袁軻婷，任大鈞，萬 瓊，柴蓓蓓，康愛卿，雷曉輝,，陳 彬，陳 翔

1. 西安科技大學 建筑與土木工程學院，陜西 西安 710054

2. 河北工程大學/河北智慧水利重點實驗室，河北 邯鄲 056038

3. 河北工程大學 水利水電學院，河北 邯鄲 056038

4. 中國水利水電科學研究院，北京 100038

5. 河北工程大學/水污染控制與水生態(tài)修復(fù)技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 邯鄲 056038

6. 上?？睖y設(shè)計研究院有限公司，上海 200434

7. 中國長江三峽集團有限公司，湖北 武漢 430010

近年來，工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展導(dǎo)致水體中氮(N)、磷 (P) 等營養(yǎng)元素過剩，使水體呈富營養(yǎng)化狀態(tài)，導(dǎo)致藻華頻發(fā)。中國的太湖[1]、長江中下游[2]、三峽水庫[3]及北美的伊利湖[4]等均受到了有害藻華的困擾。根據(jù)2020年全國環(huán)境生態(tài)環(huán)境質(zhì)量簡況[5]，在110個湖泊 (水庫) 中，10個存在貧營養(yǎng)狀態(tài) (9.1%)，68 個中營養(yǎng)狀態(tài) (61.8%)，26 個輕度富營養(yǎng)狀態(tài) (23.6%)，5個中度富營養(yǎng)狀態(tài)(4.5%)，1個重度富營養(yǎng)狀態(tài) (0.9%)。銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa) 作為引起水體藻華的主要藻種之一，通過產(chǎn)生微囊藻毒素和藍藻毒素威脅環(huán)境生態(tài)和人類健康[6]。2007年太湖大部分水域爆發(fā)藻華，導(dǎo)致至少200萬居民的飲用水供給中斷1周[7]，且在夏季太湖水域更易受藻毒素污染。托萊多是俄亥俄州靠近伊利湖的一個中型城市，2014年8月因藻華導(dǎo)致微囊藻毒素質(zhì)量濃度 (3.19 μg?μL?1) 超過安全飲用水標準 (1.00 μg?μL?1)，造成 40 萬居民無飲用水[8]。

目前的除藻技術(shù)主要有物理法、化學法和生物法。物理法利用超聲波法[9]、混凝氣浮法[10]和高壓除藻法[11]等手段去除水體內(nèi)的藻類，雖然除藻效果明顯，但經(jīng)濟性較差，且可能引發(fā)公共健康等問題，因而不適用于大面積的水體治理；化學法采用硫酸銅[12]和過氧化氫[13]等手段，通常用于處理小水體中的藍藻，但硫酸銅會導(dǎo)致細胞內(nèi)微囊藻毒素釋放到周圍的水體中，造成金屬化合物的二次污染，也影響生物多樣性及惡化富營養(yǎng)化，處理成本高；生物法已被證明是一種環(huán)境友好型且很有應(yīng)用前景的除藻技術(shù)[14-15]。目前研究集中在生物制劑的使用上，尤其是藻類細菌。已從自然生態(tài)系統(tǒng)中分離出多種溶藻菌類型，包括假單胞菌屬 (Pseudomonassp.)[16]、噬胞菌屬 (Cytophagasp.)[17]、腐生螺旋體屬 (Saprospirasp.)[18]、交替單胞菌屬 (Alteromonassp.)[19]、交替假單胞菌屬 (Pseudoalteromonassp.)[20]、檸檬酸菌屬 (Citrobacersp.)[21]、弧菌屬 (Vibriosp.)[22-23]和芽孢桿菌屬 (Bacillussp.)[24]等。

本研究從陜西省某水庫的底泥中分離出一株對銅綠微囊藻具有溶解作用的菌株G2，并通過16S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析對其進行鑒定，同時探究了不同條件 (生長周期、溫度、pH和光照強度)下，G2對銅綠微囊藻的溶藻活性，以期為G2實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種培養(yǎng)

