何桂倫，易遠名，楊奇慧，譚北平，遲淑艷，劉泓宇

廣東海洋大學 水產學院/水產動物營養(yǎng)與飼料實驗室，廣東 湛江 524088

凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei) 具有生長快、養(yǎng)殖量大和成活率高等特點[1]，可在鹽度1～50的水體環(huán)境中生活[2]。盡管凡納濱對蝦耐鹽廣，但水體鹽度會對其生長與代謝產生重要影響，適宜的鹽度可使其獲得優(yōu)良的生長發(fā)育和免疫能力[3]。已有研究報道凡納濱對蝦在鹽度12[1]、17[4]或20左右[5-6]能獲得優(yōu)良的生長性能。由于凡納濱對蝦與水體環(huán)境間存在滲透壓力差，在滲透壓調節(jié)過程中面臨著體內主要滲透壓調節(jié)離子損失和營養(yǎng)物質需求量增加等問題[7]，因此高鹽或低鹽環(huán)境不僅會導致凡納濱對蝦滲透調節(jié)消耗更多的營養(yǎng)和能量[4]，還會導致其增重率、成活率[4]、抗逆性[8-9]和免疫力[9-10]下降等問題，低鹽條件下易受氨氮[11]、副溶血性弧菌 (Vibrio parahemolyticus)[12]和白斑綜合征病毒 (WSSV)[13]等病原體的侵襲。前期研究表明，凡納濱對蝦在鹽度3時的增重率和成活率較鹽度17[4]和30[14]時低，對硼環(huán)境毒性敏感度高于鹽度20[8]，鹽度5時肝胰腺受損[15]，肌肉營養(yǎng)成分較正常鹽度低[16]，血細胞免疫力較鹽度20 時低[14]。

水產動物飼料不僅應提供動物體足夠的營養(yǎng)和能量，還應具有緩解水產動物在環(huán)境變化時產生不良反應的活性物質。研究表明，鹽度6時實驗配方低蛋白質和高碳水化合物含量 (26%蛋白質和6%魚粉加益生菌混合物) 能抵消部分低鹽度帶來的影響，提高凡納濱對蝦的成活率，提高其蛋白質效率和免疫力，而飼料蛋白質水平的升高 (40%粗蛋白質和20%魚粉不含益生菌混合物) 并不能改善對蝦的成活率[17]。肌醇既是一種與維生素H和維生素B1活性相似的營養(yǎng)因子[18]，對細胞膜的結構完整性和功能有重大影響[19]；也是一種重要的環(huán)境調節(jié)因子，主要以磷脂酰肌醇形式參與調節(jié)細胞對外部刺激的反應或神經傳遞并與各種特定蛋白質共同作用調節(jié)酶的活性[20]，進而調控動物體的生長及代謝[19-24]。前期研究表明，肌醇對水產動物腸道菌群和微環(huán)境調節(jié)具有重要作用[25]，飼料中添加肌醇能改善斑節(jié)對蝦 (Penaeus monodon) 和幼建鯉 (Cyprinus carpiovarJian) 的腸道環(huán)境[26-27]，提高消化酶活性進而改善腸道消化吸收能力，使中國明對蝦 (Fenneropenaeus chinensis) (肌醇水平 4 000 mg?kg?1)[28]、斑節(jié)對蝦 (肌醇水平 3 400 mg?kg?1)[26]和鹽度 17.4 的凡納濱對蝦 (肌醇水平 1 181.54 mg?kg?1)獲得良好的生長發(fā)育和免疫狀況[29]。飼料中添加肌醇能增強凡納濱對蝦的抗氧化酶活性[30]，肌醇水平 110 mg?kg?1能防止其出現(xiàn)明顯的生長緩慢現(xiàn)象[29]。而飼料中缺乏肌醇不僅會減緩凡納濱對蝦、中國明對蝦和斑節(jié)對蝦的生長，對其發(fā)育和代謝產生不良影響，還會造成凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦成活率明顯降低[26,28-29]，致使建鯉幼魚出現(xiàn)皮膚出血，鱗片脫落，皮膚、尾鰭和背鰭糜爛等癥狀[31]。

