饒 瀅,李和陽,林榮金,張麗娜,莊國順

（1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,福建 漳州 363000；2.自然資源部第三海洋研究所,福建 廈門 361005；3.復(fù)旦大學(xué)大氣化學(xué)研究中心,復(fù)旦大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系,上海 200433）

生物氣溶膠(bioaerosol)是大氣氣溶膠的重要組成成分之一.生物氣溶膠中含微生物的部分稱為微生物氣溶膠(microbial aerosol)，微生物氣溶膠與全球氣候變化、大氣污染和人體健康等關(guān)系密切[1-2].土壤、植物、水體是大氣中微生物氣溶膠的重要來源[3]，人類生產(chǎn)活動如污水處理、農(nóng)業(yè)活動中的發(fā)酵過程等與大氣微生物氣溶膠密切相關(guān)[4-5].漳州是中國東南沿海重要的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)基地，以生豬、家禽、肉牛、肉羊養(yǎng)殖為重點的畜牧業(yè)是漳州市九大主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一.九龍江是福建省第二大河流，全長1 923 km，流域面積14 741 km2，其中漳州境內(nèi)流域面積7 586 km2.由于城區(qū)發(fā)展早期階段缺乏科學(xué)規(guī)劃，九龍江流域內(nèi)住宅與農(nóng)田、禽畜養(yǎng)殖混雜分布.隨著漳州地區(qū)經(jīng)濟高速發(fā)展以及居民生活水平提高，生產(chǎn)和生活廢棄物排放的急劇增加，尤其是漳州市“十三五”規(guī)劃實施前幾年，九龍江流域環(huán)境問題凸顯.有資料表明在此階段九龍江全流域每年接納的城鎮(zhèn)污水和工農(nóng)業(yè)廢水達2 億t 以上，主要為畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染、工業(yè)污染物排放、生活污水及垃圾污染、農(nóng)藥和化肥污染等[6-8]，九龍江流域污染對水體微生物影響顯著[9]，但有關(guān)該階段九龍江流域周邊農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動污染對大氣微生物氣溶膠影響的研究鮮見報道.

本研究運用16 S rRNA基因高通量測序技術(shù)，對漳州市微生物氣溶膠中細菌群落及其來源進行研究，探討漳州市大力推進綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展前九龍江流域周邊農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動污染對漳州區(qū)域大氣氣溶膠的影響及對人體健康的可能危害，為漳州市深入推進“生態(tài)+”高效外向型農(nóng)業(yè)發(fā)展前后城市大氣環(huán)境質(zhì)量及公共衛(wèi)生安全評估提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣點設(shè)于距九龍江岸約300 m離地面約25 m處閩南師范大學(xué)綜合樓屋頂監(jiān)測點(24°51'N、117°66'E)（圖1）.采樣時間為2015年11月25—28日，共采集大氣微生物氣溶膠樣品6 個(以下簡稱樣品)，各樣品采樣信息見表1.采用Dycor公司的XMX-CV 大流量采樣器，流量為530 L/min，采樣時長為720 min，采樣膜為0.8 μm 的混合纖維濾膜.為防止受污染，樣品采集前將實驗用具、濾膜盒及采樣器滅菌處理，將放有無菌濾膜的濾膜盒放入采樣器.采集完成后,戴無菌手套取出濾膜盒并密封儲存于4 ℃冰箱供檢測.

圖1 漳州市采樣站位示意圖Fig.1 The location of the sampling site in Zhangzhou City

表1 漳州市大氣微生物氣溶膠樣品采樣信息表Tab.1 Sampling information of microbial aerosol in Zhangzhou City

1.2 樣品處理

1.2.1 細菌基因組DNA提取與檢測

將剪碎的濾膜放入Lysing Matrix E 管中，采用FastDNA? Spin Kit for Soil 試劑盒(MP Biomedical，USA)提取氣溶膠樣本的細菌基因組DNA.對提取好的DNA 溶液利用細菌16 S rRNA 引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3′)進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠下進行電泳檢測，將符合高通量檢測要求(DNA 濃度＞10 ng/μL)的6 個樣品DNA溶液用冰盒低溫保藏，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司做高通量測序分析.

1.2.2 高通量測序

質(zhì)量合格的環(huán)境基因組DNA 溶液，按以下步驟完成高通量測序：1)設(shè)計并合成barcode的特異引物，并用該引物進行PCR 擴增、PCR 產(chǎn)物回收；2)PCR 產(chǎn)物經(jīng)檢測定量，按測序量要求進行均一化混合；3)構(gòu)建文庫；4)上機測序.

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果及分析

對6個樣品進行16 S rRNA基因的可變區(qū)片段V3-V4區(qū)(338F-806R)Illumina MiSeq測序，對樣品進行PE(雙端合并)300×2平臺測序，通過數(shù)據(jù)優(yōu)化，得到序列條帶數(shù)為151 449，堿基對數(shù)約65 734 056，平均讀長434.09 bp，約99.95%序列長度位于421～460 bp之間.

結(jié)果顯示，當(dāng)隨機抽取的測序條數(shù)接近5 000時，各樣品曲線均趨向平坦，Shannon指數(shù)不會再隨著測序量的增加而升高(圖2)，表明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣品絕大多數(shù)的物種信息.

