劉元芬，葉星辰，王糾

（1.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東 廣州 510006；3.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006；4.廣東省藥物緩控釋制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006；5.廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

阿伐那非（avanafil）是一種口服速效的高選擇性磷酸二酯酶5（PDE5）抑制劑，能抑制環(huán)磷酸鳥苷在體內(nèi)的代謝，從而使平滑肌的舒張作用得以加強，陰莖的血流量增加，進而幫助勃起，用于治療男性勃起功能障礙（ED）[1-3]。阿伐那非具有與其他PDE5 抑制劑相同的作用機制，但口服吸收更快，大多數(shù)ED患者在使用本品后0.5 h內(nèi)即能成功進行性生活，等效或優(yōu)于目前市場上的其他PDE5 抑制劑[4]，如西地那非（商品名：偉哥）、伐地那非（商品名：艾力達）、他達拉非（商品名：西力士）等。美國FDA 于2012 年4月批準阿伐那非上市，并于2013年由Vivus 授權(quán)Auxilium 在美國進行銷售，商品名為Stendra[5]。

阿伐那非原研藥（C23H26ClN7O3）結(jié)構(gòu)為(S)-4-[(3-氯-4-甲氧基芐基)氨基]-2-[2-(羥甲基)-1-吡咯烷基]-N-(2-嘧啶基甲基)-5-嘧啶甲磺酰胺。阿伐那非在合成過程中引入L-脯胺醇手性分子，得到中間體4-[（3-氯-4-甲氧基苯基）甲氨基]-2-[（S）-2-羥甲基吡咯-1-基]嘧啶-5-羧酸乙酯（中間體3，圖1），因此在結(jié)構(gòu)中具有一個手性分子中心，構(gòu)型為S型，其結(jié)構(gòu)和R型對映異構(gòu)體結(jié)構(gòu)見圖2[6-8]。

圖1 阿伐那非手性結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生Figure 1 Formation of avanafil isomers

圖2 阿伐那非（A）與阿伐那非對映異構(gòu)體（B）的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Figure 2 The chemical structure of S-avanafil(A)and R-avanafil(B)

阿伐那非對映異構(gòu)體雖然與阿伐那非分子式相同，但S型是活性成分，R型對映異構(gòu)體卻是合成中的雜質(zhì)。目前，關(guān)于阿伐那非的含量測定方法已有文獻報道[9-13]，但未見有采用HPLC 法測定阿伐那非對映異構(gòu)體的報道，因此，本文擬建立HPLC法對阿伐那非對映異構(gòu)體進行測定，為阿伐那非仿制藥的質(zhì)量標準研究和上市研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent g1314A VWD 檢測器（美國安捷倫公司）；CHIRALCEL OD-H 色譜柱（日本DAICEL 大賽璐公司，Lot:No.ODH0CE-PH042,5 μm,4.6 mm×250 mm）；ME104 電子分析天平（瑞士梅特勒，十萬分之一）。

1.2 材料

乙醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；L-脯胺醇（分析純，泰州精英化成醫(yī)藥科技有限公司）；水為娃哈哈純凈水；阿伐那非對照品（批號：20180802，供含量測定用）、阿伐那非對映異構(gòu)體對照品（批號：20181029，供含量測定用）和阿伐那非樣品（批號20180804、20180806、20180808、20180810、20180813、20180815）均為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent 1100 高效液相色譜儀；Agilent g1314A VWD 檢 測 器；Agilent Chemstation 色 譜 工 作 站；CHIRALCEL OD-H 色譜柱；流動相：正己烷-乙醇（體積比82∶18）；檢測波長：233 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

阿伐那非供試品溶液：取制備的阿伐那非原料藥適量，精密稱定，加無水乙醇溶解并稀釋制成每1 mL約含阿伐那非400 μg的溶液。

阿伐那非對映異構(gòu)體對照品儲備液A：取阿伐那非對映異構(gòu)體對照品適量，精密稱定，加無水乙醇溶解并稀釋制成每1 mL 約含阿伐那非対映異構(gòu)體400 μg的溶液。

