馬騰飛

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

蒎烯（C10H16）是一種重要的天然單萜化合物，在自然界中主要以α-蒎烯和β-蒎烯的兩種異構體形式存在，其異構體如下：

蒎烯主要存在于自然界的松柏杉植物中，松柏杉植物的分泌物可用于提取松節(jié)油，松節(jié)油的主要成分—蒎烯含量高達90%。目前，工業(yè)上提取蒎烯的主要方法是從針葉植物中提取松節(jié)油，再從松節(jié)油中通過一些蒸餾、減壓精餾等方法提取蒎烯。雖然我國的松柏杉屬植物資源種類繁多且分布較廣，但是通過化工手段提取蒎烯成本昂貴、工藝復雜、浪費資源而且對環(huán)境有較大污染。隨著微生物工程和代謝工程的發(fā)展，通過生物合成手段生產蒎烯有望在將來成為替代化工合成的策略。蒎烯可由前體物質牻牛兒基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP）通過蒎烯合酶作用生成。在蒎烯化合物的合成過程中，由于合成蒎烯所需的萜類合酶（terpene synthases，TPS）催化合成的多樣性[1-2]，使得最終生成的萜類化合物種類豐富、結構繁多，具有不同的理化性質和生物活性，在能源、醫(yī)藥、軍事、食品、日化用品等多個領域擁有廣泛的應用和發(fā)展前景，所以通過微生物合成蒎烯具有重要意義。

1 蒎烯的用途

蒎烯由于獨特的空間結構及理化性質在能源、醫(yī)藥、化工、食品、和材料等領域發(fā)揮著巨大作用，具有重大的利用價值和發(fā)展空間。

1.1 能源方面

人類的一切經濟活動和生存都依賴于能源的供給，而開采其他資源和利用其他資源也都要依賴能源，能源需求問題影響著人類的生存和發(fā)展，能源的消耗量已成為衡量人民生活水平的標準，隨著人口的不斷增長和人類現(xiàn)有能源的日趨減少，尋求新型、高能和可持續(xù)生產的能源迫在眉睫。蒎烯由于其獨特的雙鍵和雙環(huán)結構可以在特定條件下通過環(huán)化加氫形成蒎烯二聚體。其二聚體具有與高能燃料JP-10相似的高體積能量[3-5]，被認為是噴氣式飛機及火箭燃料的替代品，因此具有極高的商業(yè)和軍事應用價值。

1.2 醫(yī)藥方面

近年來人們對蒎烯的關注增加，對α-蒎烯的藥理研究也不斷增多，并且越來越多的被應用到醫(yī)藥領域，如小兒感冒顆粒[6]、桉檸蒎腸溶軟膠囊[7]等。研究發(fā)現(xiàn)，蒎烯具有抗菌[8]、抗病毒[9]、抗腫瘤[10-11]、抗炎[12]、抗過敏及改善潰瘍等作用[13-14]。雖然蒎烯具有廣泛的藥理性質，但藥物活性較低，如何高效發(fā)揮蒎烯的藥物活性還需要對其進行深入研究和改造。

1.3 化工方面

蒎烯除了在能源和醫(yī)藥方面的作用外，還可以用于化工方面。由于松節(jié)油的主要成分蒎烯含量達90%左右，而我國又具有豐富的松柏杉資源，故可以利用松節(jié)油提煉蒎烯來進行一系列的化工合成生產產品。如以蒎烯為原料合成熱熔膠和橡膠等材料[15]；蒎烯與冰片烯作用合成的樟腦醌是一種具有光敏和生理活性的單萜類雙酮化合物，應用較廣，但是價格昂貴[16]。而且蒎烯還可以作為很多化工產品的原材料，因此蒎烯在化工方面發(fā)揮著巨大作用。

1.4 食品方面

蒎烯在食品添加劑方面也有著廣泛的用途，目前研究最多的是通過蒎烯來合成紫蘇糖甜味劑[17]。雖然人們已經早已掌握了蔗糖和葡萄糖的提取工藝，但是由于大量攝入蔗糖和葡萄糖容易導致肥胖和糖尿病，從健康方面來講紫蘇糖是一種優(yōu)質的高甜度、低熱量的甜味添加劑，并且紫蘇糖還可以作為糕點、飲料、醬油的防腐劑[18]。