銅綠微囊藻 (FACH-905) 由中國科學院淡水藻種庫提供，將藻種接種到BG-11液體培養(yǎng)基，置于25 ℃、光照強度 2 500 lx、光周期 12 L∶12 D 的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。

1.1.2 菌種培養(yǎng)

從陜西省西安市某水庫的底泥中分離出一株具有溶藻效果的菌株G2，將其接種到高氏一號固體培養(yǎng)基上，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 溶藻菌的分離鑒定

將西安市某水庫采集的底泥帶回實驗室后加入超純水中置于恒溫振蕩儀內(nèi)，在25 ℃下以200 r·min?1的速率振蕩 48 h，振蕩后底泥溶液逐級稀釋，用稀釋涂布法對樣本中的菌株挑選培養(yǎng)后篩出菌株，將其分離純化在固態(tài)平板培養(yǎng)基上，觀察其形態(tài)特征，并進行記錄。然后將菌株制備成液體培養(yǎng)基，分別將其按一定比例投加至裝有藻液的平板培養(yǎng)基內(nèi)，進行72 h的溶藻實驗觀察。先進行初篩，將藻液出現(xiàn)黃化現(xiàn)象的菌株留下，并將其投加至預(yù)先培養(yǎng)14 d的銅綠微囊藻藻液的平板培養(yǎng)基內(nèi)，7 d后計算各菌株除藻率，將除藻率較高的菌株作為本實驗菌種。利用16S rDNA技術(shù)對該溶藻菌的序列進行鑒定。用引物27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 和 1492R (5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3) 進行PCR擴增。PCR擴增程序：95 ℃ 預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸 7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后測序。所得序列在國家生物技術(shù)信息中心 (NCBI) 中進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 溶藻菌生長曲線測定

在無菌操作臺內(nèi)，采用接種環(huán)挑取少量在固態(tài)培養(yǎng)基內(nèi)長勢良好的溶藻菌，接種至LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，將其置于 25 ℃、200 r·min?1的搖床內(nèi)進行培養(yǎng)。每隔12 h測定其在600 nm處的吸光度(OD600)，連續(xù)測定7 d，以O(shè)D600為縱坐標，時間t為橫坐標，繪制溶藻菌的生長曲線，每個實驗組設(shè)置3組平行。

1.2.3 葉綠素與除藻率測定

采用乙醇萃取法測定藻類葉綠素a質(zhì)量濃度[25]，除藻率Ra(%) 的計算方法[26]為：

式中：C0表示初始藻液葉綠素a質(zhì)量濃度 (mg·L?1)；Ct表示最終藻液葉綠素a質(zhì)量濃度 (mg·L?1)。

1.2.4 溶藻菌的溶藻方式

將該溶藻菌用接種環(huán)接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng) 72 h 后以 2 000 r·min?1的轉(zhuǎn)速將菌液離心15 min，采用0.22 μm無菌纖維素微孔濾膜分離菌細胞和上清液，以10%投加比例將菌細胞及上清液分別加入預(yù)培養(yǎng)2周相同狀況的銅綠微囊藻藻液，進行8 d的溶藻實驗，每隔2 d測定葉綠素a質(zhì)量濃度，計算除藻率，每個實驗組設(shè)置3組平行。

1.2.5 生長期對溶藻效果的影響

根據(jù)溶藻菌的生長曲線，分別取延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期的菌液，以5%的投加比分別加入至預(yù)培養(yǎng)2周、生長狀況一致的銅綠微囊藻藻液內(nèi)，在 25 ℃、2 500 lx、12 L∶12 D 光周期條件下進行8 d的溶藻實驗，每隔2 d測定葉綠素a質(zhì)量濃度，計算除藻率，每個實驗組設(shè)置3組平行。

