吳 楊，楊 鏗，黃小林，周傳朋，徐創(chuàng)文，黃 忠,，虞 為,，荀鵬偉,5，黃健彬,5，麥曉勇，林黑著,

1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 秦皇島 066003

2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510300

3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗基地，廣東 深圳 518121

4. 廣州市欣海利生生物科技有限公司，廣東 廣州 510300

5. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306

卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus) 屬于暖水性魚類，生活在中上水層，在我國東海、黃海以及南海海域均有分布。其具有生長速度快，體型較大，溫度、鹽度適應(yīng)范圍廣[1-2]和價格適宜等特點，深受人們青睞，是我國廣東、廣西和海南等地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類之一。

腸道是動物消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)和抵御外來病原微生物的重要場所[3]。腸道內(nèi)存在一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，含有大量的微生物，這些微生物構(gòu)成了動物的腸道菌群[4]。腸道菌群是腸道黏膜屏障的重要組成部分，對魚類的腸道健康至關(guān)重要。魚類腸道菌群受養(yǎng)殖水體環(huán)境、食物組成以及魚體不同發(fā)育階段和健康狀況的影響，正常狀態(tài)下腸道菌群保持動態(tài)平衡[5-6]，腸道菌群紊亂可能會損害宿主的健康。外源益生菌的攝入能改善宿主的腸道菌群，抑制病原微生物生長，維持腸道微生物的動態(tài)平衡，改善宿主的腸道健康[7]。益生菌是一種健康、綠色、安全的微生態(tài)制劑，可以作為飼料添加劑或者直接用于養(yǎng)殖水體，能部分替代抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用[8-9]。丁酸梭菌 (Clostridium butyricum) 是一種革蘭氏陽性、嚴(yán)格厭氧、形成內(nèi)生孢子的益生菌[10-11]，可提供短鏈脂肪酸 (SCFA) 特別是丁酸，用于腸道上皮細(xì)胞的再生和修復(fù)，調(diào)節(jié)腸道健康微生態(tài)環(huán)境[12-13]。此外，丁酸梭菌可以耐受低pH和高溫條件，對某些抗生素具有抗性[14-15]。對鮸 (Miichthys miiuy)[16]、鯉 (Cyprinus carpio)[17]、凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei)[18-19]的研究表明，丁酸梭菌在促進(jìn)水生動物生長、提高酶活性、調(diào)節(jié)腸道菌群和增強免疫力等方面發(fā)揮著重要作用。

本實驗通過在飼料中添加丁酸梭菌菌液拌料投喂卵形鯧鲹幼魚，研究其對卵形鯧鲹幼魚生長性能和腸道菌群的影響，以期為丁酸梭菌在卵形鯧鲹養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸梭菌菌液由廣州欣海利生生物科技有限公司提供，丁酸梭菌菌液濃度實測值為 1×109CFU·mL?1，卵形鯧鲹幼魚購自深圳市龍岐莊實業(yè)發(fā)展有限公司，基礎(chǔ)飼料為廣東越群海洋生物有限公司共利牌鯧魚專用飼料?；A(chǔ)飼料干物質(zhì)主要營養(yǎng)水平 (質(zhì)量分?jǐn)?shù))：粗蛋白≥42.0%，粗脂肪≥6.0%，粗纖維≤4.0%，粗灰分≤14.0%，賴氨酸≥2.2%，鈣≥2.0%，總磷≥1.2%，水分≤10.0%。