1.5 材料方面

蒎烯在材料方面也有廣泛應用。蒎烯樹脂又稱聚萜烯樹脂，是以松節(jié)油為原料通過聚合得到的碳氫類樹脂[19]。20世紀初期和末期主要是通過石油為原料合成樹脂材料，但是由于化石能源的不可再生性以及人類對化石能源的需求量不斷增加，迫使人類尋找環(huán)保型、可再生物質來替代石油。蒎烯樹脂具有很好的工業(yè)加工性，并且原料永不枯竭，低毒環(huán)保，符合可持續(xù)發(fā)展的需求，因此以蒎烯作為原料合成樹脂已經逐漸成為一種趨勢[20]。

2 蒎烯的生物合成途徑

蒎烯屬于萜烯類化合物，萜烯類化合物目前已發(fā)現(xiàn)的種類超8 000種[21]，并且所有的萜烯類化合物都是通過相應萜類合酶通過催化對應的前體物質進行合成。蒎烯的合成通常包括三個步驟：第一步為五碳模板物質異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）的形成；第二步是以IPP和DMAPP作為前體物質合成GPP、法呢基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）、香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）等物質；第三步以GPP、FPP、GGPP為前體物質通過相應的酶催化合成對應的萜類物質。蒎烯是由其前體物質GPP通過蒎烯合酶（pinene synthase，PS）催化得到。蒎烯合成途徑主要分為甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和甲基赤蘚糖醇-4-磷酸酯（methylerythritol-4-phosphate，MEP）途徑。MVA途徑主要存在于真核生物，部分革蘭氏陰性菌和古細胞生物中，MVA途徑不僅是蒎烯合成的代謝途徑，而且在細胞代謝活動中起著關鍵作用，MVA途徑中關鍵酶的缺失會影響細胞的生長甚至導致細胞死亡[22]。MEP途徑主要存在于細菌，原生動物和藻類和高等植物中，是植物合成蒎烯化合物的關鍵途徑。目前主要是利用原核生物大腸桿菌（Escherichia coli）和真核生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為底盤生物通過一系列代謝改造進行蒎烯的生產。MEP途徑如下：

圖1 蒎烯合成甲基赤蘚糖醇-4-磷酸酯途徑Fig.1 Methylerythritol-4-phosphate pathway of pinene synthesis

2.1 大腸桿菌代謝工程合成蒎烯

大腸桿菌作為實驗室常用的模式菌株，具有以下優(yōu)點：（1）具有清晰的遺傳背景；（2）作為成熟的基因克隆表達菌株便于操作；（3）繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制。所以大腸桿菌可以作為微生物代謝產蒎烯的首選菌株。在大腸桿菌中蒎烯的代謝合成是通過MEP途徑進行，首先合成IPP和DMAPP前體，再通過各種萜烯合酶催化合成蒎烯（圖3）。在MEP合成蒎烯途徑中，葡萄糖通過糖酵解途徑轉化為甘油醛-3-磷酸（glyceraldehyde 3-phosphate，G-3-P）和丙酮酸，5-磷酸脫氧木酮糖合酶（deoxyoxylulose-5-phosphate synthase，DXS）將3-磷酸甘油醛和丙酮酸縮合為5-磷酸脫氧木酮糖（deoxyoxylulose-5-phosphate，DXP），并利用自身的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）在DXP還原異構酶（1-deoxy-D-xylulose5-phosphate reductoisomerase，DXR）作用下生成MEP。在MEP代謝通路中，MEP的生成被視為關鍵前體物質，所以DXP和DXS代謝反應被稱為關鍵限速反應。MEP在2-甲基赤蘚醇磷酸胞苷?；D移酶（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase，IspD）作用下生成4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇（4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol，CDP-ME），進而經過CDPME激酶（4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritolkinase，IspE）、2-C-甲基赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合成酶（2-c-methylerythritol 2,4-cyclic diphosphate synthase，IspF）、4-羥基-3-甲基-2-丁烯焦磷酸（4-hydroxy-3-methyl-2-butene pyrophos phoric acid，HMBPP）合成酶（4-hydroxy-3-methyl-2-butene pyrophosphate synthase，IspG）和HMBPP還原酶（4-hydroxy-3-methyl-2-butene pyrophosphate reductase，IspH）的催化作用生成合成蒎烯的前體物質牻牛兒基焦磷酸（GPP），GPP在PS的催化作用下生成蒎烯。