1.2.6 投加比例對溶藻效果的影響

將溶藻菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，取菌液，按照體積比2%、5%、10%、15%分別加入至200 mL預(yù)培養(yǎng)2周、生長狀況一致的銅綠微囊藻藻液內(nèi)，并以加入相同體積比、未含溶藻菌菌液的 LB 液體培養(yǎng)基為對照組，在 25 ℃、2 500 lx、12 L∶12 D光周期條件下進行溶藻實驗，共進行8 d，每隔2 d測定葉綠素a質(zhì)量濃度，計算除藻率，每個實驗組設(shè)置3組平行。

1.2.7 pH 對溶藻效果的影響

將該菌株的無菌濾液用氫氧化鈉 (NaOH) 與氯化氫 (HCl) 溶液調(diào)節(jié) pH 至 3、5、7、9 和 11，在每個pH下保持1 h后將pH調(diào)至初始值。按照體積比為2%，將處理過的無菌濾液接種到相同條件預(yù)培養(yǎng)2周的銅綠微囊藻藻液內(nèi)，待無菌濾液與藻液反應(yīng)72 h后測定藻液葉綠素a質(zhì)量濃度，計算除藻率，每個實驗組設(shè)置3組平行。

1.2.8 溫度對溶藻效果的影響

將該菌株的無菌濾液分別在5 (冰箱冷藏1 h)、25 、50 、75 ℃ 水浴中加熱 1 h，并 120 ℃ 高溫滅菌 30 min，然后將濾液置于室溫 (25 ℃) 中，待無菌濾液溫度上升或下降至室溫后，按照體積比2%，將處理過的無菌濾液接種至相同狀況的預(yù)培養(yǎng)2周的銅綠微囊藻內(nèi)，待無菌濾液與藻液反應(yīng)72 h后，測定反應(yīng)后的藻液葉綠素a質(zhì)量濃度，計算除藻率，每個實驗組設(shè)置3組平行。

1.2.9 光照時間對除藻率效果的影響

取處于對數(shù)生長期的溶藻菌菌液，以5%的體積比加入至預(yù)培養(yǎng)2周的銅綠微囊藻藻液內(nèi)，控制其光周期分別為 0 L∶24 D (全黑暗)、12 L∶12 D和 24 L∶0 D (全光照)，光照強度為 2 500 lx，溫度為25 ℃。每個光暗比下設(shè)置3個平行，進行溶藻實驗，共進行8 d，每隔2 d測定葉綠素a質(zhì)量濃度，計算除藻率，每個實驗組設(shè)置3個重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本實驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2010 和 Origin 2017 軟件進行分析與繪圖，系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA 7軟件進行繪制。

2 結(jié)果

2.1 溶藻菌的篩選與鑒定

2.1.1 溶藻菌的篩選

經(jīng)初篩和復(fù)篩后分離出1株對銅綠微囊藻有穩(wěn)定溶藻效果的細菌，菌株命名為G2，作為本實驗的試驗菌株。G2呈橘色，表面有凸起狀，邊緣規(guī)則 (圖1)。

圖1 菌株G2的菌落Fig. 1 Colony of Strain G2

2.1.2 溶藻菌 16S rDNA 鑒定對分離出的G2進行16S rDNA鑒定，測得其序列長度為1 387 bp。將所測序列在NCBI中進行比對，并使用MEGA軟件對該菌株進行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖2)，發(fā)現(xiàn)G2與纖維弧菌屬 (Cellvibriosp.) 的菌株相似性大于 98%，并將該菌株序列上傳至GenBank，獲得登錄號MW221316。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的菌株G2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Constructed phylogenetic tree of Strain G2 based on 16S rDNA gene sequence

2.2 溶藻菌 G2 生長曲線

根據(jù)細菌懸液濃度和光密度成正比[27]，通過分光光度計測定菌劑在600 nm下的吸光度，得到G2的生長曲線 (圖3)，測得其延滯期為0～36 h，對數(shù)期為 36～72 h，穩(wěn)定期為 72～84 h，84 h 后進入衰亡期。