凡納濱對蝦的生長發(fā)育和免疫力與其體內mTOR蛋白信號通路中的TORC1相關因子有關，在環(huán)境因子或營養(yǎng)因子作用下此信號通路發(fā)生改變，進而影響其生長發(fā)育和免疫力[32-34]。低鹽環(huán)境可能會對凡納濱對蝦的健康造成一定損害，肌醇作為環(huán)境和營養(yǎng)因子，可能會改善低鹽條件下蝦的生長、發(fā)育并提高其免疫力，但肌醇對低鹽條件下凡納濱對蝦的生長、發(fā)育和代謝是否有促進作用尚未見報道。隨著凡納濱對蝦在淡水或低鹽條件下養(yǎng)殖面積與規(guī)模的增大，有關低鹽度下凡納濱對蝦礦物元素[35]、維生素、飼料中蛋白質水平[7]、脂類營養(yǎng)[36]和糖類營養(yǎng)[37]的研究廣泛。本研究通過分析對比鹽度4和28條件下凡納濱對蝦的生長指標、體組成分、血清生化指標和非特異性免疫酶活性等，探討了不同鹽度下肌醇對凡納濱對蝦生長和代謝的影響，以為不同鹽度水體養(yǎng)殖凡納濱對蝦提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

以魚粉、酪蛋白和明膠為蛋白源，豆油和魚油為脂肪源，每千克基礎飼料 (表1) 中分別添加0、100、200、400、800 和 1 600 mg 肌醇配制成 6 種等氮等脂飼料，分別標記為J0、J1、J2、J3、J4和J5組開展實驗。計算并稱量各原料，先過80目篩，再混合，加入適量的水揉勻，經雙螺桿擠條機[華南理工大學研制的F-Ⅲ(26)型]制成顆粒狀飼料 (粒徑 1.0 和 1.5 mm) 后，置常壓干燥箱 60 ℃熟化30 min，待溫度降至室溫后于避光通風處風干，用密封袋裝封后置?20 ℃冰箱備用。

表1 實驗飼料組成及營養(yǎng)水平 (干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(dry mass basis)

1.2 飼養(yǎng)管理

蝦苗購自湛江市中聯(lián)養(yǎng)殖有限公司，于廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地標粗4 周至實驗所需規(guī)格后，挑選健康的蝦于室內蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)開展養(yǎng)殖實驗。選取體質量為 (0.75±0.03) g的凡納濱對蝦幼蝦，每個處理組設3個重復，共12個處理，在每個0.3 m3的玻璃纖維桶中放養(yǎng)40尾。每天按蝦體質量的8%～10%稱料，于07:00、11:00和16:00和20:00投喂，其中早晚投餌量各占一天投餌量的30%～35%，投喂30 min后觀察并記錄攝食情況，根據(jù)天氣條件和攝食情況對投喂量進行調整。實驗周期共10周，養(yǎng)殖水體鹽度分別為4 (L)和28(H)。根據(jù)飼料和鹽度的不同組合，J0投喂對照組飼料，J1、J2、J3、J4和J5分別為添加100、200、400、800 和 1 600 mg?kg?1肌醇飼料的實驗組；L 為鹽度4的養(yǎng)殖水體條件，H為鹽度28的養(yǎng)殖水體條件，將12個處理組分別命名為LJ0、LJ1、LJ2、LJ3、LJ4、LJ5、HJ0、HJ1、HJ2、HJ3、HJ4、HJ5。實驗期間水中持續(xù)充氧，水溫28.6～31.4 ℃，氨氮質量濃度<0.03 mg?L?1，水體溶解氧質量濃度>6.8 mg?L?1，pH 7.8～8.2。

1.3 生長指標和體成分測定

實驗結束后，對桶內的對蝦進行稱質量和計數(shù)，每個重復隨機選取5尾分析全蝦體成分，按李日美[38]的方法測定水分、粗灰分、粗蛋白質和粗脂肪。另選取5尾取出肝胰腺后稱質量，計算肝體比。

1.4 血清指標及酶活測定

每個重復取5尾蝦，按李日美[38]方法處理，備測血清中總膽固醇 (Total cholesterol, TC)、甘油三酯 (Triglyceride, TG)、總蛋白 (Total protein, TP)和葡萄糖 (Glucose, Glu)；冰上取出5尾蝦的肝胰腺，按李日美[38]方法處理，用于肝胰腺酸性磷酸酶 (Acid phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase, AKP)、總超氧化物歧化酶 (Total superoxide dismutase, T-SOD) 和一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase, NOS) 活性測定。上述指標檢測試劑盒均來自南京建成生物工程研究所，按試劑盒說明書進行實驗操作。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差 (SD)”表示，采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，若單因素各組間平均數(shù)差異顯著則采用Duncan's多重比較法，若交互因素作用顯著，則對單個因素的平均值進行Duncan's多重比較，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。增重率 (Weight gain rate, WGR)、成活率 (Survival rate, SR)、飼料系數(shù) (Feed coefficient, FC)、特定生長率 (Special growth rate, SGR)、蛋白質效率 (Protein efficiency ratio, PER)、肝體比 (Hepatopancreas somatic indices, HSI)、蛋白質凈利用率 (Net protein utilization, NPU) 等指標計算公式如下：