阿伐那非對映異構(gòu)體對照品溶液：取阿伐那非對映異構(gòu)體對照品儲備液A 0.5 mL，置100 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋制成每1 mL約含阿伐那非對映異構(gòu)體2 μg的溶液。

系統(tǒng)適用性溶液：精密稱取阿伐那非和阿伐那非對映異構(gòu)體適量，置同一容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋制成每1 mL約含阿伐那非400 μg、阿伐那非對映異構(gòu)體2 μg的混合溶液。

阿伐那非對映異構(gòu)體專屬性試驗溶液：取阿伐那非對映異構(gòu)體對照品儲備液A 1.0 mL，置100 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至含阿伐那非對映異構(gòu)體4 μg/mL。

2.3 專屬性試驗

精密吸取空白溶液、阿伐那非對映異構(gòu)體專屬性試驗溶液和系統(tǒng)適用性溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖3?？梢?，阿伐那非對映異構(gòu)體和阿伐那非的保留時間分別為24.32 min和21.14 min，兩者達到有效分離，分離度為2.4，理論塔板數(shù)為4745，表明方法專屬性好。

圖3 阿伐那非異構(gòu)體專屬性試驗圖譜Figure 3 Chromatogram of specificity test

2.4 耐用性試驗

分別考察流動相比例、流速、波長和柱溫等因素以調(diào)整色譜條件，精密量取阿伐那非供試品溶液和系統(tǒng)適用性溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察異構(gòu)體分離情況，結(jié)果見表1?？梢姡瑢υV條件中的波長、柱溫、流速及流動相比例在一定范圍內(nèi)進行調(diào)整，系統(tǒng)適用性溶液中對映異構(gòu)體與阿伐那非主成分色譜峰間的分離無明顯差異，分離度大于1.5，溶液中對映異構(gòu)體檢測質(zhì)量分數(shù)約為0.42%；阿伐那非供試品溶液中均未檢出對映異構(gòu)體，雜質(zhì)檢出無明顯差異。

表1 耐用性試驗結(jié)果Table 1 Results of durability test

2.5 定量限和檢測限的測定

阿伐那非對映異構(gòu)體的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）按“2.1”項下色譜條件，根據(jù)信噪比法確定。用無水乙醇逐級稀釋成不同濃度進行測定，當峰面積為9.67，其信噪比為10 左右，這時計算的濃度即為最低定量限濃度，當信噪比為3 左右時即為最低檢測限濃度。結(jié)果測得阿伐那非對映異構(gòu)體的定量限為0.10 μg/mL，檢測限為0.033 μg/mL。

2.6 線性關(guān)系考察

精密稱取阿伐那非及其對映異構(gòu)體各約10 mg，分別置2個20 mL量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密移取1.0 mL，置同一50 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液儲備液。分別精密移取0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0、4.0、6.0 mL 置9 個10 mL 量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性關(guān)系考察溶液。

按“2.1”項下色譜條件，精密量取各線性溶液20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為橫坐標、以峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程并繪制標準曲線。結(jié)果顯示，阿伐那非質(zhì)量濃度在0.10～6.05 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積成線性相關(guān)，線性方程為Y=76.757X+2.8889，r=0.9999；阿伐那非對映異構(gòu)體質(zhì)量濃度在0.10～6.03 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積成線性相關(guān)，線性方程為Y=77.23X+2.592，r=0.9999。線性方程截距均小于100%響應(yīng)值的20%，響應(yīng)因子RSD 值小于10%，表明線性關(guān)系良好，符合試驗要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗

按“2.1”項色譜條件，分別于0、1、2、4、8、12、24 h精密量取阿伐那非供試品溶液及阿伐那非對映異構(gòu)體對照品溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察供試品溶液及異構(gòu)體溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，阿伐那非供試品溶液室溫下放置24 h，主峰峰面積未見明顯減小，峰面積RSD值為0.32%，同時未檢出阿伐那非對映異構(gòu)體；阿伐那非對映異構(gòu)體溶液室溫放置24 h，主峰峰面積未見明顯減小，峰面積RSD值為0.42%，表明在該檢測色譜條件下，阿伐那非及其對映異構(gòu)體溶液室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗和精密度試驗

