張家莉，令狐遠鳳，段世宇，潘 永，楊 琦,4

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550025；4.貴州省動物疫病研究室，貴州 貴陽 550025）

0 引言

【研究意義】鼠傷寒沙門菌是一種常見的人畜共患病原菌，對我國的畜禽產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的威脅。轉錄后水平的調(diào)控是調(diào)節(jié)細菌基因表達的重要方式，sRNA 通過分子內(nèi)堿基配對與靶mRNA 相互作用，通常通過隔離靶mRNA 的核糖體結合位點（RBS）來調(diào)節(jié)翻譯起始[1]。揭示sRNA 與靶基因的調(diào)控理論，找到沙門氏菌防控新方式，對保障人與畜牧業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】sRNA SdsR 以兩種形式存在，一種是全長 100 nt sRNA，另一種是經(jīng)過加工的 70 nt 分子[2]。作為一種基因轉錄后調(diào)節(jié)因子，SdsR 影響細菌對壓力條件的適應、毒力及生物膜形成[3]。SdsR 是固定相 sigma 因子 (σS) 調(diào)節(jié)子的成員，通過有限且不完美的堿基互補配對與靶mRNA 結合[4]，結合區(qū)域常為相鄰的6～8 個堿基[5]。Fr?hlich 等[6]確定并驗證了ompDmRNA為SdsR 的直接目標。之后通過SdsR 脈沖表達與全基因組轉錄組學相結合，發(fā)現(xiàn)了 20 個以前未知的 SdsR候選靶標，其中有18 個靶標受SdsR 的依賴性調(diào)節(jié)[7]。【本研究切入點】sdsR基因幾乎存在于所有腸桿菌基因組中，說明sRNA 一定存在額外的、保守的靶基因。TargetRNA2 是建立在TargetRNA[8]、IntaRNA[9]、RNApredator[10]之上的用于識別細菌中被sRNA 調(diào)控的mRNA 靶標，其特點是既準確又有效[11]。然而有關鼠傷寒沙門菌sRNA SdsR 靶基因的預測及驗證的研究還有待深入進行?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用TargetRNA2 軟件預測sRNA SdsR 的潛在靶標，結合前期對sRNA SdsR 敲除后的轉錄組數(shù)據(jù)，將預測到的部分基因注釋到GO、KEGG 以及eggNOG數(shù)據(jù)庫中進行分析，并利用RT-qPCR 對部分預測靶基因進行驗證，篩選出可能受sRNA SdsR 直接調(diào)控的靶基因，為進一步明確鼠傷寒沙門菌sRNA SdsR的調(diào)控機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 野生型鼠傷寒沙門菌標準株3409由法國國家科學研究中心（CNRS）分子遺傳學Bossi實驗室惠贈；SdsR 敲除株（基因型為△sdsR::cat）由本實驗室構建。

1.1.2 主要試劑及儀器 試劑：RNA 提取試劑盒購自貴州卓一生物科技有限公司，反轉錄試劑盒[Recombinant NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）]及熒光染料AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 均購自宏達爾生物科技有限公司，試劑均為分析純。

儀器：熒光定量PCR 儀（CFX Connect optics Module），美國Bio-RAD 公司；微量核酸測定儀（Nano Photometer NP80），德國Implen 公司。

1.2 TargetRNA2 預測SdsR 靶標

進入TargetRNA2 靶基因預測網(wǎng)站（http://cs.wellesley.edu/～btjaden/TargetRNA2/），輸入sRNA SdsR序列，分析對象為沙門氏菌腸道亞種，鼠傷寒沙腸桿菌血清型LT2 染色體。勾選sRNA conservation and accessibilty。目標參數(shù)為從上游80 NTs 到mRNA 翻譯起始位點下游的20 NTs，sRNA 窗口大小為13，雜交種子數(shù)為7，P值閾值為0.05，過濾器尺寸為400。點擊search，將預測到的結果導出并選擇雜交能量最高的5 個基因進行后續(xù)的試驗。

1.3 預測基因的生物學信息分析

本實驗室前期已經(jīng)將鼠傷寒沙門菌sRNA SdsR基因敲除后進行轉錄組測序。轉錄組測序結果已注釋到GO、KEGG 以及eggNOG 數(shù)據(jù)庫中。將預測到的靶標定位在測序結果中，分析其涉及的信號通路、所行使的生物學功能、蛋白質(zhì)功能及其分類。

