余 利, 王錦程, 謝亞杰, 黃偉東, 段海明

(安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

玉米大斑病是世界玉米種植產(chǎn)區(qū)廣為發(fā)生的重大病害,在我國(guó)曾于20世紀(jì)70年代、90年代和21世紀(jì)初暴發(fā)流行,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。隨著品種的更新?lián)Q代加速,加之大部分種質(zhì)資源對(duì)大斑病表現(xiàn)為感,完全依靠抗病育種尚不能完全奏效,大斑病暴發(fā)流行的風(fēng)險(xiǎn)仍然較大[2]。目前,玉米大斑病的防治藥劑包括丙森鋅、代森銨、吡唑醚菌酯、枯草芽孢桿菌等單劑和吡唑醚菌酯與氟唑菌酰胺、戊唑醇、氟環(huán)唑、氯氟醚菌唑、稻瘟靈的復(fù)配劑以及戊唑醇和肟菌酯、丁香菌酯、丙環(huán)唑的復(fù)配劑為主[3]。玉米是我國(guó)三大種植作物之一,為確保玉米的高效生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全,殺菌劑的使用面積較大,但是化學(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期應(yīng)用引起的環(huán)境污染、抗性與農(nóng)產(chǎn)品安全等問(wèn)題日益嚴(yán)重,化學(xué)藥劑的減量控害技術(shù)已成為當(dāng)今最為緊迫的研究熱點(diǎn)之一[4-5]。篩選高活性的化合物和其它環(huán)境友好的防治措施替代是實(shí)現(xiàn)藥劑減量化的重要手段,但篩選高活性化合物的難度大,生物防治還不能夠適應(yīng)種植環(huán)境的多樣性而不穩(wěn)定,物理防控手段難以在玉米田廣泛使用[6]。本研究在前期篩選到一株對(duì)植物病原菌具有強(qiáng)抑制活性的生防菌株SJ06,對(duì)其所產(chǎn)脂肽類物質(zhì)的抑制活性和化學(xué)殺菌劑的復(fù)配劑開展了相關(guān)研究,旨在為玉米大斑病的可持續(xù)防控和化學(xué)藥劑的減施提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)SJ06為安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存;供試化學(xué)殺菌劑克菌丹和代森錳鋅分別由安徽錦江農(nóng)化有限公司和山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定拮抗菌SJ06對(duì)玉米大斑病菌的抑制活性 對(duì)峙培養(yǎng)抑制活性采用菌餅五點(diǎn)法測(cè)定[7]。

1.2.2 不同稀釋倍數(shù)脂肽對(duì)玉米大斑病菌的抑制活性測(cè)定 參照顧康博等[8]方法制備脂肽粗提物。分別采用濾紙片法和菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定脂肽粗提物對(duì)玉米大斑病菌的抑制活性[9]。濾紙片法測(cè)試濃度分別為脂肽原液和2倍、4倍、8倍和16倍稀釋液,每個(gè)濾紙片(直徑5 mm)上藥劑加入量為10 μL。菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定脂肽粗提物的毒力,濃度設(shè)置為0.100、0.125、0.167、0.250、0.500 μL/mL;克菌丹濃度分別設(shè)置為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L;代森錳鋅濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L。接種完畢后轉(zhuǎn)入26 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)96 h,采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,采用SPSS 22.0軟件求出EC50、毒力回歸方程和R2。