1.2 飼養(yǎng)管理

池塘于試驗開始前清塘沖洗，放苗前10 d使用二氧化氯 (ClO2) 消毒劑進(jìn)行水體消毒，試驗過程中進(jìn)水經(jīng)40目紗網(wǎng)過濾以避免自然海水中浮游動物對養(yǎng)殖試驗造成干擾。分魚前將卵形鯧鲹幼魚暫養(yǎng)于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗基地池塘網(wǎng)箱7 d，饑餓24 h后用丁香酚麻醉。隨機挑選健康狀況良好、大小規(guī)格相似的卵形鯧鲹幼魚分布于 15 個 1 m×1 m×1.5 m (長×寬×高) 的網(wǎng)箱 (網(wǎng)目為 1 cm) 里，每個網(wǎng)箱 25 尾，初始體質(zhì)量為 (9.5±0.3) g，隨機分為5組，每組3個重復(fù)。本試驗采用丁酸梭菌菌液拌料投喂卵形鯧鲹幼魚。對照組M0投喂基礎(chǔ)飼料，實驗組 M1、M2、M3和 M4分別投喂添加 1% (1×107CFU·g?1)、2% (2×107CFU·g?1)、3% (3×107CFU·g?1) 和 4%(4×107CFU·g?1) 的丁酸梭菌菌液的飼料。添加方法為將丁酸梭菌菌液溶解于蒸餾水中，按上述比例均勻噴灑于基礎(chǔ)飼料顆粒上，對照組噴灑等量的蒸餾水，配制的飼料于4 ℃冰箱保存。每次投喂量約為體質(zhì)量的2%，剩余飼料回收干燥后重新稱質(zhì)量并記錄，養(yǎng)殖試驗進(jìn)行20 d。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后將卵形鯧鲹幼魚饑餓24 h，麻醉后稱取各網(wǎng)箱全部魚的總質(zhì)量并記錄用以分析生長差異，每個網(wǎng)箱隨機取5尾魚用于全魚體成分分析，另外從每個網(wǎng)箱中隨機取3尾測量體長、稱體質(zhì)量用于計算肥滿度，解剖后取出內(nèi)臟團和肝臟，分別稱質(zhì)量并記錄用以分析臟體比和肝體比。剪取腸道后腸于5 mL離心管中，液氮浸泡后于?80 ℃保存，用于腸道菌群分析。

1.4 指標(biāo)測定

增重率 (Weight gain rate, WGR, %)、特定生長率 (Specific growth rate, SGR, %·d?1)、飼料系數(shù) (Feed coefficient,FC)、肥滿度 (Condition factor, CF)、臟體比 (Viscerosomatic index, VSI, %)、肝體比 (Hepatosomatic index, HSI,%) 等指標(biāo)計算公式為：

式中：Wt為末均質(zhì)量 (g)；W0為初均質(zhì)量 (g)；t為天數(shù)(d)；F為攝食量 (g)；Wh為肝臟質(zhì)量 (g)；Wv為內(nèi)臟質(zhì)量(g)；Wb為魚體質(zhì)量 (g)；L為魚體長 (cm)。

1.5 樣品測定

全魚和肌肉粗蛋白采用凱氏定氮法測定 (FOSS 2300,Hoganas, Sweden)；粗脂肪采用索氏抽提法測定 (以石油醚為抽提劑，Soxtec Avanti 2050, Foss TecatorAB, Switzerland)；水分用常壓干燥法測定 (烘箱，105 ℃)；灰分采用550 ℃ 馬弗爐灼燒法測定 (FO610C, Yamato Scientific Co.Ltd., Japan)；腸道菌群結(jié)構(gòu)送往廣州吉瑞基因科技有限公司測定。

1.6 腸道菌群多樣性測定

腸道菌群結(jié)構(gòu)委托廣州吉瑞基因科技有限公司測定。采用操作分類單元 (OTU)、Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、香濃指數(shù) (Shannon) 和辛普森指數(shù) (Simpson) 等參數(shù)評估腸道菌群的Alpha多樣性，腸道菌群的Beta多樣性利用PCA主成分分析評估，并計算各菌群在門和屬水平上的相對豐度，分析腸道菌群的組成特征。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2019和SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA)，所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (SD)”表示，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較分析，P<0.05為差異顯著。如果試驗組間腸道菌群多樣性分析的差異顯著，則進(jìn)一步采用Tukey's HSD檢驗進(jìn)行多重比較，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 卵形鯧鲹幼魚的生長性能和飼料利用率