蒎烯合酶基因主要來源于松柏杉屬植物，YANG J M等[23]將來源于巨冷杉（Abiesgrandis）的蒎烯合酶基因導入大腸桿菌，并利用構建的外源MVA途徑進行蒎烯合成，搖瓶發(fā)酵最大產量達5.44 mg/L；SARRIA S等[24]將來源于火炬松（Pinus taeda）、歐洲云杉（Piceaabies）、巨冷杉（Abiesgrandis）的不同蒎烯合酶基因和牻牛兒基焦磷酸合酶基因進行兩兩組合共表達和融合表達，優(yōu)化培養(yǎng)條件后蒎烯產量達32 mg/L；TASHIRO M等[25]通過實驗室進化手段蒎烯合酶，并將其與GPP合酶基因以及MVA代謝途徑相關基因共同導入大腸桿菌中共表達，獲得蒎烯產量可達140 mg/L。

2.2 釀酒酵母代謝工程合成蒎烯

釀酒酵母與大腸桿菌相比具有更強大的蛋白表達和翻譯后修飾系統(tǒng)以及完整的內膜系統(tǒng)，所以更適合蛋白的表達[26]，是蒎烯合成的優(yōu)秀底盤生物。在釀酒酵母中蒎烯的合成主要是通過MVA途徑進行。首先釀酒酵母通過兩條代謝途徑產生乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）：（1）葡萄糖通過糖酵解途徑產生的丙酮酸進入線粒體，在丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）復合體作用下產生乙酰輔酶A[27]；（2）存在胞質中的丙酮酸在丙酮酸脫羧酶、乙醛脫氫酶和乙酰輔酶A合酶等一系列酶的催化作用下產生乙酰輔酶A[28-29]，乙酰輔酶A是釀酒酵母代謝網絡中最重要的代謝中間體，也是萜類物質生成的重要前提物質。乙酰輔酶A在硫解酶（thiolase，THL）和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A synthase，HMGS）的催化作用下生成HMG-CoA，HMG-CoA還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）是MVA途徑中的關鍵限速酶，且此步催化反應是一個不可逆的反應。MVA在MVA激酶（mevalonate kinase，MK）磷酸化作用下生成甲羥戊酸-5-磷酸（mevalonate 5-phosphate，MVA-5-P），進而在MVA-5-P-激酶（mevalonate 5-phosphate kinase，PMK）、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（diphosphate mevalonate decarboxylase，DPMD）等酶作用下生成IPP和DMAPP。與MEP途徑相同，利用牻牛兒基焦磷酸合酶（geranyl pyrophosphate synthase，GPPS）合酶和PS產生蒎烯。

以釀酒酵母作為底盤生物來生產蒎烯，目前報道的文章較少，陳天華等[30]通過在釀酒酵母中異源表達來源于火炬松（Pinus taedaL.）的蒎烯合酶基因，并通過對代謝途徑進行一系列的優(yōu)化使蒎烯產量從初始的0.329 mg/L提高到最終的11.7 mg/L，這也是目前報道的在釀酒酵母中的最高產量。本實驗室以自主產權的產甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）作為底盤生物，經過密碼子優(yōu)化將來源于火炬松（Pinus taeda）的蒎烯合酶基因整合到基因組中，通過搖瓶發(fā)酵其蒎烯產量達0.8 mg/L。對Candida glycerinogenes進行了蒎烯的耐受性實驗，該菌在1 g/L的酵母中仍然可以生長，所以可以通過對代謝途徑進行改造在Candida glycerinogenes進行蒎烯生產有巨大潛力。MVA途徑如下：