1.2.3 Wadley公式法測(cè)定脂肽粗提物和化學(xué)殺菌劑的增效系數(shù) 脂肽粗提物與克菌丹以1∶100(質(zhì)量比)的比例復(fù)配,復(fù)配濃度為1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L;脂肽粗提物與代森錳鋅以1.5∶100的比例復(fù)配,復(fù)配濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L;運(yùn)用SPSS 22.0軟件求出混劑的毒力回歸方程、EC50,采用Wadley公式法求出增效系數(shù)(SR)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌SJ06對(duì)玉米大斑病菌的對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，拮抗菌株SJ06和玉米大斑病菌在PDA平板上對(duì)峙培養(yǎng)96 h，可以發(fā)現(xiàn)對(duì)照已長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)平板，而拮抗處理的玉米大斑病菌生長(zhǎng)勢(shì)較弱，具有明顯的抑菌帶。拮抗菌SJ06對(duì)玉米大斑病菌具有優(yōu)異的抑制效果，抑制率達(dá)89.2%±0.46%。說(shuō)明拮抗菌在PDA培養(yǎng)基生長(zhǎng)過(guò)程中能夠分泌對(duì)病菌抑制效果較強(qiáng)的抗生素或拮抗蛋白等活性代謝物質(zhì)，活性物質(zhì)以拮抗菌培養(yǎng)菌落為中心向周圍擴(kuò)散，玉米大斑病菌絲的生長(zhǎng)受到活性物質(zhì)抑制作用而生長(zhǎng)速率減小。脂肽類抗生素是芽孢桿菌代謝物中較為重要的一類，下面以菌株SJ06產(chǎn)生的脂肽類抗生素開展抑菌活性研究。

2.2 不同稀釋倍數(shù)脂肽粗提物對(duì)病菌的抑制活性

采用濾紙片法和菌絲生長(zhǎng)速率法2種方法,測(cè)定不同稀釋倍數(shù)的脂肽粗提液的抑菌活性。由表1可見(jiàn),濾紙片法測(cè)定脂肽粗提物原液對(duì)玉米大斑病菌的抑制率達(dá)83.73%,稀釋16倍對(duì)病菌的抑制率為59.64%,抑制效果優(yōu)異。由表2可見(jiàn),菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定得出,脂肽粗提物濃度從0.100 μL/mL增至0.500 μL/mL對(duì)玉米大斑病菌的抑制率分布在27.87%和71.03%之間,通過(guò)SPSS 22.0軟件分析得出,脂肽粗提物對(duì)玉米大斑病菌的EC50達(dá)0.23 μL/mL,毒力回歸方程為y=1.78x+1.15(R2=0.95)。

2.3 低劑量脂肽粗提物對(duì)克菌丹和代森錳鋅抑制大斑病菌的促進(jìn)效果

經(jīng)SPSS 22.0軟件分析得出,克菌丹對(duì)玉米大斑病菌的毒力回歸方程為y=1.29x-0.98(R2=0.96),EC50為5.78 μg/mL;代森錳鋅對(duì)病菌的毒力回歸方程為y=1.78x-1.61(R2=0.95),EC50為8.04 μg/mL。脂肽粗提物和克菌丹質(zhì)量比為1∶100下的毒力回歸方程為y=1.41x-0.73(R2=0.96),EC50為3.27 μg/mL。經(jīng)Wadley公式法計(jì)算得出其增效系數(shù)SR=1.78>1.50,表現(xiàn)為增效作用(表3、圖2)。代森錳鋅和脂肽粗提物質(zhì)量比為100∶1.5時(shí)具有較強(qiáng)的增效效果,其毒力回歸方程為y=1.02x-0.69(R2=0.95),EC50為4.68 μg/mL,增效系數(shù)SR為1.74>1.50,表現(xiàn)為增效作用(表4、圖3)。

表3 脂肽粗提物和克菌丹復(fù)配(質(zhì)量比1∶100)對(duì)玉米大斑病菌的抑制效果

圖2 脂肽粗提物和克菌丹復(fù)配劑對(duì)玉米大斑病菌的抑制效果

表4 脂肽粗提物和代森錳鋅復(fù)配(質(zhì)量比1.5∶100)對(duì)玉米大斑病菌的抑制效果

克菌丹和代森錳鋅同屬有機(jī)硫類保護(hù)性殺菌劑，其中克菌丹對(duì)玉米大斑病菌的抑制效果要高于代森錳鋅。研究發(fā)現(xiàn)，在脂肽類粗提物占比較低時(shí)，脂肽對(duì)上述2種殺菌劑具有協(xié)同增效作用尚不明確。脂肽類粗提物一般由表面活性素(surfaction)、豐原素(fengycin)和伊枯草菌素(iturin)等組成，至于何種脂肽類物質(zhì)(或混合物)在增強(qiáng)克菌丹和代森錳鋅的抑菌活性方面發(fā)揮主導(dǎo)作用，應(yīng)開展脂肽類物質(zhì)的分離純化鑒定，并再次開展分離得到的單一活性脂肽成分和上述2種化學(xué)殺菌劑復(fù)配劑的抑菌效果評(píng)價(jià)，最終得到發(fā)揮主要協(xié)同抑菌活性作用的脂肽成分。

