量瓶中,按1.2.4的方法測(cè)定含量,結(jié)果如圖3所示,50%乙醇提取的總黃酮含量為2.44%,均高于其他濃度。

圖3 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響 精密稱取藥材5份,每份1 g,至于100 mL具塞錐形瓶中,按照料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60,分別加入50%的乙醇溶液,按1.2.4的方法進(jìn)行含量測(cè)定,結(jié)果如圖4所示。當(dāng)料液比為1∶50時(shí),提取的總黃酮含量均高于其他組。

圖4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響 精密稱取藥材5份,每份1 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,加入50 mL 50%的乙醇溶液,在50 ℃的條件下,分別提取40、50、60、70、80 min,按1.2.4的方法測(cè)定含量,結(jié)果如圖5所示,在提取時(shí)間為70 min時(shí),總黃酮的提取效率最高。

圖5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.3.5提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響 精密稱取藥1材5份,每份1 g,至于100 mL具塞錐形瓶中,加入40 mL 50%的乙醇溶液。分別在20、30、40、50、60 ℃的條件下提取70min,按1.2.4的方法測(cè)定含量,結(jié)果如圖6所示,在50 ℃提取溫度下,總黃酮提取率最高。

圖6 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

2.4 正交試驗(yàn)與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 正交試驗(yàn) 按1.2.6的操作方法進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)得吸光度,計(jì)算出總黃酮的含量,結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1～3可知,料液比和提取時(shí)間對(duì)提取率的影響最大,而提取溫度和乙醇濃度相對(duì)影響較小,且在提取溫度為50 ℃,料液比為1∶50,提取時(shí)間為70 min,乙醇濃度為50%時(shí)總黃酮的提取率最高,即A2B2C2D2的組合,每克石斛中含總黃酮24.35 mg,含量達(dá)2.435%。

表3 方差分析結(jié)果

2.4.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 在A2B2C2D2的條件下,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),該條件下測(cè)得的總黃酮的含量為24.39 mg/g,計(jì)算其RSD為0.08%。

2.5 方法評(píng)價(jià)

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密量取供試品溶液6份,按1.2.4的方法操作,測(cè)得吸光度RSD為0.14%,表明儀器的精密度良好。

表4 精密度試驗(yàn)

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液,按1.2.4的方法操作,分別在0、0.5、1、2、3 h測(cè)量吸光度值,其RSD為0.14%,表明此方法的穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 最佳工藝條件下,制備供試品溶液6份,按1.2.4的方法進(jìn)行測(cè)量,計(jì)算結(jié)果顯示其RSD為0.10%,表明此方法的重復(fù)性良好。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取最佳工藝條件下提取的總黃酮溶液0.5 mL即0.244 g總黃酮置于25 mL容量瓶中,再加入0.5 mL對(duì)照品溶液,稀釋至5 mL,再按1.2.4的方法操作,計(jì)算回收率結(jié)果如表3,平均加樣回收率為96.86%,RSD為0.01%,由此可見,試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度很高。

表7 加樣回收率試驗(yàn)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)霍山鐵皮石斛中總黃酮的提取進(jìn)行了工藝優(yōu)化,確定了在料液比為1∶50,乙醇濃度為50%,溫度為50 ℃,以及超聲提取70 min的條件下,總黃酮的提取率最高。該工藝方法準(zhǔn)確度高,穩(wěn)定性良好,可以為鐵皮石斛藥材的充分利用提供借鑒與參考。