童平 黃芙蓉 徐俊 伍紫琦 胡杏 凌鳴 王蝶 吳不非 楊獨嬌 張愛民

（1.湖南省人民醫(yī)院急危重癥代謝組學(xué)湖南省重點實驗室，湖南長沙 410000；2.湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院新生兒科，湖南長沙 410000）

新生兒敗血癥是指血液或者腦脊液等無菌標(biāo)本中能培養(yǎng)出致病菌（包括細(xì)菌和真菌）引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征［1］，全球5歲以下死亡兒童中約有40%發(fā)生在新生兒期，每年約290萬新生兒死亡［2］。新生兒敗血癥在中國的發(fā)病率為4.5‰～9.7‰［3］；在中國新生兒敗血癥的病死率為5%～10%［4］，全球新生兒敗血癥總體病死率為1‰～5‰［5］。已有研究表明，適當(dāng)?shù)目股刂委熋垦舆t1 h，病死率就會增加7%［6］。總的來說，新生兒敗血癥存在患病率高、病死率高的特點，同時新生兒作為特殊人群，其免疫、皮膚、黏膜屏障等發(fā)育不完善，一旦發(fā)生感染，易形成敗血癥，甚至快速發(fā)展為感染中毒性休克、多器官功能障礙等，糾其原因還是臨床醫(yī)生對新生兒敗血癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制不夠清楚，不能及時地遏制病情的加重和惡化。而在過去的幾十年里，已經(jīng)進(jìn)行了多項研究去探索其發(fā)病的代謝機(jī)制，在這一領(lǐng)域中，代謝組學(xué)技術(shù)似乎很有前景［7］，其分析速度快，且可同時檢測多種代謝產(chǎn)物的作用，已成為在臨床檢驗應(yīng)用中重要的新技術(shù)，使得其在新生兒敗血癥領(lǐng)域的研究不斷增多，但是就目前的文獻(xiàn)報道來看，暫未發(fā)現(xiàn)有關(guān)不同階段的新生兒敗血癥代謝通路方面的研究報道。因此，本研究主要采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometer，UHPLC/Q-TOF-MS）技術(shù)對不同時間的新生兒敗血癥患兒間的血清樣本進(jìn)行檢測，對比其血清代謝物之間的差異，以探索不同時間的新生兒敗血癥患兒間顯著性差異代謝物主要涉及的代謝通路，將有助于臨床醫(yī)生早期診斷新生兒敗血癥，同時了解該病在不同階段的代謝機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取2019年1月1日至2020年1月1日在湖南省人民醫(yī)院新生兒科住院的新生兒敗血癥患兒為敗血癥組，另選取同期門診體檢的健康新生兒為健康對照組。敗血癥組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會新生兒學(xué)組2019年確定的新生兒敗血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在其他重大非感染性疾病引起的全身應(yīng)激反應(yīng)；（2）存在先天性代謝異常疾??；（3）家屬拒絕參與本研究。本研究獲得了湖南省人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（兒科研倫審第521號）。

1.2 敗血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)

（1）臨床診斷為有臨床異常表現(xiàn)，如發(fā)熱、體溫不穩(wěn)定、反應(yīng)差、呼吸困難、腹脹、低血壓等，同時滿足下列條件中任何1項：①血液非特異性檢查≥2項陽性；②腦脊液檢查為化膿性腦膜炎改變；③血中檢出致病菌DNA。（2）確診診斷為有臨床表現(xiàn)，且血培養(yǎng)或腦脊液或其他無菌腔液培養(yǎng)陽性［1］。

