秦 璐，宋秀凱，劉麗娟，馬元慶，姜向陽(yáng)，王 寧，汝少?lài)?guó)，王 軍*

1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003

2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264006

高效氟吡甲禾靈(haloxyfop-P-methyl, HPME)是一種芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑，能夠很好地防除大多數(shù)一年生和多年生的禾本科雜草，在我國(guó)每年使用作物面積近7 萬(wàn)畝次，合計(jì)3×104t 以上[1]. 近年來(lái)，隨著此類(lèi)除草劑長(zhǎng)期單一的不合理使用，致使其在環(huán)境中被廣泛檢出[2-3]. 如我國(guó)湖南某煙草基地附近水體中芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑精喹禾靈的濃度約為16 μg/L[4]，松花江水體中HPME 的濃度為3.7～9.8 μg/L[5].據(jù)報(bào)道顯示，當(dāng)土壤中HPME 的施用量為360～540 g/hm2時(shí)，其殘留量約為0.02～0.159 mg/kg[6]；Oliveira等[7]推算出施用濃度為122.35 g/L 的HPME 會(huì)導(dǎo)致地表徑流中HPME 濃度高達(dá)183 mg/L. 除了用于防治農(nóng)田雜草外，HPME 還能夠有效殺死我國(guó)近海入侵植物互花米草，抑制其有性繁殖和無(wú)性繁殖，被認(rèn)為是防控互花米草的有效化學(xué)方法[8]. 互花米草在我國(guó)沿海灘涂的快速擴(kuò)散破壞了鳥(niǎo)類(lèi)覓食與棲息環(huán)境、改變了底棲動(dòng)物群落組成，已成為濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)健康的重大威脅[9]. 目前，多個(gè)沿海地區(qū)已經(jīng)啟動(dòng)了互花米草的防治工作，這對(duì)恢復(fù)生態(tài)環(huán)境與生物多樣性具有重大意義[10]. 化學(xué)方法是防治互花米草的經(jīng)濟(jì)、有效方法，但是施藥過(guò)程會(huì)導(dǎo)致未被互花米草吸收的除草劑進(jìn)入海洋環(huán)境，可能會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)健康造成潛在危害.

目前，關(guān)于HPME 對(duì)淡水生物的毒性數(shù)據(jù)很少，對(duì)海洋生物的毒性效應(yīng)研究鮮見(jiàn)報(bào)道. HPME 對(duì)四尾柵藻(Scenedesmus quadricauda)的96 h 半數(shù)效應(yīng)濃度(median effect concentration, EC50)為62.8 mg/L[11]，對(duì)藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)(Lepomis macrochirus)的96 h-LC50為0.3 mg/L[12]. HPME 還會(huì)對(duì)水生生物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生毒性效應(yīng). 例如，0.723 mg/L HPME 暴露會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育不良，并且3.617 mg/L HPME 暴露24 h會(huì)造成斑馬魚(yú)胚胎死亡[13]. 此外，1 mg/L HPME 暴露斑馬魚(yú)仔魚(yú)72 h 會(huì)引發(fā)脊柱變形、運(yùn)動(dòng)減慢、心率和存活率明顯下降等現(xiàn)象[14-15]. 可見(jiàn)，在互花米草治理過(guò)程中盲目地使用HPME 很可能造成較大的生態(tài)危害. 因此，亟需確定HPME 的生態(tài)安全閾值，并制訂其水質(zhì)基準(zhǔn).

水質(zhì)基準(zhǔn)是指污染物對(duì)人或其他生物不產(chǎn)生有害影響的最大可接受劑量[16-18]. 國(guó)際上水質(zhì)基準(zhǔn)的推導(dǎo)多采用物種敏感性分布(species sensitivity distribution, SSD)和物種敏感性排序法(species sensitivity rank, SSR). 水質(zhì)基準(zhǔn)的推導(dǎo)依賴(lài)于化合物的毒性數(shù)據(jù)庫(kù)[19]. 例如，US EPA 制定的“推導(dǎo)保護(hù)水生生物及其用途的水質(zhì)基準(zhǔn)的技術(shù)指南”中指出，至少需要3 門(mén)8 科毒性數(shù)據(jù)要求[16]. 鑒于目前缺乏HPME 對(duì)海洋生物的毒性數(shù)據(jù)，該研究首先選取了8門(mén)13 科本地海洋生物開(kāi)展HPME 急性毒性試驗(yàn). 同時(shí)，通過(guò)搜集現(xiàn)有毒性數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)，構(gòu)建了HPME 對(duì)水生生物的毒性數(shù)據(jù)庫(kù). 隨后，利用SSD 法和SSR 法分別推導(dǎo)HPME 的水質(zhì)基準(zhǔn)，以期為HPME在互花米草治理中的安全施用與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 毒性數(shù)據(jù)的搜集與篩選

