黃星美，趙 旺，李長(zhǎng)林，鄧正華，張鈺偉，溫為庚，馬振華，于 剛

1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南 三亞 572018

3. 三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南 三亞 572018

4. 天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384

玉足海參 (Holothuria leucospilota) 屬棘皮動(dòng)物門、海參綱、楯手目、海參科、海參屬，自然分布于中國(guó)福建、廣東和海南等南方沿海地區(qū)的巖石、珊瑚和海藻叢附近[1-3]。玉足海參作為海洋沉積物的搬運(yùn)者和海底清道夫，在近岸海洋生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要角色，它們可以有效降低沉積物中的有機(jī)質(zhì)含量，還可以促進(jìn)海水的酸堿度平衡，對(duì)維護(hù)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義[4-5]。玉足海參是一種重要的經(jīng)濟(jì)海參種類，其生殖腺是拉羅湯加文化中一種重要的傳統(tǒng)食物[6-7]。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過對(duì)海參的各類成分進(jìn)行生物活性測(cè)定及其生物醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)海參含有多種具有抗腫瘤、抗真菌、提高免疫力等作用的活性物質(zhì)，如海參多糖、海參皂苷等[8-13]，多方面研究表明玉足海參具有重要的藥用和保健價(jià)值[14-17]；此外，作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的一員，玉足海參在多營(yíng)養(yǎng)層次生態(tài)養(yǎng)殖模式 (Integrated multi-trophic aquaculture, IMTA) 中應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)回收和顆粒廢物處理，具有重大的商業(yè)和研究?jī)r(jià)值，玉足海參與其他水生生物進(jìn)行多營(yíng)養(yǎng)層次綜合養(yǎng)殖，可以有效減少養(yǎng)殖水體中過量的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高養(yǎng)殖物種成活率、產(chǎn)量及餌料利用率[18-20]。

近年來，隨著市場(chǎng)需求不斷增加，海參的捕撈量急劇上升，過度捕撈給野生海參資源帶來了嚴(yán)重的威脅[21-25]。人工養(yǎng)殖海參被認(rèn)為是解決海參危機(jī)的有效策略[3,26]，通過將人工養(yǎng)殖的海參投放到野外，海參的自然種群可能得到恢復(fù)[4]。目前，已成功人工培育和繁殖了多種熱帶海參[24,27]，其中糙海參 (H. scabra) 的人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)已較完善和成熟[28-29]，而玉足海參的人工繁育研究尚處于起步階段[4]。近年來，在人工繁育過程中海參親體與幼體的養(yǎng)殖管理及生長(zhǎng)環(huán)境上已有較多的研究探索；環(huán)境因子是影響海參人工繁殖的重要因素之一，對(duì)海參幼體和成體的養(yǎng)殖與日常管理均存在顯著影響[30-31]。通過研究不同鹽度對(duì)玉足海參成體的攝食、耗氧量、排泄率等方面的影響[32]，表明成體的玉足海參對(duì)鹽度具有廣泛的耐受性，但是并不適合在低鹽度水中進(jìn)行養(yǎng)殖；海參幼體對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境同樣比較敏感，不同濃度梯度的鹽度試驗(yàn)，表明鹽度對(duì)海參幼體的生產(chǎn)、成活率和免疫力有顯著影響，鹽度過高會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響[31]。隨著玉足海參人工繁育技術(shù)不斷發(fā)展進(jìn)步，存在的問題和挑戰(zhàn)也日益凸顯，如成活率低下、發(fā)育狀態(tài)不佳、人工繁育過程中死亡率高等[4,21]，無法達(dá)到如貝類人工繁育般的高度人工可控，環(huán)境因子對(duì)玉足海參浮游幼體生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究尚存在空白，有關(guān)其繁育與養(yǎng)殖的研究報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)以玉足海參耳狀幼體為研究對(duì)象，觀察并記錄不同鹽度條件下玉足海參浮游幼體的生長(zhǎng)、發(fā)育等情況，探討了不同鹽度養(yǎng)殖水體對(duì)其生長(zhǎng)、發(fā)育和成活率的影響，旨在為提高玉足海參幼體繁育的成活率和熱帶海參野生資源的開發(fā)利用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用玉足海參親本采自海南省萬寧海區(qū)，體長(zhǎng) 25～35 cm，濕質(zhì)量 580～1 480 g。暫養(yǎng)于海南省陵水黎族自治縣熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，經(jīng)陰干刺激后釋放卵子，卵子受精后進(jìn)行洗卵并移至水體體積為5 m3的育苗池中進(jìn)行孵化，完成孵化后停止充氣，用虹吸法收集上層優(yōu)質(zhì)耳狀幼體。實(shí)驗(yàn)用耳狀幼體平均體長(zhǎng)為 (420.36±1.9) μm，平均胃寬為(90.44±0.96) μm。