圖3 溶藻菌G2生長曲線Fig. 3 Growth curve of Strain G2

2.3 溶藻菌 G2 的溶藻方式

本研究將菌劑離心處理后，通過濾膜過濾，將無菌濾液和菌細胞分離后分別加入至銅綠微囊藻藻液內(nèi)，結(jié)果見圖4。G2上清液和菌細胞處理組在第8天的平均除藻率分別達 (52.43±2.20)%和(13.01±0.57)%，上清液的溶藻效果明顯優(yōu)于菌細胞本身，說明其分泌溶藻物質(zhì)去除藻，也通過自身溶解藻細胞。菌體本身對藻類表現(xiàn)出有一定的去除效果，可能是因為菌體投入至藻液后自身釋放出少量的抑藻活性物質(zhì)所致。而對照組 (CK) 并未出現(xiàn)藻細胞溶解的現(xiàn)象，該組藻細胞仍處于生長狀態(tài)。推測該細菌是通過分泌具有溶藻效果的胞外物質(zhì)對銅綠微囊藻進行溶解，而不是通過菌細胞本身，因此G2的溶藻方式為間接溶藻。

圖4 菌株G2的溶藻方式Fig. 4 Algicidal mode of Strain G2

2.4 溶藻菌 G2 的溶藻特性

2.4.1 不同生長期 G2 的溶藻效果

不同生長周期G2溶藻效果見圖5。不同生長周期G2在第8天均達到最大除藻率，穩(wěn)定期為(56.72±1.17)%，分別比對數(shù)期、衰亡期和延滯期高 (14.03±1.33)%、(4.29±1.46)% 和 (38.31±2.55)%。穩(wěn)定期獲得最佳的除藻效果，可能是溶藻菌從對數(shù)期后分泌具有抑藻效果的胞外物質(zhì)大于延滯期所分泌的胞外物質(zhì)。此外，選用該菌的穩(wěn)定期進行溶藻實驗，在處理后第4天相對于其他3個階段有較大幅度的提升，第 2—第 4 天該菌株在延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期除藻率分別提升了 2.80%、7.14%、17.63% 和 14.84%，穩(wěn)定期的菌株在反應(yīng)第4天的除藻率達42.02%，因此該菌株適合將穩(wěn)定階段的菌液投加進行溶藻，可在短期內(nèi)獲得較好的效果。

圖5 不同生長期下菌株G2的溶藻效果Fig. 5 Algicidal effect of Strain G2 at different growth stages

2.4.2 投加比例對溶藻效果的影響

不同投加比例下G2溶藻效果見圖6。G2的菌液隨著投加比例 (V/V) 的增加，對銅綠微囊藻的去除效果逐漸提升。分別以2%、5%、10%和15%的投加比例加入至銅綠微囊藻，第8 天各組平均除藻率分別達 (26.9±2.31)%、(39.79±1.41)%、(54.32±0.40)% 和 (54.97±1.87)%。投加比例是反映細菌密度的重要參數(shù)，初期的投加比例越高，其溶藻效果越顯著。投加比例為15%時，第2—第4天的48 h內(nèi)除藻率增長速率高于其他組別。該菌株的最佳投加比例為10%，在10%和15%的投加比例組分別處理藻細胞8 d后，其去除效果基本一致，均約54%，因此過多投入菌劑對溶藻效果并無明顯提升。

圖6 不同投加比例下菌株G2的溶藻效果Fig. 6 Algicidal effect of Strain G2 with different proportions