該文所采用的HPME 毒性數(shù)據(jù)來(lái)自于國(guó)內(nèi)外已有的毒性數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)資料，主要來(lái)源包括US EPA的ECOTOX 毒性數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cfpub.epa.gov/ecotox)、NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、中國(guó)知網(wǎng)(http://www.cnki.net). 急性毒性數(shù)據(jù)主要選取24～96 h 的LC50和EC50[20]，在篩選數(shù)據(jù)過(guò)程中，如果一個(gè)物種有多個(gè)符合要求的數(shù)據(jù)，取其幾何均值來(lái)代表該物種的生物毒性數(shù)據(jù)[21].

1.2 急性毒性試驗(yàn)

該文使用的HPME (CAS 號(hào)95977-29-0)乳油，購(gòu)自江蘇中旗科技股份有限公司，有效成分含量為108 g/L. 用滅菌海水配置有效濃度為4.5 mg/L 的母液，避光保存于4 °C，每天配置新的母液.

該文選取8 門(mén)13 科13 種具有代表性的本地海洋生物進(jìn)行研究，涵蓋初級(jí)生產(chǎn)者、初級(jí)消費(fèi)者、次級(jí)消費(fèi)者3 個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí). 急性毒性試驗(yàn)方法參照我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 27861—2011《化學(xué)品 魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)》、GB/T 21805—2008《化學(xué)品 藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)》、GB/T 13266—1991《水質(zhì)物質(zhì)對(duì)蚤類(lèi)(大型蚤)急性毒性測(cè)定方法》)等標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法進(jìn)行. 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定暴露濃度梯度范圍，每種生物設(shè)置不同HPME 濃度梯度暴露組(見(jiàn)表1)和滅菌海水空白對(duì)照組. 所有試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)期間均不喂食，采用半靜態(tài)暴露，每隔24 h 更換一次暴露液，每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行組包含至少10 個(gè)生物體. 試驗(yàn)期間每天測(cè)定溫度、鹽度和pH 等，以保證試驗(yàn)環(huán)境穩(wěn)定.藻類(lèi)急性毒性試驗(yàn)以藻細(xì)胞數(shù)量為終點(diǎn)指標(biāo)，動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)以個(gè)體存活數(shù)為終點(diǎn)指標(biāo). 每24 h 進(jìn)行1～3 次觀察記錄，及時(shí)撈出死亡個(gè)體，以防污染水質(zhì).所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8 繪制藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制率曲線以及劑量效應(yīng)曲線，采用SPSS 16 和Probit 方法計(jì)算LC50、EC50及相應(yīng)的95%置信區(qū)間.

表 1 高效氟吡甲禾靈對(duì)13 種本地海洋生物的急性毒性試驗(yàn)Table 1 The exposure concentration gradients of haloxyfop-P-methyl to 13 native marine organisms

1.3 水質(zhì)基準(zhǔn)推導(dǎo)

1.3.1 SSD 法

將毒性數(shù)據(jù)分為兩組：該研究開(kāi)展的13 種海水生物毒性數(shù)據(jù)與7 種淡水+13 種海水生物毒性數(shù)據(jù).采用Log-logistic、Gamma、Log-normal、Log-gumbel、Weibull 等5 種模型分別對(duì)兩組毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，構(gòu)建HPME 的SSD 曲線，并采用赤池信息量準(zhǔn)則(Akaike′s information criterion, AIC 準(zhǔn)則)、樣本修正的赤池信息準(zhǔn)則(Akaike′s information criterion corrected for sample size, AICC)、貝葉斯信息準(zhǔn)則(Bayesian information criterion, BIC)、 Kolmogorov Smirnov 檢 驗(yàn)(KS 檢 驗(yàn))和Anderson-Darling 檢 驗(yàn)(AD 檢驗(yàn))方法評(píng)估吻合度擬合效果[22-23]. SSD 模型構(gòu)建及吻合度檢驗(yàn)使用統(tǒng)計(jì)軟件R 3.5.2 中的ssdtools 包完成. 最優(yōu)SSD 曲線使用Matlab (2012 b)進(jìn)行擬合.