1.4 預測基因的RT-qPCR 驗證

選擇雜交能量較高的5 個預測到的靶基因hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC，對其進行RT-qPCR驗證。根據(jù)GenBank 提供的基因序列設計相應的RT-qPCR 引物（表1），送上海生工生物工程有限公司進行合成。以SdsR 敲除株為試驗組、3409 標準株為對照組，提取總RNA 樣本，反轉錄成cDNA 后進行RT-qPCR 試驗，反應體系為：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.8 μL；反應程序為：95 ℃ 0.5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 0.5 min，39 個循環(huán)，每個樣本重復3 次。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進行處理。將得到的結果結合轉錄組數(shù)據(jù)進行分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結果與分析

2.1 sRNA SdsR 靶標預測結果

Target RNA2 軟件預測到29 個靶標（表2），其中hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC的雜交能量較高。hemA編碼谷氨酰-tRNA 還原酶（GlutamyltRNA reductase），STM0951編碼細胞質(zhì)蛋白（Cytoplasmic protein），mreC編碼桿狀決定蛋白MreC（Rod shape-determining protein MreC），STM1252 編碼細胞質(zhì)蛋白（Cytoplasmic protein），dcoC編碼草酰乙酸脫羧酶亞基γ（Oxaloacetate decarboxylase subunit gamma）。

表2 TargetRNA2 軟件預測結果Table 2 Prediction by TargetRNA2

雜交能量較高的5 個基因的靶位點的預測結果（表3）顯示：STM0951 與dcoC在5′UTR 區(qū)域與sRNA SdsR 形成了4 個連續(xù)的堿基互補配對，而hemA、mreC、STM1252 則是在CDS 區(qū)域與sRNA SdsR 發(fā)生大于7 個堿基的連續(xù)或不連續(xù)的互補配對。該結果說明所選擇的5 個基因均能與sRNA SdsR 形成連續(xù)的堿基互補配對，且可能存在其他有待發(fā)現(xiàn)的作用機制。

表3 靶位點預測結果Table 3 Predicted target sites

2.2 預測靶基因GO、KEGG 和eggNOG 數(shù)據(jù)庫注釋

將篩選到的5 個潛在靶基因注釋到GO、KEGG和eggNOG 數(shù)據(jù)庫中（表4）。GO 數(shù)據(jù)庫注釋結果顯示，在生物過程方面，hemA主要參與原卟啉原IX 生物合成過程、氧化還原過程，STM0951 只參與氧化還原過程，mreC影響細胞形狀的調(diào)節(jié)，dcoC參與脂質(zhì)代謝過程；在細胞成分方面，merC和dcoC同時與膜的組成部分質(zhì)膜相關；在分子功能方面，hemA和STM0951 同時涉及槲皮素 2,3-雙加氧酶活性，而dcoC涉及鈉離子跨膜轉運蛋白活性、草酰乙酸脫羧酶活性、水解酶活性。STM1252 的生物學功能未被富集到。KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋結果顯示hemA與dcoC分別富集到卟啉和葉綠素代謝途徑與丙酮酸代謝途徑。eggNOG 數(shù)據(jù)庫注釋結果顯示，篩選出的5 個基因均可注釋到eggNOG 數(shù)據(jù)庫中的直系同源蛋白功能分類。其中hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC分別注釋到輔酶轉運和代謝、僅一般功能預測、細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生、碳水化合物運輸和代謝以及能源生產(chǎn)和轉化幾個分類中。表明上述基因可能參與細菌的新陳代謝以及基本的生命活動。結合轉錄組數(shù)據(jù)，sRNA SdsR 敲除后hemA、mreC分別下 調(diào)0.23 和0.39 倍；STM0951、STM1 252、dcoC分別上調(diào)0.51、0.35 和1.86 倍。由此可見，dcoC基因表達差異倍數(shù)最大，但表達倍數(shù)小于2 且未達到差異閾值，其差異性需要進一步驗證。

表4 預測靶基因GO、KEGG 和eggNOG 數(shù)據(jù)庫注釋結果Table 4 Annotation of predicted target genes by GO,KEGG,and eggNOG databases

2.3 預測靶基因的RT-qPCR 驗證

對預測到的雜交能量較高的5 個潛在靶基因進行RT-qPCR 驗證，結果（圖1）顯示，hemA、mreC、STM0951、STM1 252、dcoC與野生型沙門菌LT2 相比轉錄水平分別下調(diào)0.70 倍、下調(diào)0.59 倍、上調(diào)1.34 倍、上調(diào)0.47 倍和上調(diào)2.46 倍。以上結果表明，hemA、mreC、STM0951、STM1252、dcoC是本研究篩選被sRNA SdsR 調(diào)控的靶基因。