式中：Wt為終末體質量；W0為初始體質量；nt為實驗結束時蝦尾數(shù)；n0實驗開始時放蝦尾數(shù)；M為攝食飼料干物質質量；m0為平均初始體質量；mt為平均終末體質量；mi為蛋白質攝入量；Wh為肝胰腺質量；m為蝦體質量；t為實驗天數(shù)；MS為氮沉積量；MN為氮攝入量。

2 結果

2.1 肌醇對凡納濱對蝦生長和飼料利用的影響

肌醇對凡納濱對蝦幼蝦生長和飼料利用有顯著影響 (P<0.05，表2)。鹽度4條件下，各肌醇添加組的終末體質量、增重率、特定生長率和蛋白質效率均顯著高于對照組 (P<0.05)，LJ2、LJ3、LJ4和LJ5組的成活率顯著高于對照組 (P<0.05)，隨著肌醇水平的升高呈上升趨勢，飼料系數(shù)反之，肌醇水平 1 600 mg?kg?1的飼料系數(shù)最低，其余指標反之。LJ0組的終末體質量、增重率、成活率、特定生長率和蛋白質效率顯著低于HJ0組 (P<0.05)，飼料系數(shù)反之，飼料中添加 100 mg?kg?1肌醇組各指標與HL0組無顯著差異(P>0.05)。鹽度28條件下，各肌醇添加組的成活率、特定生長率和蛋白質效率顯著高于對照組(P<0.05)，HJ2、HJ3、HJ4和HJ5組的終末體質量、增重率顯著高于對照組，隨著肌醇水平的升高呈上升趨勢，飼料系數(shù)反之，肌醇水平1 600 mg?kg?1的飼料系數(shù)最低，其余指標反之。鹽度 28 條件下投喂肌醇水平 100 mg?kg?1的凡納濱對蝦成活率和蛋白質效率顯著高于鹽度4 (P<0.05)，200、400、800 和 1 600 mg?kg?1的終末體質量、增重率、特定生長率和蛋白質效率顯著高于鹽度4(P<0.05)。雙因素方差分析顯示，鹽度和肌醇對終末體質量、增重率、成活率、特定生長率、飼料系數(shù)和蛋白質效率有顯著影響 (P<0.05)，鹽度和肌醇的交互作用對終末體質量、增重率、成活率、特定生長率、飼料系數(shù)有顯著影響 (P<0.05)。

表2 肌醇對凡納濱對蝦幼蝦生長性能的影響Table 2 Effects of inositol on growth performance for juvenile L. vannamei

2.2 肌醇對凡納濱對蝦體組成成分的影響

肌醇對凡納濱對蝦體組成成分有顯著影響(P<0.05，表3)。鹽度28的水分低于鹽度4，而NPU反之。HSI隨著肌醇水平的升高先升后降，在肌醇水平 800 mg?kg?1的達到最大值；NPU 隨肌醇水平的增加呈上升趨勢，在肌醇水平 1 600 mg?kg?1時達到最高。雙因素方差分析顯示，鹽度對水分、NPU有顯著影響(P<0.05)，肌醇水平對HSI和NPU有顯著影響 (P<0.05)，鹽度和肌醇水平的交互作用對HIS、水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分和NPU無顯著影響 (P>0.05)。

表3 肌醇對凡納濱對蝦幼蝦體成分的影響 (干物質基礎)Table 3 Effects of inositol on body composition for juvenile L. vannamei (dry matter basis)

2.3 肌醇對凡納濱對蝦血清生化指標的影響

肌醇對凡納濱對蝦血清生化指標有顯著影響(P<0.05，表4)。兩種鹽度條件下，隨著肌醇水平升高 TC 含量呈下降趨勢，在 1 600 mg?kg?1時最低，均顯著低于對照組 (P<0.05)。鹽度28肌醇水平 400 mg?kg?1組的 TC含量顯著高于鹽度 4(P<0.05)。雙因素方差分析顯示，鹽度和肌醇水平對TC含量有顯著影響 (P<0.05)。鹽度和肌醇水平的交互作用對TP、TG、TC和Glu含量無顯著影響 (P>0.05)。