1.3.2 SSR 法

將兩組數(shù)據(jù)根據(jù)物種屬名分類(lèi)，分別有13 屬和19 屬，計(jì)算同一屬內(nèi)所有物種急性毒性數(shù)據(jù)的平均值，即屬平均急性值(genus mean acute value, GMAV)，將GMAV 從小到大進(jìn)行排序并分配等級(jí)n，兩組數(shù)據(jù)GMAV 最小的4 個(gè)屬及等級(jí)均為偽鏢水蚤屬(安氏偽鏢水蚤)，1 等級(jí)；猛水蚤屬(日本虎斑猛水蚤)，2等級(jí)；臂尾輪蟲(chóng)屬(褶皺臂尾輪蟲(chóng))，3 等級(jí)；等鞭金藻屬(球等鞭金藻)，4 等級(jí). 按P=n/(N+1)(N為屬的個(gè)數(shù))計(jì)算累積概率；按式(1)～(4)[16]計(jì)算最終急性值(final acute value, FAV)，其中FAV 對(duì)應(yīng)SSD 法的HC5[24].

式中：S、L、A均為FAV 計(jì)算的過(guò)程量；P為選擇4個(gè)屬毒性數(shù)據(jù)的排序百分?jǐn)?shù)(也稱(chēng)累積概率). 數(shù)據(jù)的分類(lèi)匯總及SSR 法計(jì)算在Excel 軟件中完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 毒性數(shù)據(jù)收集和篩選

該文共收集到HPME 對(duì)7 種淡水生物的急性毒性數(shù)據(jù)，所涉及生物分屬于3 門(mén)5 科，包括2 種魚(yú)類(lèi)、4 種藻類(lèi)和1 種甲殼動(dòng)物(見(jiàn)表2). HPME 的急性毒性數(shù)據(jù)范圍為0.3 mg/L (藍(lán)鰓太陽(yáng)魚(yú)，96 h-LC50)到62.8 mg/L(四尾柵藻，96 h-EC50)，二者相差約210 倍.有研究表明，與HPME 同為芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑的惡唑酰草胺(10%乳液)對(duì)斜生柵藻的72 h-EC50為1.698 mg/L，對(duì)斑馬魚(yú)的96 h-LC50為0.432 mg/L，對(duì)藻類(lèi)的毒性低于對(duì)魚(yú)類(lèi)的毒性[28]，這與該文搜集數(shù)據(jù)的結(jié)果相一致. 因此，芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑對(duì)魚(yú)類(lèi)的急性毒性要明顯高于藻類(lèi)，提示這類(lèi)除草劑會(huì)對(duì)高等水生動(dòng)物產(chǎn)生更大的毒性效應(yīng).

表 2 高效氟吡甲禾靈對(duì)7 種淡水生物的急性毒性數(shù)據(jù)Table 2 Acute toxicity data of haloxyfop-P-methyl to 7 freshwater organisms

2.2 急性毒性試驗(yàn)

以暴露濃度為橫坐標(biāo)，以基于生長(zhǎng)量的生長(zhǎng)抑制率或存活率為縱坐標(biāo)繪制劑量-效應(yīng)折線圖(見(jiàn)圖1).HPME 的急性毒性數(shù)據(jù)范圍為0.107～47.111 mg/L(見(jiàn)表3)，并且藻類(lèi)的生長(zhǎng)抑制率和其他生物的死亡率均與HPME 的濃度呈正相關(guān). 不同生物對(duì)HPME 的敏感性表現(xiàn)為安氏偽鏢水蚤＞虎斑猛水蚤＞褶皺臂尾輪蟲(chóng)＞球等鞭金藻＞許氏平鲉＞中肋骨條藻＞黑褐新糠蝦＞四角蛤蜊＞刺參＞紫貽貝＞蛋白核小球藻＞琵琶擬沼螺＞牡蠣. 對(duì)HPME 最敏感的物種安氏偽鏢水蚤的96 h-LC50值(0.107 mg/L)與最不敏感物種牡蠣的96 h-LC50值(47.111 mg/L)在數(shù)值上相差400 多倍，這與該研究數(shù)據(jù)庫(kù)搜集的結(jié)果相一致. 有研究[28]顯示，惡唑酰草胺乳油對(duì)大型溞和斑馬魚(yú)的48 h-LC50和96 h-LC50分別為0.112 和0.432 mg/L，屬高毒；對(duì)斜生柵藻的72 h-EC50為1.698 mg/L，屬中毒. 氰氟草酯對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)和胚胎的96 h-LC50分別為4.05 和0.57 mg/L，精喹禾靈對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的96 h-LC50為0.23 mg/L，為高毒[29]. 此外，氰氟草酯對(duì)隆線溞的毒性也高于蛋白核小球藻，對(duì)隆線溞的48 h-LC50為51.91 mg/L，而200 mg/L 氰氟草酯僅抑制58%蛋白核小球藻生長(zhǎng)[30-31]. 在該研究中，HPME 對(duì)中肋骨條藻和球等鞭金藻的96 h-LC50在0.233～0.604 mg/L 之間，而對(duì)蛋白核小球藻的96 h-LC50則高達(dá)2.396 mg/L，與紫貽貝的數(shù)值相近. 可見(jiàn)，不同生物對(duì)芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑的敏感性存在較大差異. 為準(zhǔn)確評(píng)估這類(lèi)污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，非常有必要補(bǔ)充更多物種的毒性數(shù)據(jù).