圖1 RT-qPCR 驗證結果Fig. 1 Results of RT-qPCR verification

3 討論

sRNA SdsR 是伴侶蛋白Hfq 依賴性sRNA 中的一員，它在腸桿菌的保守性以及經(jīng)過驗證的靶標的生物學作用使得 SdsR 成為sRNA 研究領域中深入研究的主題。Choi 等[12]對sRNA SdsR 進行RNA-seq 來尋找SdsR 驅(qū)動的細胞死亡的靶基因。雖然此方法能篩選到大量的潛在靶基因，但由于篩選到的基因總數(shù)太大，驗證sRNA 直接調(diào)控的靶基因有著很大程度上的不確定性，導致直接調(diào)控靶基因的確定較困難。TargetRNA2 在sRNA 目標預測系統(tǒng)中具有獨特的能力，可以整合RNA-seq 數(shù)據(jù)以提高預測結果。本研究采用TargetRNA2 預測到29 個靶基因，選擇其中的5 個基因進行RT-qPCR 驗證，結果發(fā)現(xiàn)RT-qPCR與DESeq 的上下調(diào)趨勢均相符，但差異倍數(shù)不完全符合，這可能與驗證方法不同及儀器靈敏度差異有關，且RT-qPCR 檢測結果整體高于DESeq 檢測結果，說明熒光定量PCR 的敏感性高于DESeq 測序方法。以上結果表明這些基因可能受SdsR 直接調(diào)控。很明顯，這種針對研究對象特性并結合軟件預測的研究方法具有較高的篩選效率，同時結合轉錄組測序的數(shù)據(jù)能極大提高靶基因的篩選效率。

SdsR 是Hfq 依賴性sRNA，Hfq 相關sRNA 通常通過反式編碼調(diào)節(jié)靶mRNA，導致在翻譯、RNA 穩(wěn)定性或兩者水平上抑制或激活靶標[13]。反式編碼調(diào)控小RNA 對靶mRNA 的調(diào)控作用以負調(diào)節(jié)作用最為常見[14]。在本次研究中，篩選出的5 個靶基因中hemA、merC的表達量下調(diào)，說明在沙門菌中，SdsR 對某些靶基因的表達有促進作用，其調(diào)控機制值得進一步深入研究。SdsR 與靶mRNA 互補配對的位置通常位于其5′UTR 靠近翻譯的起始位點的區(qū)域，而預測結果顯示SdsR 與hemA、mreC、STM1252 的結合位點為起始密碼子的CDS 區(qū)，這種結合方式并不常見。Verena Pfeiffer[15]驗證了與Hfq 相關的sRNA MicC 通過CDS（密碼子23-26）中的r12-bp RNA 雙鏈體沉默鼠傷寒沙門氏菌ompDmRNA，此外，ArcZ-TPX[16]、RybB-fdaL[17]、SgrS-manX[18]等都屬于sRNA 與靶基因的CDS 區(qū)域相互作用。此機制已被證明是一種比以前認為的更為常見的機制。這些研究支撐了hemA、mreC、STM1 252 作為SdsR 靶標的可能性。

TargetRNA2 預測到的5 個基因中，hemA編碼谷氨酰-tRNA 還原酶[19]，該酶是催化血紅素生物合成途徑中的第一個關鍵步驟。血紅素可作為一種主要的鐵來源，鐵是大多數(shù)生物包括細菌生命的必需營養(yǎng)元素[20]。STM0951 基因GO 富集到氧化還原過程，鼠傷寒沙門菌作為需氧及兼性厭氧型細菌，細菌的許多生命活動都會進行著復雜的氧化還原反應，如呼吸作用、固氮作用及生物體內(nèi)許多代謝活動。merC與膜的組成部分質(zhì)膜相關，STM1 252 編碼細胞質(zhì)蛋白。dcoC編碼草酰乙酸脫羧酶亞基γ，草酰乙酸脫羧酶還有α、β 另外兩個亞基，其具備鈉離子轉運功能；另外，研究還發(fā)現(xiàn)草酰乙酸脫羧酶對細菌的致病性及毒力起重要作用，如在軍團菌中草酰乙酸脫羧酶突變導致其在宿主體內(nèi)的增殖能力減弱[21]。沙門菌作為重要的人畜共患病原菌，掌握其sRNA與靶基因的互作方式及了解其靶基因的組織結構、生理功能等有利于人們應對沙門氏菌的威脅，保證人類和動物的健康。