表4 肌醇對凡納濱對蝦幼蝦血清生化指標影響Table 4 Effects of inositol on serum biochemical indexes for juvenile L. vannamei

2.4 肌醇對凡納濱對蝦肝胰腺非特異性免疫酶活的影響

肌醇對凡納濱對蝦肝胰腺非特異性免疫酶活有顯著影響 (P<0.05，表5)。鹽度4條件下，投喂肌醇 200、400 和 800 mg?kg?1組的 ACP 活性無顯著差異 (P>0.05)，但顯著高于對照組 (P<0.05)，200 mg?kg?1組的活性最高。AKP 活性隨肌醇水平的升高呈上升趨勢，200、400、800 和 1 600 mg?kg?1組顯著高于對照組 (P<0.05)，且 1 600 mg?kg?1組顯著高于其他組 (P<0.05)；投喂肌醇對T-SOD和NOS活性無顯著影響 (P>0.05)。鹽度28條件下，各肌醇添加組的ACP活性顯著高于對照組 (P<0.05)，隨肌醇水平的升高，ACP活性呈先升后降趨勢，400 與 200 mg?kg?1組無顯著差異 (P>0.05)，且ACP 活性最高。投喂 100 mg?kg?1肌醇組的 AKP 活性顯著高于其他組 (P<0.05)；投喂200、400、800 和 1 600 mg?kg?1肌醇組的 T-SOD 活性顯著高于對照組 (P<0.05)，400 mg?kg?1組顯著高于其他組 (P<0.05)。NOS活性隨肌醇水平的升高呈先升后降的趨勢，200、400 和 800 mg?kg?1組顯著高于對照組(P<0.05)，400 mg?kg?1組顯著高于其他組 (P<0.05)。LJ0組的AKP和NOS活性顯著低于HJ0組 (P<0.05)。鹽度 4 條件下飼料中添加肌醇 1 600 mg?kg?1(LJ5組)可使凡納濱對蝦的AKP、T-SOD和NOS活性與HJ0組無顯著差異 (P>0.05)，ACP活性顯著高于HJ0組 (P<0.05)。雙因素方差分析顯示，鹽度對ACP、AKP、T-SOD和NOS有顯著影響 (P<0.05)，肌醇水平對ACP、AKP和NOS有顯著影響(P<0.05)，鹽度和肌醇水平的交互作用對AKP、TSOD和NOS有顯著影響 (P<0.05)。

表5 肌醇對凡納濱對蝦幼蝦部分非特異性免疫酶活的影響Table 5 Effects of inositol on some non-specific immunoenzyme activities for juvenile L. vannamei

3 討論

水生動物的生長受水體環(huán)境和飼料等因素的影響，良好的水體環(huán)境和飼料是其取得優(yōu)良生長狀況的重要保障。飼料系數(shù)反映了飼料利用率，飼料系數(shù)越低，說明飼料轉化率越高，飼喂效果越好。本研究中，鹽度和肌醇對終末體質量、增重率、成活率、特定生長率和飼料系數(shù)的影響存在交互作用，飼料中添加肌醇可顯著提高不同鹽度下凡納濱對蝦的上述指標，但對不同鹽度下蝦的促生長作用效果不同。在鹽度 28 下投喂 800 或 1 600 mg?kg?1肌醇可使蝦的終末體質量、增重率、特定生長率達到最高水平，投喂 1 600 mg?kg?1肌醇飼料系數(shù)達到最低水平，投喂不低于 100 mg?kg?1肌醇或鹽度 4 投喂不低于 200 mg?kg?1肌醇成活率達到最高水平，而1 600 mg?kg?1肌醇組終末體質量、增重率、成活率和特定生長率最大，飼料系數(shù)最小，表明肌醇能促進不同鹽度下蝦的生長、發(fā)育且實現(xiàn)了飼料的高效利用，且高鹽度更優(yōu)。這與Chen等[30]飼料中添加肌醇可促進凡納濱對蝦生長的研究結果一致，后者報道了肌醇水平高于 1 568 mg?kg?1不會進一步提高蝦的生長性能。凡納濱對蝦在滲透壓調節(jié)過程中的能量主要由蛋白質提供[37]，不同鹽度下對蛋白質的需求量不同。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度2和28的環(huán)境中，凡納濱對蝦的最適蛋白質需求量分別為26.7%和33.0%[37]。本研究中，飼料蛋白質水平為40.0%(魚粉16.00%)，飼料中添加肌醇降低了飼料系數(shù)，提高了凡納濱對蝦對飼料營養(yǎng)成分的利用，增強了其自身蛋白質的生成和貯存能力，且低鹽條件和高肌醇水平下這種作用更明顯，表明肌醇有利于低鹽度養(yǎng)殖凡納濱對蝦正常生長狀態(tài)的恢復，但具體的作用機制需測定相關基因后進一步驗證分析。