1.3 血清UHPLC/Q-TOF-MS檢測

收集敗血癥組入院第1天、第4天、第7天及健康對照組的血清各0.5 mL，置于-80℃冰箱保存，采用移液器吸取上清液約100μL加入EP管中，加入10μL內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置），渦旋震蕩10 s；加入300μL的蛋白沉淀劑甲醇-乙腈（2∶1，v/v），渦旋震蕩1 min；冰水浴中超聲提取10 min；20℃下靜置30 min；離心15 min（13 000 r/min，4℃），取0.5 mL注射器取上清液經(jīng)過濾膜過濾后，留取約200μL至小樣瓶中。質(zhì)控樣本為所有樣本各取50μL，渦旋混勻制備而成。將各組樣本放置于UHPLC/Q-TOF-MS平臺進(jìn)行代謝產(chǎn)物分離檢測。檢測的色譜條件為：AcclainmTMRSLC120-C18色 譜 柱 （100 mm×2.1 mm），柱溫保持在40℃，進(jìn)樣量3μL；流動相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸/水（含2 mmoL/L甲酸銨），流動相B為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈/水。質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI+），采用正離子模式檢測，使用高純氮氣輔助噴霧電離與脫溶劑，干燥氣溫200℃流速為1.2 L/min，掃描范圍20～1 000 m/z。

1.4 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析

將檢測出的樣品質(zhì)譜圖，導(dǎo)入Metaboscape 3.0軟件進(jìn)行峰提取、除噪、標(biāo)準(zhǔn)化等數(shù)據(jù)預(yù)處理，數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后得到代謝物的質(zhì)荷比、保留時間、代謝物信息等數(shù)據(jù)。首先刪除離群值，并基于內(nèi)標(biāo)進(jìn)行歸一化處理；再將歸一化后三維數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P+14.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal-partial least square discriminant analysis，OPLS-DA）以建立模型，同時對該模型進(jìn)行響應(yīng)置換檢驗200次，評估模型有無過度擬合問題，結(jié)合變量投影重要性（variable importance projection，VIP）值初步篩選差異代謝物；通過OPLS-DA模型的VIP值（VIP＞1.8）和P＜0.05來篩選潛在的顯著性差異代謝物；最后采用MetaboAnalyst 4.0數(shù)據(jù)庫對顯著性差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)表示，兩組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般結(jié)果

研究期間我院共收治新生兒1 538例，其中診斷新生兒敗血癥32例，因家屬拒絕參與、放棄治療及患兒存在代謝異常等原因排除12例，最終敗血癥組納入20例，其中臨床診斷新生兒敗血癥13例，確診診斷新生兒敗血癥7例；健康對照組納入10例。兩組性別、胎齡、出生體重、就診日齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 敗血癥組與對照組患兒的一般資料比較

2.2 OPLS-DA結(jié)果

敗血癥組入院第1天與健康對照組之間、不同時間的敗血癥組之間的代謝物均存在顯著差異，代謝產(chǎn)物相距甚遠(yuǎn)（圖1）。同時對所構(gòu)建的OPLSDA模型經(jīng)過200次置換檢測，發(fā)現(xiàn)該模型不存在“過擬合”現(xiàn)象，該模型區(qū)分程度好，預(yù)測率高。