圖2 蒎烯合成甲羥戊酸途徑Fig.2 Synthesis pathway of mevalonate from pinene

3 提高蒎烯合成的策略

近年來隨著合成生物學和代謝工程的發(fā)展，利用微生物合成高附加值產物已經成為社會發(fā)展的趨勢。但是僅僅通過微生物自身的代謝途徑進行代謝產物合成還是存在很大的局限性，所以為了進一步提高代謝產物合成，一般有傳統(tǒng)方法、關鍵酶蛋白工程改造、高通量篩選高酶活蒎烯合酶（圖3）。

圖3 提高蒎烯合成的策略Fig.3 Strategies to enhance pinene synthesis

3.1 傳統(tǒng)方法

因為蒎烯的合成主要由MVA途徑和MEP途徑[31-33]，所以為了提高蒎烯的產量，通常最直接的辦法是通過強化代謝通路中關鍵限速酶的表達來提高代謝通路碳流。研究表明HMGR是關鍵限速酶[34]，過表達基因HMGR可以明顯提高胞內甲羥戊酸含量，增強MVA途徑的通量，除了HMGR是關鍵酶外，異戊烯基焦磷酸異構酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI1）催化IPP和DMAPP之間的異構化，也是實現(xiàn)GPP合成的重要步驟[35]，通常情況下IPP和DMAPP之間含量差異巨大，通過過表達IDI1可以改變胞內IPP和DMAPP的比例從而加速GPP合成。陳天華等[30]通過過表達截短的HMGR及IDI1等策略使蒎烯產量提高了34.5倍，所以強化代謝通路可以有效提高蒎烯產量。除了過表達關鍵限速酶外，通過引入外源基因，并進行正交實驗也是提高蒎烯產量的重要措施。

3.2 關鍵酶蛋白工程改造

MVA途徑或MEP途徑的關鍵酶的增強是提高蒎烯產量的傳統(tǒng)通用方法。雖然可以在一定程度上提高蒎烯產量，但是增加的大部分代謝碳流向了FPP和下游產物，只有很少部分GPP用于蒎烯的合成[36]。為了進一步提高蒎烯產量需要引入特異性GPP合成酶并通過蛋白質工程改造來提高酶的催化活性。由于有報道稱釀酒酵母中GPP和FPP的合成是由同一種酶-法呢基焦磷酸合成酶ERG20連續(xù)催化進行的，所以對ERG20進行蛋白質工程改造，有望成為提高GPP合成的主要策略[37-39]，IGNEA C等[40]通過蛋白質結構建模分析了ERG20主要是F96、A99、N127抑制FPP合酶活性，然后對其進行一系列突變，結果發(fā)現(xiàn)分別表達突變的ERG20（F96W）、ERG20（N127W）后，檜萜的產量分別提高了3.21和5.57倍。而F96W和N127W雙點突變使檜萜產量增加至10.32倍。陳天華等[30]通過在釀酒酵母中引入ERG20突變體ERG20ww（F96W/N127W），明顯提高了蒎烯產量，進一步證明了對關鍵酶進行改造對提高蒎烯產量的重要性。

3.3 高通量篩選高酶活蒎烯合酶

除了強化代謝通路及改造關鍵酶的方法，最重要的是提高蒎烯合酶的酶活，通常采用的方法是紫外誘變、常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變及易錯聚合酶鏈式反應等來獲得突變文庫，但是如何獲得高酶活的蒎烯合酶，是后期篩選存在的關鍵問題[41]。隨著高通量篩選技術的發(fā)展，可以為篩選高酶活蒎烯合酶提供思路。在所有的高通量篩選方法中，最受歡迎的是基于顏色或熒光的高通量篩選技術[42-43]?；陬伾驘晒獾募毎Y分是一種非常直觀的高通量篩選方法，一般用于生產來自有色產品（番茄紅素[44]、胡蘿卜素[45]、蝦青素[46]等）可以通過顏色深淺來檢查。隨著熒光激活細胞分選（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）的發(fā)展[47-48]，可以將具有熒光代謝物或可被熒光染色的物質的細胞調諧到特定波長的激發(fā)光，激活細胞內熒光信號，根據熒光對細胞進行分選單細胞水平的強度，大大提高了篩選效率[49]；TASHIRO M等[50]通過實驗室適應性進化，根據顏色差異成功篩選到了高酶活的突變蒎烯合酶，在搖瓶中蒎烯產量可以達到140 mg/L。