表 3 高效氟吡甲禾靈對(duì)13 種本地海洋生物的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Acute toxicity results of haloxyfop-P-methyl to 13 native marine organisms

2.3 水質(zhì)基準(zhǔn)推導(dǎo)結(jié)果

2.3.1 SSD 法

SSD 法是一種基于統(tǒng)計(jì)的方法，將不同生物對(duì)污染物的敏感性分布通過(guò)一定的函數(shù)進(jìn)行擬合，構(gòu)建物種的敏感性分布曲線，求得能保護(hù)一定百分比生物的環(huán)境濃度值，通過(guò)有限物種的可接受水平代表整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)，據(jù)此可推算出基準(zhǔn)閾值[32-33]. 目前，一般以保護(hù)95%生物的污染物濃度，即HC5 作為安全閾值[34]，HC5 除以一個(gè)評(píng)估因子(assessment factor, AF，取值范圍為1～5)即可得到水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)[35]. 該評(píng)估因子的選擇需要考慮數(shù)據(jù)質(zhì)量、毒性終點(diǎn)的選擇、數(shù)據(jù)所包含物種的多樣性和代表性、化學(xué)物質(zhì)的作用模式、統(tǒng)計(jì)過(guò)程的不確定性等. 然而，目前還沒(méi)有有效方法來(lái)定量這些不確定性，大部分研究中AF 取值為2[36]. 如張瑞卿等[37]推導(dǎo)無(wú)機(jī)汞的水質(zhì)基準(zhǔn)、Li等[38]推導(dǎo)鉛的水質(zhì)基準(zhǔn)以及Lei 等[39]推導(dǎo)4 壬基酚的水質(zhì)基準(zhǔn)時(shí)，均取2 作為AF 值. 因此，該文也選取2 作為AF 計(jì)算基準(zhǔn)閾值. 采用5 種分布模型擬合了SSD 曲線，發(fā)現(xiàn)5 種模型均能成功地?cái)M合兩組毒性數(shù)據(jù)(見(jiàn)圖2).

圖 1 不同濃度高效氟吡甲禾靈暴露對(duì)13 種本地海洋生物存活率的影響Fig.1 Effects of haloxyfop-P-methyl exposure on survival rates of 13 native marine organisms

圖 2 采用5 種模型構(gòu)建高效氟吡甲禾靈對(duì)水生生物毒性的物種敏感性分布(SSD)曲線Fig.2 Species sensitivity distribution (SSD) curves of haloxyfop-P-methyl toxicity to aquatic organisms calculated by 5 models

通過(guò)不同方法進(jìn)一步對(duì)毒性數(shù)據(jù)的擬合效果進(jìn)行檢驗(yàn)(見(jiàn)表4)，結(jié)果顯示，KS 和AD 檢驗(yàn)均大于0.05，AIC 和BIC 檢驗(yàn)結(jié)果比較接近. Guthery 等[22,40-42]推薦采用AICC 確定擬合效果最好的模型，即參數(shù)delta 為0. 該研究發(fā)現(xiàn)log-gumbel 檢驗(yàn)下delta 值為0，所以log-gumbel 模型更適合擬合該研究毒性數(shù)據(jù).

表 4 高效氟吡甲禾靈的水生生物急性毒性數(shù)據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of acute toxicity data of haloxyfop-P-methyl to aquatic organisms

該研究以log-gumbel 模型擬合了HPME 對(duì)水生生物的SSD 曲線(見(jiàn)圖3). 根據(jù)所得SSD 曲線可知，甲殼綱動(dòng)物對(duì)HPME 較為敏感，相比之下藻類(lèi)和軟體動(dòng)物類(lèi)群敏感度較低. 已有研究表明，與HPME 同為手性除草劑的苯醚甲環(huán)唑?qū)讱ぞV的生物毒性大于藻類(lèi)[43]，這與該研究的結(jié)論一致.