實(shí)驗(yàn)用玉足海參幼體餌料球等鞭金藻 (Isochrysis galbana) 藻種取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所單胞藻培養(yǎng)室，并在熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心進(jìn)行擴(kuò)種培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)進(jìn)行，主要用具包括15個(gè)容量為50 L的塑料桶 (同一顏色)、顯微鏡、鹽度計(jì)、充氣泵、光度計(jì)、胚胎培養(yǎng)皿等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)在空調(diào)控溫室內(nèi)進(jìn)行，水溫保持在28～29 ℃；實(shí)驗(yàn)容器為體積為50 L的塑料桶，實(shí)驗(yàn)水體為40 L，實(shí)驗(yàn)用海水取自新村港，經(jīng)過濾后使用，降低鹽度用自來水勾兌，提高鹽度使用海鹽進(jìn)行調(diào)節(jié)，經(jīng)24 h充氧后，將海水鹽度分別設(shè)置為24、27、30、33、36，每個(gè)鹽度組設(shè)置3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)期間每天進(jìn)行鹽度調(diào)控，光照強(qiáng)度保持在 500 lx以下，每天投喂球等鞭金藻，投喂密度為每天20 000 個(gè)·mL?1；實(shí)驗(yàn)期間每 3～4 天換水 1 次，換水量為實(shí)驗(yàn)水體的50%；每隔24 h取樣，使用顯微鏡觀測(cè)海參幼體發(fā)育，每組重復(fù)取樣20個(gè)，測(cè)定玉足海參浮游幼體的體長(zhǎng) (L) 和胃寬 (SW，圖1)，并統(tǒng)計(jì)特定生長(zhǎng)率，同時(shí)，記錄每個(gè)鹽度條件下幼體的成活率。

圖1 玉足海參耳狀幼體的體長(zhǎng)和胃寬Fig. 1 Body length (L) and stomach width (SW) of larvae of H. leucospilota

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，使用Origin 2019軟件作圖。P<0.05表示差異顯著。生長(zhǎng)率 (Rg, d?1) 和成活率 (Rs, %) 的計(jì)算公式如下：

式中：Lt為大耳狀幼體時(shí)的體長(zhǎng) (μm)；L0為初始體長(zhǎng) (μm)；t為實(shí)驗(yàn)時(shí)間 (d)；Qf為最終存活個(gè)數(shù)；Qo為初始幼體個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同鹽度對(duì)玉足海參浮游幼體的體長(zhǎng)和胃寬的影響

玉足海參浮游幼體發(fā)育至大耳狀幼體階段時(shí)，其體長(zhǎng)和胃寬發(fā)育至最大值 (圖2)，與其他鹽度組相比，24鹽度組幼體體長(zhǎng)和胃寬的特定生長(zhǎng)率均為最低，與其他鹽度組具有顯著性差異 (P<0.05)。鹽度對(duì)玉足海參浮游幼體體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率會(huì)產(chǎn)生一定的影響 (圖2-a)，33和36鹽度組的體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率顯著高于其他鹽度組 (P<0.05)，24和27鹽度組間、33和36鹽度組間差異不顯著 (P>0.05)。同時(shí)，鹽度對(duì)玉足海參浮游幼體胃寬的特定生長(zhǎng)率也有顯著影響 (圖2-b)，30鹽度組幼體胃寬特定生長(zhǎng)率顯著高于24、33和36鹽度組 (P<0.05)；27和30鹽度組有利于玉足海參浮游幼體胃部的生長(zhǎng)和發(fā)育。

圖2 鹽度對(duì)玉足海參幼體體長(zhǎng) (a) 和胃寬 (b) 的影響Fig. 2 Effects of salinity on body length (a) and stomach width (b) of juvenile H. leucospilota