圖3 脂肽粗提物和代森錳鋅復(fù)配劑對(duì)玉米大斑病菌的抑制效果

3 結(jié)論與討論

玉米大斑病主要為害葉片,造成光合效率下降,嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量[11]。芽孢桿菌是一類防治植物病害的重要生防資源[12],其中枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌等生防菌報(bào)道較多,主要以產(chǎn)生抗菌素、抗菌蛋白與脂肽類抗生素等方式發(fā)揮拮抗效應(yīng),產(chǎn)生的代謝物在病害生物防控中發(fā)揮了重要作用。脂肽粗提物可作為多種植物病菌的抑制劑,而且其對(duì)pH、溫度和有機(jī)溶劑等外界條件表現(xiàn)較高的穩(wěn)定性[13-14],但由于其固有屬性,如產(chǎn)率低、分離純化步驟繁瑣等限制因素導(dǎo)致其開發(fā)應(yīng)用成本較高,阻礙了脂肽粗提物作為農(nóng)藥登記而大規(guī)模使用的進(jìn)度[15]。因此,研究脂肽低劑量下的使用技術(shù)對(duì)于降低藥劑的使用成本,推動(dòng)現(xiàn)有常見(jiàn)農(nóng)藥減施增效具有重要作用。王文橋等[16]報(bào)道枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BAB-1與不同農(nóng)藥進(jìn)行交替噴施對(duì)番茄灰霉病的防效達(dá)86.90%,其防治效果明顯高于單劑;劉曉妹等[17]研究表明,絕大多數(shù)的生防菌與化學(xué)藥劑在防治芒果炭疽病方面具有協(xié)同作用。生防活體和化學(xué)藥劑相互增效的決定因素其本質(zhì)大多為菌株所產(chǎn)代謝物和化學(xué)殺菌劑由于作用靶標(biāo)以及抑菌生理生化機(jī)制存在較大差異性,相互配合而起到增效作用[18]。本研究得出的脂肽粗提物和克菌丹、代森錳鋅2種藥劑的協(xié)同作用具有較大的利用價(jià)值。然而,考慮到田間防治效果與室內(nèi)試驗(yàn)的環(huán)境條件存大較大差異性,其防效還有待田間試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

KIM等[19]研究表明,解淀粉芽孢桿菌JCK-12所產(chǎn)脂肽粗提物能夠顯著增強(qiáng)異菌脲、咯菌腈、苯菌靈、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇等對(duì)禾谷鐮孢的抑菌效果,抑菌效果提升的原因是脂肽可致使細(xì)胞壁受到損害、細(xì)胞膜透性增大,最終導(dǎo)致病菌對(duì)藥劑的吸收增強(qiáng)(或外排減少)。本研究通過(guò)藥劑復(fù)配試驗(yàn)得出脂肽粗提物在占比較低的情況下對(duì)克菌丹、代森錳鋅起到一定的殺菌提升效果,可以推測(cè)低劑量脂肽就能夠增加玉米大斑病菌的細(xì)胞膜的透性,使更大量的克菌丹、代森錳鋅藥劑透過(guò)細(xì)胞膜而起到抑菌作用,從而在同等施藥濃度下對(duì)玉米大斑病菌的抑制活性增強(qiáng),達(dá)到化學(xué)藥劑減施增效的目的。本研究的結(jié)果對(duì)于解淀粉芽孢桿菌SJ06產(chǎn)脂肽的下一步開發(fā)利用和上述2種化學(xué)藥劑的減量使用均具有潛在利用價(jià)值。同時(shí)考慮到脂肽作為農(nóng)藥開發(fā)存在的難度和滯后性,可以嘗試?yán)迷摼觊_發(fā)成為抗病功能肥料和化學(xué)藥劑復(fù)配使用或間隔使用。