隨著飼料中丁酸梭菌菌液添加量的增加，卵形鯧鲹的終末質(zhì)量、增重率、特定生長率表現(xiàn)出升高后降低的趨勢(表1)。2%添加組的增重率和特定生長率顯著高于4%添加組 (P<0.05)，其余各組間無顯著差異 (P>0.05)。2%添加組的飼料系數(shù)最低，且與對照組、4%添加組間存在顯著差異 (P<0.05)。各組間肥滿度、臟體比、肝體比均無顯著差異 (P>0.05)。

表1 飼料中添加丁酸梭菌對卵形鯧鲹幼魚生長性能的影響Table 1 Effects of dietary supplementation of C. butyricum on growth performance of juvenile T. ovatus

通過線性回歸分析，得出一元二次方程y=?5.071 4x2+19.386x+125.86，計算最高點的曲線坐標(biāo)，得出當(dāng)丁酸梭菌添加量為1.91%時，卵形鯧鲹的增重率最大 (圖1)。

圖1 卵形鯧鲹幼魚增重率與飼料中丁酸梭菌添加量的關(guān)系Fig. 1 Relationship between weight gain rate of juvenile T. ovatus and amount of C. butyricum added in diet

2.2 卵形鯧鲹幼魚的全魚體成分

各組全魚體成分見表2，各組之間的水分、粗脂肪、粗灰分、粗蛋白無顯著差異 (P>0.05)。

表2 飼料中添加丁酸梭菌對卵形鯧鲹幼魚全魚營養(yǎng)成分的影響 (干質(zhì)量)Table 2 Effects of dietary supplementation of C. butyricum on whole fish nutrient composition of juvenile T. ovatus (dry mass) %

2.3 卵形鯧鲹幼魚的腸道菌群

2.3.1 腸道菌群微生物 OTU 及 Alphy多樣性分析

不同處理組卵形鯧鲹幼魚腸道菌群稀釋性曲線 (圖2)趨于平緩，測序覆蓋率≥99.85%，表明對各組的卵形鯧鲹腸道微生物菌群的測序深度合理，能覆蓋樣品中的絕大部分物種。通過16S rRNA高通量測序共獲得135 923條序列，平均序列長度為1 490 bp。在相似水平為97%下，共獲得了63個運算分類單元 (OTU)。由不同處理組卵形鯧鲹腸道菌群OTUs的venu圖 (圖3) 可得，各組間共有的OTU數(shù)為25個。3%添加組的Chao1和Ace指數(shù)最高，群落豐富度最大。2%添加組的Shannon指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最小，卵形鯧鲹腸道菌群群落的多樣性最大，與對照組和4%添加組有顯著差異 (P<0.05)；對照組和4%添加組的Shannon指數(shù)接近，差異較小，腸道菌群群落的多樣性相似 (表3)。隨著飼料中丁酸梭菌添加量的增加，卵形鯧鲹腸道菌群群落的多樣性和豐富度表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。

表3 不同處理組卵形鯧鲹幼魚腸道菌群的多樣性統(tǒng)計Table 3 Diversity statistics of intestinal samples of juvenile T. ovatus in different treatment groups

圖2 不同處理組卵形鯧鲹幼魚腸道菌群稀釋性曲線Fig. 2 Dilution curve of intestinal flora of juvenile T. ovatus in different treatment groups

圖3 不同處理組卵形鯧鲹幼魚腸道菌群的OTUs的venus圖Fig. 3 Venus map of OTUs intestinal flora of juvenile T. ovatus in different treatment groups