2.2 不同鹽度下玉足海參幼體體長(zhǎng)變化

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同鹽度下玉足海參幼體體長(zhǎng)的變化呈現(xiàn)不同規(guī)律。不同鹽度組幼體的體長(zhǎng)隨著養(yǎng)殖時(shí)間的增加而增長(zhǎng)。與其他鹽度組相比，36鹽度組的玉足海參幼體生長(zhǎng)速度最快，其于實(shí)驗(yàn)第4天體長(zhǎng)達(dá)到最長(zhǎng)，隨后其個(gè)體隨變態(tài)發(fā)育而縮?。?4鹽度組的玉足海參幼體發(fā)育最為緩慢，直至第6天其體長(zhǎng)達(dá)到最長(zhǎng)，第7天開始體長(zhǎng)隨變態(tài)發(fā)育而縮小；其他鹽度組從第5、第6天后開始變態(tài)。除24鹽度組外，其他鹽度組玉足海參幼體體長(zhǎng)變化幅度大，從大耳狀幼體發(fā)育至樽形幼體狀態(tài)的速度也較快 (圖3)。

圖3 不同鹽度下玉足海參幼體體長(zhǎng)變化Fig. 3 Change of body length of H. leucospilota larvae under different salinity

2.3 不同鹽度對(duì)玉足海參幼體成活率的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同鹽度組玉足海參幼體的成活率呈現(xiàn)不同規(guī)律。通過21 d的觀察，第6—第8天24、33和36鹽度組的玉足海參幼體成活率開始顯著下降，第8—第10天27和30鹽度組的玉足海參成活率才開始顯著下降；與其他鹽度組的結(jié)果相比，27和30鹽度組玉足海參幼體的成活率高于其他鹽度組，30鹽度組出現(xiàn)了最高成活率(11.69%)，27鹽度組的成活率最低 (圖4)。結(jié)合不同鹽度下玉足海參幼體體長(zhǎng)變化結(jié)果，本研究表明鹽度30對(duì)玉足海參幼體生長(zhǎng)、發(fā)育較為適宜。

圖4 不同鹽度對(duì)玉足海參幼體成活率的影響Fig. 4 Effects of different salinities on survival rate of H. leucospilota larvae

2.4 不同鹽度對(duì)玉足海參浮游幼體形態(tài)的影響

本實(shí)驗(yàn)表明，不同鹽度對(duì)玉足海參大耳狀幼體形態(tài)有一定影響 (圖5)。在玉足海參幼體發(fā)育至大耳狀幼體時(shí)，相比較其他鹽度條件，鹽度為27～30時(shí)，玉足海參幼體球狀體 (圖中箭頭處) 發(fā)育更加強(qiáng)壯和突出，個(gè)數(shù)更多，其整體形態(tài)與輪廓更加清晰 (圖5-b、5-c)；與其他鹽度組相比，鹽度為24和36時(shí)，玉足海參浮游幼體的胃明顯沒有其他鹽度圓潤(rùn)與充盈；幼體大小也明顯小于其他鹽度(圖5-a、5-e)。

圖5 不同鹽度下玉足海參浮游幼體形態(tài)變化Fig. 5 Change of morphology of planktonic larva of H. leucospilota under different salinity

3 討論

3.1 鹽度對(duì)玉足海參幼體生長(zhǎng)的影響

鹽度是影響海洋動(dòng)物生理生態(tài)的重要環(huán)境因子之一，海參是棘皮動(dòng)物，缺少滲透壓調(diào)節(jié)器官，難以調(diào)節(jié)體腔液的鹽度[33-34]。棘皮動(dòng)物的體腔液通常與外界環(huán)境保持一致，外界環(huán)境鹽度的波動(dòng)會(huì)對(duì)海參的存活、生長(zhǎng)、繁殖及行為等造成一定的影響[34-35]；不適宜的鹽度會(huì)降低其對(duì)不良環(huán)境的抵抗能力和對(duì)食物的吸收和代謝，嚴(yán)重時(shí)將影響其生長(zhǎng)并降低其成活率[34-36]。本研究表明，適宜鹽度 (鹽度為27～30) 下，玉足海參幼體的體長(zhǎng)和臟器能夠得到更好的生長(zhǎng)和發(fā)育，與其他組的特定生長(zhǎng)率有顯著差異 (P<0.05)。玉足海參對(duì)鹽度變化有較強(qiáng)的耐受性，但并不適合在低鹽度條件下進(jìn)行養(yǎng)殖，18鹽度組的玉足海參攝食速率顯著低于其他鹽度組；且鹽度變化對(duì)玉足海參氨的排泄率也有顯著影響[32]。本研究中玉足海參幼體對(duì)鹽度的感知程度比成體更加敏感，因此進(jìn)行玉足海參人工繁育時(shí)，應(yīng)對(duì)其養(yǎng)殖水體的鹽度變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。鹽度變化導(dǎo)致仿刺參 (Apostichopus japonicus) 體腔液滲透壓的改變，進(jìn)而影響仿刺參體內(nèi)免疫酶的活性[37]；鹽度對(duì)仿刺參的生長(zhǎng)有極顯著影響，當(dāng)鹽度介于22～30，隨著鹽度增加，其特定生長(zhǎng)率逐漸升高，但當(dāng)鹽度繼續(xù)增加后，其特定生長(zhǎng)率開始下降[38]。Sari等[39]實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)鹽度高于34時(shí)對(duì)糙海參幼體的生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響。與上述幾種海參幼體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較，本研究結(jié)果與仿刺參的一致，糙海參幼體在高鹽度下開始產(chǎn)生不良影響，表明在進(jìn)行不同海參品種人工繁育過程中，需要進(jìn)行相應(yīng)的鹽度調(diào)節(jié)。為不斷優(yōu)化玉足海參人工繁育機(jī)制，需進(jìn)一步研究環(huán)境因子對(duì)其生理變化的影響，以為玉足海參人工繁育技術(shù)提供理論依據(jù)。