2.4.3 pH 對溶藻效果的影響

不同pH下除藻率均隨著培養(yǎng)時間的增加而增大 (圖7)。培養(yǎng)至第4天時，除藻率隨著pH的增大呈先增后減的趨勢，pH為7時獲得最大除藻率(47.46±1.63)%。第 8天，pH 3、5、7、9、11組的除藻率分別為 (53.80±1.02)%、(56.92±1.44)%、(55.96±4.22)%、(54.43±2.03)% 和 (53.38±2.18)%，說明G2在不同pH下溶藻能力差異性較小，具有良好的耐酸堿性，對于偏酸性和偏堿性的水體有較強的適用性。

圖7 不同pH下菌株G2的溶藻效果Fig. 7 Algicidal effect of Strain G2 with different pH

2.4.4 溫度對溶藻效果的影響

不同溫度下除藻率均隨著培養(yǎng)時間的增加而增大 (圖8)。第8天，溫度5、25、75和120 ℃的溶藻能力均達最大，除藻率分別為 (59.42±0.88)%、(63.10±1.42)%、(29.45±0.91)% 和 (11.54±0.79)%。該菌株的無菌濾液對溫度有一定的敏感性，當溫度高于75 ℃，其溶藻效果衰退嚴重，120 ℃處理后，第8天的除藻率僅比第2天增長4.12%。

圖8 不同溫度下菌株G2的溶藻效果Fig. 8 Algicidal effect of Strain G2 at different temperatures

2.4.5 光照時間對溶藻效果的影響

不同光照下的除藻率隨培養(yǎng)時間的增加而增大(圖9)。在全黑暗條件下，培養(yǎng)初期 (第2—第4 天) 除藻率驟增，培養(yǎng)末期 (第 6—第 8 天) 除藻率增幅較小，在第8天達最大值 [(53.50±1.08)%]；在全光照和12 L∶12 D條件下的除藻率與全黑暗的變化趨勢相同，均在第8天達最大值，分別為(52.05±1.48)%和 (53.63±1.21)%，但三者的除藻率差異較小，說明該菌株對光照不敏感，光周期的改變對除藻率無明顯的影響，因此其具有更廣泛的適用性。

圖9 不同光照下菌株G2的溶藻效果Fig. 9 Algicidal effect of Strain G2 under different light conditions

3 討論

本研究從陜西省西安市某水庫底泥中分離出一株具有溶藻功能的菌株G2，經(jīng)16S rDNA鑒定，其與纖維弧菌屬的序列相似度達98%以上。通過實驗得出其最高除藻率可達60%以上。

溶藻細菌對藻細胞去除的作用方式大致有2種[28]：1) 溶藻菌直接作用于藻細胞，侵入藻細胞內(nèi)部對藻細胞進行分解。Li等[29]發(fā)現(xiàn)了一株可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的菌株 (LY03)，由于幾丁質(zhì)包裹著硅藻細胞，該菌株所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可以直接溶解硅藻的細胞壁，這也是首次發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶對硅藻的溶解效果；2) 細菌為了繁殖與藻類在同一環(huán)境下競爭營養(yǎng)物質(zhì)或分泌某種胞外物質(zhì)進行溶藻。約70%的溶藻菌為間接模式溶藻。蛋白質(zhì)、肽、氨基酸等是溶藻細菌產(chǎn)生的常見溶藻化合物[30-31]。石新國等[32]從海洋中分離出了一株交替單胞菌屬的溶藻菌FDHY-C3，該菌株通過產(chǎn)生胞外具有溶藻功能的分泌物進行溶藻。Wang和Coyne[33]從特拉華州內(nèi)陸灣分離出一株溶藻菌希瓦氏菌IRI-160，其通過分泌水溶性化合物來抑制鞭毛藻生長，且具有一定的專一性，對水體內(nèi)的其他藻類無影響。從2.2的實驗結(jié)果可知，G2的上清液顯示出較高的溶藻活性，表明G2通過間接攻擊表現(xiàn)出溶藻作用。細菌細胞在不與藻類細胞接觸的情況下也能產(chǎn)生溶藻物質(zhì)，溶藻物質(zhì)對藻類生長具有抑制作用。