2.3.2 腸道菌群 Beta 多樣性分析

各組的腸道菌群組內(nèi)重復(fù)樣品距離較近，表明各組組內(nèi)的微生物組成結(jié)構(gòu)相似 (圖4、圖5)。1%和2%添加組距離較近，且與對照組距離較遠(yuǎn)，表明1%和2%添加組的親緣關(guān)系較近，微生物組成結(jié)構(gòu)相似，與對照組親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而3%添加組與對照組傾向于聚集在一起，物種組成結(jié)構(gòu)相似度較高。

圖4 不同處理組卵形鯧鲹幼魚腸道菌群主坐標(biāo)分析Fig. 4 Principal co-ordinates analysis of intestinal flora of juvenile T. ovatus in different treatment groups

圖5 不同處理組卵形鯧鲹幼魚腸道菌群主成分分析Fig. 5 Principal component analysis of intestinal flora of juvenile T. ovatus in different treatment groups

2.3.3 腸道菌群組成及其相對豐度分析

各組的腸道菌種在門水平上的主要組成見圖6，在卵形鯧鲹腸道中注釋到9個門水平上的菌群，其中軟壁菌門和變形菌門是所有樣品中均包含的豐度最高的兩個門，分別占樣品所包含物種總數(shù)目的61.87%和36.65%。變形菌門是1%和2%添加組中豐度最高的門，分別占53.68%和57.16%。軟壁菌門是對照組、3%和4%添加組中豐度最高的門，分別占73.72%、64.04%和85.01%。在門水平上對各組間進(jìn)行差異性檢驗分析，發(fā)現(xiàn)各組之間的軟壁菌門和變形菌門的豐度均有顯著差異 (P<0.05)。隨著飼料中丁酸梭菌添加量的增加，變形菌門的豐度先升后降，軟壁菌門的豐度趨勢則與之相反。

圖6 不同處理組卵形鯧鲹幼魚腸道菌群在門水平上的相對豐度聚類堆疊圖Fig. 6 Cluster stack diagram of relative abundance of intestinal flora of juvenile T. ovatus in different treatment groups at phylum level

從屬水平上分析各組的腸道菌群結(jié)構(gòu)及分布，發(fā)現(xiàn)在卵形鯧鲹幼魚腸道中注釋到35個屬水平上的菌群，對豐度百分比小于1%的區(qū)域進(jìn)行合并 (圖7)。支原體屬(Mycoplasma)、發(fā)光細(xì)菌屬 (Photobacterium) 和弧菌屬(Vibiro) 是卵形鯧鲹腸道菌群豐度最高的菌屬。2%添加組的最優(yōu)勢菌屬是弧菌屬，占該組全部屬的54.75%，其余各組豐度最高的菌屬均為支原體屬。發(fā)光細(xì)菌屬是3種優(yōu)勢菌屬中豐度較低的菌屬，占樣品所包含物種總數(shù)目的12.01%。隨著丁酸梭菌添加量的增加，支原體屬的豐度表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，弧菌屬的豐度趨勢與之相反。在屬水平上對各組間進(jìn)行差異性檢驗分析，發(fā)現(xiàn)各組之間的支原體屬和發(fā)光細(xì)菌屬均有顯著差異 (P<0.05)，對照組和4%添加組的發(fā)光細(xì)菌屬占比相似，分別為2.42%和2.41%，與其他各組之間差異顯著 (P<0.05)。此外，在對各組魚體腸道菌群的測定中并未發(fā)現(xiàn)梭菌屬的分布。

圖7 不同處理組卵形鯧鲹幼魚腸道菌群在屬水平上的相對豐度聚類堆疊圖Fig. 7 Cluster stack diagram of relative abundance of intestinal flora of juvenile T. ovatus in different treatment groups at genus level