圖1 OPLS-DA得分圖

2.3 顯著性差異代謝物篩選

根據(jù)OPLS-DA模型的VIP值結(jié)合P值結(jié)果（VIP＞1.8且P＜0.05）初步篩選顯著性差異代謝物，再將篩選出的顯著性差異代謝物與人類代謝組數(shù)據(jù)庫和有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫資源中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，進(jìn)一步鑒定顯著性差異代謝物，篩選出的結(jié)果為：與健康對照組相比，敗血癥組入院第1天時有12種升高的血清差異代謝物，分別為苯丙氨酸、法尼基焦磷酸、6-磷酸葡萄糖、乳糖、4-羥基甲苯丁酰胺、伊洛前列素、順式8，11，14，17-二十碳四烯酸、皮質(zhì)酮、雌三醇3-硫酸鹽16-葡糖醛酸、苯乙酰胺、血氧烷B2、二氯二甲基二乙胺；與敗血癥組入院第1天時相比，入院第4天時有5種血清差異代謝物，升高的為丙酮酸，下降的分別為3-羥基-9-十六碳酰肉堿、血管緊張素Ⅲ、吡啶啉、三羥基椰子酸；與敗血癥組入院第4天時相比，入院第7天時有7種血清差異代謝物，升高的為18-羥基皮質(zhì)酮、硝基呋喃酮、吡啶啉、S-腺苷同型半胱氨酸、十四烷基硫酸鈉、二十烷醇，下降的為反式-2-十二碳酰肉堿；與敗血癥組入院第1天時相比，入院第7天時有14種血清差異代謝物，升高的為腦啡肽，下降的為花生四烯酸乙醇胺、血管緊張素Ⅲ、藥用酸3-O-b-D-葡糖醛酸、N，N-二甲基甲酰胺、?；敲撗跄懰?、尼氟酸、棕櫚酰葡糖醛酸、焦磷酸鹽、血清素、?；撬帷⒎词?3-羥基煙堿葡萄糖醛酸、尿素、D-葡萄糖醛酸。

2.4 代謝通路分析

最后利用MetaboAnalyst 4.0數(shù)據(jù)庫對敗血癥組入院第1天與健康對照組、不同時間的敗血癥組之間的顯著性差異代謝物進(jìn)行代謝通路的富集分析與拓?fù)浞治觯l(fā)現(xiàn)敗血癥組入院第1天與健康對照組相比、敗血癥組入院第4天與入院第1天相比、敗血癥組入院第7天與入院第4天相比、敗血癥組入院第7天與入院第1天相比顯著性差異代謝物主要涉及的代謝通路分別為萜類骨架的生物合成、丙酮酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、抗壞血酸代謝。見表2。

表2 各組顯著性差異代謝物的代謝通路富集及拓?fù)浞治霰?/p>

3 討論

新生兒因其免疫力低下，一旦受到外界感染，易快速形成敗血癥，往往病情進(jìn)展迅速，可造成嚴(yán)重的后遺癥甚至死亡。若能鑒定并監(jiān)測與新生兒敗血癥發(fā)生發(fā)展過程中的代謝產(chǎn)物及引起的代謝通路變化情況，將有助于臨床醫(yī)生了解該病不同階段動態(tài)變化的代謝機(jī)制，從而指導(dǎo)臨床治療，提高搶救成功率。近些年發(fā)展起來的新型代謝組學(xué)技術(shù)，其中UHPLC/Q-TOF-MS技術(shù)具有定量、定性、高度特異性及高靈敏度的特點，尤其適用于新生兒敗血癥血清代謝特點的研究。因此，本研究利用UHPLC/Q-TOF-MS技術(shù)平臺檢測不同時間的敗血癥患兒及健康新生兒的血清代謝物，發(fā)現(xiàn)其顯著性差異代謝物主要涉及的代謝通路分別為萜類骨架生物合成、丙酮酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、抗壞血酸代謝。

萜類物質(zhì)存在廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤、抗炎、抗動脈粥樣硬化和抗瘧疾活性［8-11］，其中著名的青蒿素及其半合成衍生物也已被證明可通過發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)［12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)生敗血癥時萜類骨架生物合成增加，考慮為機(jī)體在早期發(fā)生敗血癥時啟動的自我防御機(jī)制，此研究的發(fā)現(xiàn)也為臨床上開發(fā)新藥物治療新生兒敗血癥奠定了基礎(chǔ)。