3.2 鹽度對(duì)玉足海參幼體成活率的影響

鹽度是影響海參生長(zhǎng)、發(fā)育和存活的重要環(huán)境因素之一[33,40]。海參具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，這不僅刺激了中國(guó)海參養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，同時(shí)也表明海參人工繁育技術(shù)的建立與完善是目前海參養(yǎng)殖業(yè)的首要任務(wù)。本研究通過對(duì)比不同鹽度下玉足海參浮游幼體的成活率，結(jié)合不同鹽度下其體長(zhǎng)的變化，結(jié)果表明鹽度為27～30的玉足海參幼體成活率高于其他鹽度，樽形幼體在玉足海參整個(gè)發(fā)育過程中比較重要，是影響其成活率的重要因素之一。通過不同鹽度梯度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，24～34鹽度下糙海參幼體成活率高于其他組，鹽度達(dá)到44時(shí)，幼體成活率顯著下降[39]；而刺參幼體在鹽度30下的成活率最高[41]，鹽度過低或過高 (<20或≥40) 最終成活率為0；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與刺參幼體鹽度實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，過高或過低的鹽度均會(huì)影響海參幼體的成活率，而糙海參幼體能夠耐受更廣的鹽度，且糙海參和刺參的幼體成活率均高于玉足海參。因此，提高玉足海參幼體的成活率仍是人工繁育技術(shù)中的重點(diǎn)與難點(diǎn)，有待于進(jìn)一步探究。

3.3 鹽度對(duì)玉足海參幼體發(fā)育的影響

球狀體結(jié)構(gòu)在海參浮游幼體階段至關(guān)重要[4,42-44]，其不僅參與幼體的運(yùn)動(dòng)，同時(shí)還為海參幼體的變態(tài)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。球狀體發(fā)育狀態(tài)影響海參幼體變態(tài)的成活率[43-45]，研究表明，海參的變態(tài)發(fā)育可能高度依賴于幼蟲在發(fā)育過程中脂質(zhì)能量的積累，球狀體結(jié)構(gòu)用于脂質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)存，為海參幼體的變態(tài)發(fā)育提供能量及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[42]。球狀體在糙海參幼體培育階段，通過改善養(yǎng)殖模式和養(yǎng)殖環(huán)境能夠有效地提高大耳幼體狀態(tài)下球狀體的出現(xiàn)率，并提高其變態(tài)成活率。本研究中，通過比較不同鹽度下大耳狀幼體的發(fā)育狀態(tài)，鹽度介于27～30時(shí)，玉足海參浮游幼體的球狀體發(fā)育更加突出，輪廓更加清晰；玉足海參幼體的成活率除受到環(huán)境因子影響之外，一定程度上可能與球狀體的發(fā)育狀態(tài)有關(guān)[43]。球狀體在玉足海參幼體變態(tài)發(fā)育中是否起決定性作用，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

為提高玉足海參浮游幼體的變態(tài)成活率，建議在鹽度為27～30條件下進(jìn)行玉足海參浮游幼體的培育，以鹽度不低于27為宜；適宜的養(yǎng)殖條件有利于玉足海參浮游幼體的生長(zhǎng)和發(fā)育；在雨季或鹽度變化的河口與沿海區(qū)域，建議進(jìn)行養(yǎng)殖水體鹽度的實(shí)時(shí)或間隔監(jiān)測(cè)。