3 討論

3.1 丁酸梭菌對卵形鯧鲹生長性能和體成分的影響

飼料中添加丁酸梭菌能促進(jìn)魚類的生長，提高飼料利用率[16,20-22]。本試驗中，2%添加組的增重率和特定生長率最大，且飼料系數(shù)顯著低于對照組，這表明丁酸梭菌提高了卵形鯧鲹的生長性能和飼料利用率。丁酸梭菌對生長性能和飼料利用率的積極作用可能與腸道中該益生菌代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸有關(guān)。短鏈脂肪酸能為腸道細(xì)胞代謝提供能量來源，提高腸道消化酶的活性，從而促進(jìn)動物對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[7]。然而，4%添加組的特定生長率和增重率顯著低于2%添加組，過量的丁酸梭菌導(dǎo)致卵形鯧鲹的特定生長率和飼料利用率下降，這與丁酸梭菌在奧尼羅非魚 (Oreochromisniloticus×O. aureus)[23]、羅氏沼蝦 (Macrobrachium rosenbergii)[24]中的研究類似。就生長性能而言，與2%添加組相比，4%添加組卵形鯧鲹幼魚的生長性能顯著降低，可能的原因是：1) 過量的丁酸梭菌導(dǎo)致了卵形鯧鲹幼魚胃腸道菌群的不平衡[25]，影響了其他有益菌的生長，造成微生物群多樣性和豐富度降低；2) 過量的丁酸梭菌會大量消耗卵形鯧鲹腸道的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致卵形鯧鲹生長性能降低。本試驗中，各組之間全魚的水分、粗脂肪、粗灰分、粗蛋白無顯著差異，這與丁酸梭菌在羅非魚[23]中的研究結(jié)果一致。

3.2 丁酸梭菌對卵形鯧鲹腸道菌群的影響

腸道微生物菌群參與機體代謝、營養(yǎng)吸收、生長發(fā)育和免疫等生理過程[26-27]，腸道正常菌群的穩(wěn)定有利于宿主的健康。本試驗中，丁酸梭菌添加組的腸道菌群OTU數(shù)目與對照組無顯著差異，這與對虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)[22]的研究結(jié)果類似。在魚類中，腸道菌群多樣性與宿主的腸道健康密切相關(guān)[28]。Alpha多樣性通過分析Chao1、Ace、Shannon、Simpson等指數(shù)來反映動物腸道微生物群落的豐富度和多樣性。Chao1和Ace指數(shù)越大代表群落豐富度越高，Shannon數(shù)值越大，Simpson數(shù)值越小，則說明菌群群落多樣性越高。1%、2%和3%添加組的Shannon指數(shù)顯著高于對照組，Simpson指數(shù)顯著低于對照組，表明適量的丁酸梭菌能顯著提高卵形鯧鲹腸道菌群多樣性，可能是因為添加丁酸梭菌改變了卵形鯧鲹幼魚腸道優(yōu)勢菌群數(shù)量，使其具有潛在的有益微生物群落。Beta多樣性可以反映樣本間的豐度分布差異程度。主成分分析 (PCA) 能將物種進(jìn)化程度方面類似的樣品聚類在一起，主坐標(biāo)分析(PCOA)是將物種分布程度方面類似的樣品聚類在一起[29]，兩者都能通過觀察樣品間的距離來判斷樣品的微生物組成結(jié)構(gòu)相似性。樣品間的距離越近，說明樣品之間的微生物組成結(jié)構(gòu)相似性越高，差異性越小。1%和2%添加組的腸道微生物菌落組成結(jié)構(gòu)相似，與對照組腸道微生物菌落親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)果表明飼料中丁酸梭菌的添加量是改變卵形鯧鲹腸道菌群結(jié)構(gòu)的主要因素，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在鯉[17]的研究中。添加外源益生菌是調(diào)控魚類腸道微生物菌群的手段之一，早期發(fā)育階段魚類腸道微生物菌群的組成和活性可以用添加益生菌的飼料來控制[30]。而對照組與3%添加組魚的腸道微生物菌落組成結(jié)構(gòu)相似，推測可能是3%添加量的丁酸梭菌對卵形鯧鲹幼魚腸道的益生作用較弱，對卵形鯧鲹幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響很小。