圖 3 采用log-gumbel 模型構(gòu)建高效氟吡甲禾靈對(duì)水生生物毒性的物種敏感度分布(SSD)曲線Fig.3 Species sensitivity distribution (SSD) curves of haloxyfop-P-methyl toxicity to aquatic organisms calculated by log-gumbel models

根據(jù)擬合曲線，基于兩組毒性數(shù)據(jù)可得HPME的HC5 分別為74.1 和89.5 μg/L. 除以AF 因子得到HPME 的海水水質(zhì)基準(zhǔn)為37.05 μg/L，而基于7 種淡水+13 種海水生物毒性數(shù)據(jù)的水質(zhì)基準(zhǔn)為44.75 μg/L. 歐盟規(guī)定在推導(dǎo)海水水質(zhì)基準(zhǔn)時(shí)不嚴(yán)格排斥淡水生物的毒性數(shù)據(jù)，因此多將海水和淡水生物的毒性數(shù)據(jù)一并使用[44]. 我國(guó)海岸線較長(zhǎng)，污染物出現(xiàn)短期高濃度暴露的情況多發(fā)生于河口、港區(qū)、沿岸工業(yè)/市政排污口等區(qū)域，這些區(qū)域棲息著廣鹽性的水生生物. 因此，推導(dǎo)我國(guó)海水水質(zhì)基準(zhǔn)的毒性數(shù)據(jù)應(yīng)包括海水和淡水生物的毒性數(shù)據(jù)[45]. 該文基于海水?dāng)?shù)據(jù)推導(dǎo)出HPME 的海水水質(zhì)基準(zhǔn)與基于海水及淡水?dāng)?shù)據(jù)所推導(dǎo)的HPME 水質(zhì)基準(zhǔn)相差不大. 因此，在推導(dǎo)芳氧苯氧丙酸酯類(lèi)除草劑的海水水質(zhì)基準(zhǔn)時(shí)，可以采用淡水生物毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充.

2.3.2 SSR 法

對(duì)毒性數(shù)據(jù)的敏感度排序結(jié)果顯示，13 種海水生物的FAV 值為78.85 μg/L，除以AF 得出HPME 的水質(zhì)基準(zhǔn)為39.43 μg/L (見(jiàn)表5). 7 種淡水+13 種海水生物的FAV 值為83.30 μg/L，水質(zhì)基準(zhǔn)為41.65 μg/L，這與SSD 法推導(dǎo)的基準(zhǔn)值相差較小. SSR 法最終用于計(jì)算基準(zhǔn)值的只是4 個(gè)屬的毒性數(shù)據(jù)，最終的基準(zhǔn)值很大程度上依賴(lài)于敏感物種的數(shù)據(jù)，而SSD 法則更多依賴(lài)整體毒性數(shù)據(jù)[46]，可見(jiàn)該研究選取的物種對(duì)HPME 整體較為敏感.

表 5 物種敏感性排序法(SSR)推導(dǎo)高效氟吡甲禾靈對(duì)水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)的參數(shù)運(yùn)算Table 5 Parameter calculation for deriving quality criteria for haloxyfop-P-methyl to aquatic organisms by species sensitivity rank (SSR) method

3 結(jié)論

a) HPME 對(duì)13 種本地生物的LC50/EC50在0.103～47.111 mg/L 之間，安氏偽鏢水蚤為最敏感物種，牡蠣為最不敏感物種.

b) 基于該研究獲得的13 種海洋生物的毒性數(shù)據(jù)，利用SSD 法推導(dǎo)出HPME 的海水水質(zhì)基準(zhǔn)為37.05 μg/L，略低于基于所有毒性數(shù)據(jù)推導(dǎo)的水質(zhì)基準(zhǔn)(44.75 μg/L).

c) SSR 法推導(dǎo)出HPME 的海水水質(zhì)基準(zhǔn)為39.43 μg/L，而基于所有毒性數(shù)據(jù)推導(dǎo)的水質(zhì)基準(zhǔn)為41.65 μg/L.

d) 該文構(gòu)建了HPME 的水生生物毒性數(shù)據(jù)庫(kù)，推導(dǎo)出了HPME 的海水水質(zhì)基準(zhǔn)，為HPME 在我國(guó)海域開(kāi)展互花米草的化學(xué)防治提供了可參考的生態(tài)安全閾值.