4 蒎烯毒性對蒎烯合成的影響

4.1 蒎烯毒性的脅迫機制

蒎烯作為一種單萜，對微生物細胞具有很強的毒副作用，因此常被用作抑制細胞生長的阻滯劑。它對微生物細胞的脅迫機制較為復雜細胞。目前的研究表明，單萜對細胞產生毒副作用，其調控機制可能有以下幾個方面：（a）破壞細胞膜導致菌體死亡，LIU J D等[51]用致死劑量的檸檬烯脅迫釀酒酵母細胞后發(fā)現(xiàn)細胞膜流動性降低、通透性增高且脂肪酸的比例增加，細胞膜功能受到了嚴重的損傷。（b）破壞細胞壁的完整性，抑制細菌的生長。BRENNAN T C R等[52]研究表明，檸檬烯刺激引起了細胞壁的結構損傷，與細胞壁完整性通路有關的基因（ROM1，RLM1，PIR3，CTT1，YGP1，MLP1，PST1和CWP1）出現(xiàn)不同程度的上調，且對細胞壁降解酶的敏感性增加了4倍，但目前對于單萜破壞細胞壁與細胞膜的具體機理研究仍然不清楚。（c）刺激細胞導致胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量積累，破壞包括細胞膜在內的多種細胞器膜的功能。BAKKALI F等[53]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母中不同的單萜處理可誘導不同類型ROS的積累；LIU J等[54]研究發(fā)現(xiàn)，隨著單萜處理濃度的增加，細胞內和細胞外ROS水平增加，細胞內MDA水平增加，萜處理后，胞內主要抗氧酶的編碼基因如GSH2、TRR1和GPX2在轉錄水平分別上調了12.8、6.0及32.2倍，表明釀酒酵母激活了其酶系抗氧化系統(tǒng)用以抵御ROS積累造成的氧脅迫。（d）影響胞內能量代謝，URIBE S等[55]研究發(fā)現(xiàn)，β-蒎烯可以抑制細胞呼吸，影響酵母細胞中H+和K+的轉運，并干擾線粒體膜的完整性和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的產生。

4.2 提高宿主蒎烯耐受性的策略

由以上單萜對細胞毒性的機制可以看出，當單萜濃度達到一定值時，可能會造成不可逆的細胞損傷，抑制細菌生長，甚至導致細菌死亡[56-58]。目前的研究主要通過兩種方法降低蒎烯對細胞的毒性作用：一是提高細胞對蒎烯的耐受性。BRENNAN T C R等[52]通過逐步提高檸檬烯的脅迫濃度對釀酒酵母進行適應性進化，經過200次傳代培養(yǎng)篩選獲得6株檸檬烯耐受性明顯提高的菌株，通過基因組全測序鑒定獲得了關鍵突變蛋白tTcb3p1-989，并發(fā)現(xiàn)過表達tTcb3p1-989能夠使進化前的菌株對檸檬烯的耐受性提高9倍。二是減少蒎烯與細胞的接觸，主要包括蒎烯的隔離和外排兩種方式。蒎烯主要是通過自由擴散或者相關的轉運蛋白通過主動運輸實現(xiàn)從胞內到胞外的外排。DUNLOP M J等[59]將細菌基因組中篩選的43個外排泵在大腸桿菌中進行異源表達，發(fā)現(xiàn)表達來源于大腸桿菌外排泵AcrAB和來源于泊庫島食烷菌（Alcanivorax borkumensis）的未鑒定的外排泵可以使大腸桿菌對檸檬烯的耐受性增加；WANG Y等[60]在釀酒酵母中異源表達了來自花香子囊的ABC轉運蛋白GcABC-G1，顯著提高了重組酵母菌株的存活率。