精密吸取阿伐那非對映異構(gòu)體對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，連續(xù)進樣6 針，測定峰面積平均值及計算RSD 值，結(jié)果顯示峰面積平均值為32.97，RSD 值為1.9%，表明方法重現(xiàn)性良好。

為了考察隨機變動的因素對精密度的影響，中間精密度試驗由甲、乙兩人分別獨立建立系統(tǒng)，使用同品牌不同的儀器，在不同的日期，按“2.1”項下色譜條件測定同一批阿伐那非對映異構(gòu)體對照品溶液濃度，結(jié)果測得峰面積RSD 值均低于1%，表明方法中間精密度較好。

2.9 回收率試驗

精密稱取阿伐那非對映異構(gòu)體對照品，依法配置成質(zhì)量濃度約為0.5 mg/mL 的標準母液，然后分別精密移取該標準母液0.32、0.40、0.48 mL 置100 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為回收率試驗80%（低）、100%（中）及120%（高）溶液。稱取阿伐那非對照品約10 mg，置25 mL 量瓶中，平行稱取9 份，分別用上述回收率低、中、高溶液溶解并稀釋至刻度，每個濃度平行配制3份，分別精密量取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，代入標準曲線方程按外標法計算回收率。結(jié)果見表2。可見，低、中、高質(zhì)量濃度的阿伐那非對映異構(gòu)體溶液的回收率在97.21%～100.41%范圍內(nèi)，RSD均小于1.0%，表明方法準確度較好，符合方法學(xué)考察要求。

表2 阿伐那非對映異構(gòu)體回收率試驗結(jié)果Table 2 Results of recovery test of avanafil isomer

2.10 自制樣品中對映異構(gòu)體的測定

取6 批樣品（20180804、20180806、20180808、20180810、20180813、20180815），按“2.2”項方法配制阿伐那非供試品溶液，精密量取20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由于阿伐那非異構(gòu)體的含量低于檢測限，6批樣品均未檢測出對映異構(gòu)體。

3 討論

3.1 最大吸收波長的選擇

阿伐那非和阿伐那非對映異構(gòu)體以正己烷-乙醇（體積比82∶18）為溶劑，在200～400 nm 波長范圍進行紫外掃描，結(jié)果顯示阿伐那非對映異構(gòu)體在233 nm 波長處有最大吸收，阿伐那非在236、266、310 nm 波長處有最大吸收。因此，確定233 nm 為檢測波長。

3.2 對映異構(gòu)體旋光性的測定

阿伐那非為S型異構(gòu)體，其對映異構(gòu)體為R 型。經(jīng)檢測阿伐那非的旋光度為-78～-84o，阿伐那非對映異構(gòu)體旋光度為78～84o。少量對映異構(gòu)體對旋光度的影響不顯著，對阿伐那非質(zhì)量控制時，在其旋光度檢測合格后再通過HPLC 法進行檢測，可以更加準確地控制阿伐那非對映異構(gòu)體的量。

對映體具有相同的物理性質(zhì)（如熔點、沸點、溶解度）、熱力學(xué)性質(zhì)（如自由能、焓、熵）和化學(xué)性質(zhì)等，但它們對偏振光的作用不同（比旋光度數(shù)值相同，方向相反）、對生物體的活性不同。雖然目前尚缺乏阿伐那非對映異構(gòu)體雜質(zhì)的毒性和活性試驗研究報道，很多雜質(zhì)分析試驗也并未將阿伐那非對映異構(gòu)體列為雜質(zhì)項進行分析，但是二者在活性、藥理學(xué)、藥動學(xué)和毒理學(xué)方面可能存在差異，臨床一般以單一對映體給藥，因此對阿伐那非對映異構(gòu)體雜質(zhì)進行質(zhì)量控制，可以提高藥品阿伐那非的質(zhì)量純度和療效。

本文采用手性柱HPLC法檢測阿伐那非對映異構(gòu)體，結(jié)果顯示該方法測定阿伐那非對映異構(gòu)體精密度、準確度高，在0.10～6.03 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，同時方法檢測限和定量限均能滿足測定要求，表明該方法是一種簡單、快速測定阿伐那非對映異構(gòu)體的分析方法，適應(yīng)于阿伐那非異構(gòu)體的檢測和限度控制。