G2隨著培養(yǎng)時間延長除藻效率提升，且處于對數(shù)增長期的菌液，其達到最佳除藻率相較于穩(wěn)定期和衰亡期的菌液相對滯后，這可能是由于其形態(tài)及生理活性對于外界的環(huán)境因素相對敏感，而處于穩(wěn)定期和衰亡期菌株的內(nèi)部溶藻活性物質(zhì)累積量高于其他生長階段[34]。該菌株穩(wěn)定期的除藻效率較高。Kong等[35]發(fā)現(xiàn)溶藻細菌HJC-D1隨投加比例從1%增至10%，除藻率增加了 (63.2±2.41)%，但投加比例為5%和10%的除藻率相差不大。本研究中溶藻細菌G2的溶藻效果也反映了該趨勢。當?shù)屯都颖壤航臃N至藻液中時，菌液對藻細胞只起到輕微抑制作用，而高比例投加菌液更有利于提升其溶藻效果。但若超過最大投加比例，溶藻能力將不再增加。當投加比例為10%和15%時，除藻率分別為 (54.32±0.40)% 和 (54.97±1.87)%。原因可能在于投加比例的增加使單位體積內(nèi)含有更多的溶藻物質(zhì)，藻類與溶藻物質(zhì)的接觸概率進一步增加，除藻率隨之提升[36]。

Zhang等[37]分離出一株具有高殺藻活性的菌株RPS，其上清液的溶藻活性對50 ℃及以上溫度敏感，對pH (3～11) 不敏感。Yu等[38]分離出菌株HG-16，其溶藻活性在pH 3～11 穩(wěn)定，表明該物質(zhì)具有耐酸堿性。溫度≤75 ℃處理2 h，除藻率無顯著變化，在121 ℃處理2 h后，除藻率降至52.3%。本研究G2與PRS、HG-16在一定的溫度和pH條件下溶藻特性一致。與5和25 ℃相比，G2在75和120 ℃下除藻率降低，但在pH 3～11 除藻率變化不大。推測也可能存在非蛋白的新溶藻物質(zhì)，該物質(zhì)對溫度敏感但對pH不敏感。Zhang等[39]在中國湖南省分離到一株金黃桿菌，其除藻率在pH 7時達到最大值 (70.3%)，在pH 9時降低至31.0%。楊冰潔等[40]分離出一株溶藻菌 CBA02，該菌株在較強酸性 (pH 2) 條件下除藻率低于5%；而在較強堿性條件下，除藻率可達90%以上。部分菌株在特定pH條件下具有較好的溶藻活性，而本研究G2具有較好的耐酸堿性，表明G2對不同類型的水體有較強的適應(yīng)性。今后，可考慮分析其具有溶藻效果的組成成分，通過化學合成的手段人工制造更多的溶藻有效物質(zhì)，以期為人工除藻劑提供多元化的手段。

4 結(jié)論

從陜西省西安市某水庫底泥中分離出具有溶藻功能的菌株G2，菌落呈現(xiàn)橘色，表面有凸起狀，邊緣規(guī)則。經(jīng)16S rDNA鑒定與纖維弧菌屬序列相似度為98%以上。

1) G2通過產(chǎn)生胞外溶藻活性物質(zhì)對藻類生長進行抑制，溶藻方式為間接溶藻。G2穩(wěn)定期的菌液對藻類去除效果最佳。

2) 溶藻效果隨投加比例的增加而提升，投加量大于10%時溶藻效果提升較慢；對75 ℃及以上的溫度敏感，溫度為25 ℃時除藻率最高 [(63.10±1.42)%]；對pH 3～11不敏感，pH 5時除藻率最高[(56.92±1.44)%]，且光照與G2溶藻效果的相關(guān)性較小。

3) G2對藻類暴發(fā)地適應(yīng)性較強，水體治理過程中不存在外來物種帶來的水體擾動及二次污染等問題。