雖然一些研究在不同程度上提高了細胞對單萜的耐受性，但總的來說，單萜的毒性仍然是限制其高產的重要因素。但是，目前酵母對單萜的研究比較單一，僅限于檸檬烯，不夠全面，還沒有發(fā)現(xiàn)酵母對蒎烯的耐受性的研究。因此，分析蒎烯致毒性的主要機制并進一步提高酵母耐受性，可以為通過代謝工程和合成生物學技術構建高效的酵母單萜合成平臺奠定基礎。蒎烯脅迫機制如下：

圖4 蒎烯脅迫機制Fig.4 Mechanism of pinene stress

5 蒎烯生物合成的現(xiàn)狀及問題

利用代謝工程及合成生物學等方法在微生物中重構蒎烯合成途徑，通過優(yōu)化合成途徑使微生物成為高效合蒎烯化合物的細胞工廠，已有不少文獻報道[61-63]。然而單萜的微生物合成發(fā)展仍然相對滯后，其產量僅僅維持在毫克級別。目前蒎烯的合成主要是在大腸桿菌和釀酒酵母中通過MEP途徑和MVA途徑進行合成。但是無論是MEP途徑還是MVA途徑都存在GPP前體供給不足的問題，由于GPP是蒎烯合成的直接前體物質，所以GPP的供給量直接決定了蒎烯的產量。在釀酒酵母中缺乏GPP合成的特異性酶，GPP和FPP的合成由同一個酶ERG20連續(xù)催化[64]，且FPP的合成會消耗大量的前體GPP，這就造成了GPP不能在胞內大量積累，但是又不能阻斷FPP的生成，因為FPP的缺失對酵母是致死的[65-66]。所以通常的策略是對ERG20進行F96W和N127W位氨基酸進行突變ERG20WW以減弱向FPP合成的碳通量，而且不會影響GPP的合成。IGNEA C等[40]研究報道，在酵母底盤中表達ERG20ww時檜烯的產量較不引入該蛋白增加了10.5倍。除了增加前體物質GPP的含量，對關鍵限速酶基因進行突變或截短也是很重要的策略。在MVA途徑中，HMGR是關鍵限速酶，HMGR又分為HMG1與HMG2[67]，這兩種酶N末端均有將蛋白質靶向到內質網的結構，C末端具有催化活性結構。研究發(fā)現(xiàn)，通過對N端結構進行截短，使C端活性中心暴露在胞質可以增大HMGR的催化活性。KEASLING J D等[68]在釀酒酵母中過表達截短的tHMGR將紫穗槐二烯的產量提高了將約5倍。所以若要提高蒎烯的產量，需要解決的關鍵問題就是優(yōu)化其代謝途徑，解除限速酶對代謝通路的限制并提高關鍵前體物質的積累量。

6 總結和展望

本文主要綜述了蒎烯的微生物合成途徑以及利用大腸桿菌和釀酒酵母作為底盤生物生產蒎烯。通過對蒎烯合成途徑進行解析，旨在尋找和發(fā)現(xiàn)最優(yōu)的蒎烯合成通路。目前蒎烯的微生物合成幾乎陷入瓶頸階段，其關鍵問題在于蒎烯合成前體物質GPP的缺乏，以及代謝途徑中關鍵限速酶HMGR對通路碳流的限制作用。但是，這并不表明蒎烯微生物合成沒有前景，相反只要突破目前面對的瓶頸問題，通過微生物來產蒎烯將會有巨大發(fā)展前景。為了提高微生物的蒎烯合成能力，具體策略如下：1）蒎烯合成途徑中關鍵酶（ERG20、HMGR、IDI1）的篩選和改造；2）定向進化策略，對蒎烯合酶基因進行定向進化，提高催化活性；3）引入高效的異源代謝途徑來增加前體物質的積累量。4）弱化支路途徑和GPP下游途徑對碳流的消耗，保證GPP碳源的供應；5）提高底盤生物對蒎烯的耐受性。值得思考的是，除了對關鍵基因進行過表達、敲除以及突變，還需要注意代謝途徑中的非關鍵基因，因為關鍵基因的敲除和替換對菌體可能是致命的，所以需要考慮如何從全局角度設計更為合理的代謝工程方案。