在卵形鯧鲹腸道中，變形菌門和軟壁菌門是主要的優(yōu)勢菌門[31-32]，這與本試驗的結(jié)果一致。地理因素對魚類腸道微生物群落的組成有重要影響，而變形菌門是中國沿海地區(qū)養(yǎng)殖水體的優(yōu)勢菌門[33-34]，這可能是變形菌門是卵形鯧鲹幼魚腸道菌群優(yōu)勢菌門的重要原因之一。飼料中添加益生菌能改變魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)腸道菌門豐度。如投喂添加2%多種益生菌復(fù)配的飼料能夠顯著影響草魚(Ctenopharyngodon idella)[35]中變形菌門、放線菌門、藍(lán)藻菌門、衣原體門、螺旋藻菌門的豐度。在本試驗中，1%、2%和3%丁酸梭菌組腸道中的變形菌門豐度顯著高于對照組，軟壁菌門豐度顯著低于對照組。類似地，在飼料中添加丁酸梭菌能提高羅非魚腸道中浮霉菌門和變形菌門的豐度[24]。變形菌門能分解代謝飼料成分[36]，其豐度的增加，可能有利于卵形鯧鲹吸收飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)。在屬水平上，卵形鯧鲹幼魚腸道的優(yōu)勢菌屬為弧菌屬、支原體屬以及發(fā)光細(xì)菌屬。支原體屬屬于軟壁菌門，有研究發(fā)現(xiàn)支原體屬細(xì)菌是致病菌[37]。在本試驗中，1%、2%和3%添加組的支原體屬豐度顯著低于對照組，4%添加組的支原體屬豐度顯著高于對照組。這表明，飼料中添加適量丁酸梭菌能抑制支原體屬細(xì)菌的生長，有益于卵形鯧鲹幼魚的健康。但是添加過量的丁酸梭菌對支原體屬細(xì)菌的抑制作用逐漸減弱，甚至促進(jìn)支原體屬細(xì)菌的生長，這可能是由于過量的丁酸梭菌導(dǎo)致卵形鯧鲹幼魚腸道微生物菌群失衡，損害其腸道健康。此外，在投喂丁酸梭菌處理后飼料的各組魚體腸道菌群中未觀察到梭菌屬的分布，推測丁酸梭菌尚未在卵形鯧鲹幼魚腸道內(nèi)定植或占比極低。卵形鯧鲹幼魚腸道中梭菌屬并非優(yōu)勢菌屬[32,38]，這與本實驗結(jié)果類似。有學(xué)者認(rèn)為，丁酸梭菌即使未在動物腸道內(nèi)定植，也能發(fā)揮益生作用，如Duan等[18]推測丁酸梭菌可能不會在對蝦腸道內(nèi)定植，只在腸組織中產(chǎn)生有益的作用。死亡或滅活的益生菌也能在水產(chǎn)動物體內(nèi)發(fā)揮益生作用[39-40]，如Pan等[41]發(fā)現(xiàn)滅活的丁酸梭菌能增強鮸的免疫力和抗病力。本試驗中未發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌在卵形鯧鲹幼魚腸道內(nèi)定植，推測可能是因為養(yǎng)殖周期較短導(dǎo)致丁酸梭菌尚未定植或占比極低。

4 結(jié)論

飼料中添加1%～3%的丁酸梭菌對卵形鯧鲹幼魚的生長性能有促進(jìn)作用。根據(jù)二次回歸方程分析，卵形鯧鲹飼料中丁酸梭菌菌液的適宜添加量為 1.91% (1.91×107CFU·g?1)。此外，丁酸梭菌能顯著增加卵形鯧鲹的腸道菌群多樣性，調(diào)節(jié)腸道優(yōu)勢菌門和菌屬，從而促進(jìn)其腸道健康。