ACP、AKP、T-SOD和NOS是重要的非特異性免疫酶指標。AKP和ACP參與細胞調控周期中蛋白 (酶) 的去磷酸化階段[39]，在生物體免疫反應時可以催化磷酸酯類物質水解生成無機磷酸并伴隨促進ATP的生成[40]。有研究表明，水產動物在面對外界不良環(huán)境變化如低鹽或鹽度驟變時體內AKP和ACP的活性均受到抑制[41-42]，這與腺嘌呤核糖核苷酸活化蛋白激酶 (AMPK) 有關，在滲透壓調節(jié)過程中，凡納濱對蝦體內AMPK通過激活ATP產生途徑和阻斷ATP消耗來管理過量的能量消耗[43]。有研究指出鹽度3較鹽度30的AMPK轉錄和蛋白質水平高[43]。本研究中，鹽度和肌醇對AKP、T-SOD和NOS活性的影響存在交互作用，飼料中添加肌醇提高了AKP活性，鹽度28且肌醇水平 100 mg?kg?1時，AKP 活性最高。在飼料中添加肌醇有利于凡納濱對蝦中AKP和ACP活性的增強[44-45]，飼料中肌醇水平為 600 mg?kg?1時，血淋巴中AKP活性最高[30]；中華絨螯蟹 (Eriocheir sinensis)攝食肌醇水平為 1 650 mg?kg?1時，血清中AKP 活性最高[46]；因此，投喂 100 mg?kg?1肌醇正常鹽度養(yǎng)殖凡納濱對蝦有利于提高其非特異性免疫力。T-SOD是機體內清除氧自由基的酶類，可反映機體的抗氧化能力[38]。本研究中，鹽度28且肌醇水平 400 mg?kg?1時 T-SOD 活性最高，說明投喂100 mg?kg?1肌醇、正常鹽度養(yǎng)殖凡納濱對蝦有利于提高其抗氧化能力。NOS是體現(xiàn)動物健康的一個重要指標，是生物體內合成一氧化氮 (NO) 過程中的關鍵酶，可作用于病原體的核酸生物體內，催化產生的NO具有殺滅細菌、病毒和寄生蟲等作用[12]，其活性受脂質代謝、細胞內鈣離子或信號傳導的影響[47]。有研究指出，HcNOS具有高度保守性，是典型的無脊椎NOS，可能是應對細菌感染和組織移植的關鍵角色[43]。本研究中，鹽度28、肌醇水平 400 mg?kg?1時 NOS 活性最高，說明飼料中添加適量肌醇有利于提高凡納濱對蝦對氨氮環(huán)境的適應能力，這與Chen等[44]的研究結果一致(肌醇水平介于 459.7～993.8 mg?kg?1時，凡納濱對蝦可適應總氨氮質量濃度為 60.21 mg?L?1的環(huán)境)。

4 結論

凡納濱對蝦幼蝦的生長和肝胰腺非特異性免疫指標隨攝食肌醇的劑量和鹽度不同而呈不同的變化趨勢。鹽度可顯著影響其生長和非特異性免疫指標，各指標最大值出現(xiàn)在28鹽度組。肌醇和鹽度對凡納濱對蝦的各生長指標和AKP、T-SOD、NOS活性的影響存在交互作用，飼料中添加肌醇可促進凡納濱對蝦的生長發(fā)育，提高其成活率和非特異性免疫力；飼料中添加肌醇介于800～1 600 mg?kg?1時能使兩種鹽度條件下凡納濱對蝦均獲得最佳的生長發(fā)育和成活率；鹽度28條件下，飼料中肌醇水平為 100 或 400 mg?kg?1時，蝦可獲得良好的非特異性免疫力；鹽度4條件下，凡納濱對蝦的生長和非特異性免疫力受到抑制，飼料中肌醇水平不低于200 mg?kg?1可在一定程度上提高其免疫力。