丙酮酸具有清除活性氧的能力，而活性氧與休克或缺血/再灌注損傷引起的器官損傷發(fā)病機(jī)制有關(guān)［15］。治療性給予丙酮酸可以保護(hù)嚙齒類動物免受H2O2引起的腎損傷［16］。在機(jī)體發(fā)生膿毒癥抗氧化過程中，細(xì)胞會將丙酮酸釋放到血漿和血清中，以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激［17］。丙酮酸的簡單衍生物，丙酮酸乙酯可以改善器官功能，且具有高效的抗氧化和抗炎作用，丙酮酸乙酯可顯著提高生存率并減少腸道組織學(xué)改變，抑制血漿中IL-1、IL-6和干擾素-α的水平，并增加IL-10的水平，同時增強(qiáng)肝臟組織總體抗氧化能力［18］?？傊?，丙酮酸可清除活性氧，丙酮酸乙酯可改善系統(tǒng)性炎癥和多器官功能障礙，抑制多種早期炎癥細(xì)胞因子和晚期炎癥細(xì)胞因子［19］。本研究發(fā)現(xiàn)在新生兒敗血癥入院第4天與入院第1天相比，機(jī)體產(chǎn)生了更多的丙酮酸，以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，并且通過丙酮酸代謝通路為機(jī)體快速提供能量。

有研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥患者中血漿S-腺苷甲硫氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸水平升高［20］，嚴(yán)重膿毒癥患者的血清半胱氨酸水平顯著高于健康對照組［21］。敗血癥患者半胱氨酸水平與存活狀態(tài)有關(guān)［22］。在新生兒的一項研究中，發(fā)現(xiàn)窒息或敗血癥新生兒尿液中出現(xiàn)了大量游離半胱氨酸，經(jīng)過研究證明半胱氨酸水平與新生兒敗血癥性休克的嚴(yán)重程度相關(guān)［23］。在發(fā)生膿毒癥時，大鼠肝臟半胱氨酸增加約79%［24］，表明這是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制，使得機(jī)體能夠抵抗感染。對重癥監(jiān)護(hù)室中的64例嚴(yán)重膿毒癥或感染性休克患者的尿樣進(jìn)行核磁共振光譜技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良的患者乙醇、葡萄糖、馬尿酸水平較高，蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苯丙氨酸水平較低［25］。以上結(jié)果均表明與此研究中半胱氨酸-蛋氨酸代謝途徑產(chǎn)物在敗血癥恢復(fù)期顯著下降相符，證實了在疾病恢復(fù)期機(jī)體通過顯著減少半胱氨酸與蛋氨酸的代謝，來維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的機(jī)制。

有研究顯示，危重患者的抗壞血酸水平下降，動物和臨床試驗均證明補充抗壞血酸可改善重癥患者的病情［26-28］，其發(fā)揮的作用主要是通過減輕脂質(zhì)過氧化，降低血管通透性，改善血流動力學(xué)穩(wěn)定性，使得器官損傷和功能障礙減少。Marik等［29］發(fā)現(xiàn)補充抗壞血酸可以降低危重患者的病死率，一項薈萃分析也表明靜脈使用適量的抗壞血酸減少了血管加壓藥和機(jī)械通氣的持續(xù)時間，降低了總體病死率［30］。另有研究通過給予大劑量抗壞血酸進(jìn)行抗氧化劑治療，可減少燒傷后脂質(zhì)過氧化，降低血管通透性，減少燒傷和未燒傷組織的水腫，同時減少了復(fù)蘇液［31-33］的用量，與本研究中發(fā)現(xiàn)參與該代謝途徑的D-葡萄糖醛酸到了入院第7天相對入院第1天而言有下降，提示在新生兒敗血癥恢復(fù)期，機(jī)體消耗了大量的D-葡萄糖醛酸，參與了抗壞血酸代謝途徑，以此來改善病情。

總之，本研究首次利用UHPLC/Q-TOF-MS技術(shù)，對不同時間的新生兒敗血癥及健康新生兒的血清進(jìn)行檢測，該方法檢測的血清需求量少，并可一次性檢測多種代謝物，符合臨床的需求，而且同時此研究還采用了科學(xué)的統(tǒng)計方法，結(jié)果真實可靠，發(fā)現(xiàn)了不同時間的新生兒敗血癥顯著性差異代謝物主要涉及萜類骨架生物合成、丙酮酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、抗壞血酸代謝途徑。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。