圖2 樣品物種組成Shannon-Wiener 曲線Fig.2 Shannon-Wiener curves of the component species in 6 samples

2.2 細菌群落結(jié)構(gòu)組成及分析

門水平上，對樣品中在97%的相似度下非重復(fù)序列的操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)進行聚類(圖3).6 個樣品細菌群落優(yōu)勢門水平上相似性較高，均為厚壁菌門、放線菌門和變形桿菌門，其相對豐度比之和達到81%～87%.將6個樣品細菌群落數(shù)據(jù)合并計算，優(yōu)勢門相對豐度比為厚壁菌門(Firmicutes)(34.82%)、放線菌門(Actinobacteria)(23.87%)、變形桿菌門(Proteobacteria)(20.92%)和藍細菌門(Cyanobacteria)(9.55%)，其他為梭桿菌門(Fusobacteria)、綠屈撓菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobac‐teria)、浮霉?fàn)罹T(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、Gemmatimonadetes、Saccharibacteria、Armatimonadetes、螺旋體門(Spirochaetes)、SHA-109、疣微菌門(Ver‐rucomicrobia)、Bacteria_unclassified、鐵還原桿菌門(Deferribacteres)、Tenericutes、Parcubacteria、硝化螺菌門(Nitrospira)和衣原體門(Chlamydiae)等共22類群.

圖3 門水平細菌類群分布柱狀圖Fig.3 Composition of bacterial community structure in 6 samples at the phylum level

屬水平上，對樣品中在超過0.01%的相似度下非重復(fù)序列的OTU 進行聚類，將6 個樣品細菌數(shù)據(jù)合并計算，共計726 個菌屬，Heatmap 圖顯示(圖4)，優(yōu)勢屬為梭菌屬（Clostridium）(8.49%)、藍藻未分類菌屬（Cyanobacteria）(4.43%)、乳桿菌屬（Lactobacillus）(4.28%)、Terrisporobacter(3.53%)和 異常球菌屬（Deinococcus）(3.30%).

圖4 6個樣品屬水平細菌群落Heatmap圖Fig.4 Heatmap of bacterial community structure in 6 samples at the genus level

以上結(jié)果表明，門水平上漳州大氣微生物氣溶膠細菌類群以厚壁菌門、放線菌門和變形桿菌門為主要優(yōu)勢類群，與國內(nèi)外研究結(jié)果相似[10].Lee等[11]在東亞地區(qū)三個城市(北京、首爾和長崎)進行大氣微生物氣溶膠的研究中也得出相同的結(jié)論.比較上述研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)盡管研究地點不同且地域跨度大，大氣氣溶膠細菌在優(yōu)勢門類群組成上基本類同.放線菌門屬革蘭氏陽性菌，普遍分布于土壤中，土壤釋放到空氣中的細菌是氣溶膠細菌群落的一個重要來源[12].變形桿菌門屬革蘭氏陰性菌，分布廣泛，對低溫、輻射等具有很強的抵抗力[13].厚壁菌門是一大類細菌，多數(shù)為革蘭氏陽性，很多厚壁菌可以產(chǎn)生芽孢利于抵抗脫水和極端環(huán)境，是廣泛適應(yīng)于不良環(huán)境的一類細菌.這三個門類細菌在土壤、水體等環(huán)境中廣泛存在及其對環(huán)境具有較高的耐受性的特點可能是其成為大氣細菌優(yōu)勢門類的主要原因.

屬水平上，漳州大氣細菌類群包括726 個屬，優(yōu)勢屬包括梭菌屬(8.49%)、藍藻未分類菌屬(4.43%)和乳桿菌屬(4.28%)等，本研究與部分學(xué)者的研究有較大差別.Bertolini 等[14]在米蘭的研究發(fā)現(xiàn)大氣細菌優(yōu)勢屬為里氏桿菌屬、叢毛單胞菌屬、假諾卡氏菌屬、芽孢桿菌屬和小月菌屬.Li 等[15]發(fā)現(xiàn)廈門大氣中細菌群落優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬、不動桿菌屬和短桿菌屬.上述不同結(jié)果表明，不同區(qū)域存在不同的細菌群落結(jié)構(gòu)特征,可能與大氣細菌群落受到區(qū)域性環(huán)境因素影響較大有關(guān).

3 討論

3.1 優(yōu)勢菌屬的可能來源及成因分析

漳州地區(qū)大氣微生物氣溶膠中細菌相對豐度最高(前3 位)的優(yōu)勢菌屬依次為梭菌屬、藍藻未分類菌屬和乳桿菌屬.梭菌屬為厚壁菌門的芽孢桿菌科，通常為革蘭氏染色陽性菌，能形成芽孢抵抗極端環(huán)境.已往多數(shù)研究顯示大氣中梭菌屬細菌稀少[16]，而本研究中漳州區(qū)域大氣中梭菌屬細菌相對豐度高達8.49%.梭菌屬細菌為專性厭氧菌，在富氧的大氣環(huán)境中難于長時間存在，漳州市盆地地貌的阻隔特點使外來氣流較難輸入，因此漳州區(qū)域內(nèi)應(yīng)該存在能產(chǎn)生大量梭菌屬細菌并能不間斷將其輸送到大氣環(huán)境的本地源.梭菌屬細菌主要存在土壤、人體和動物腸道[17]，隨糞便排出體外后可以芽胞狀態(tài)分布于水體和土壤等環(huán)境中.漳州市是福建省畜牧業(yè)的重點地區(qū)，2015年末全市豬出欄量194萬頭、奶牛存欄5 412頭、肉牛出欄量4.4萬頭、蛋雞存欄量200.8萬羽、肉雞出欄量157.8萬羽.但截至2015年漳州市生豬規(guī)模化養(yǎng)殖低于65%，散養(yǎng)戶飼養(yǎng)觀念相對落后，糞便利用率低，污廢排放量大，而同期許多規(guī)?；B(yǎng)殖場也尚未能建設(shè)與其規(guī)模相匹配的畜禽糞便處理設(shè)施.因此未達污染防治標(biāo)準(zhǔn)的畜禽養(yǎng)殖場產(chǎn)生的大量污水和糞便排放，對周邊環(huán)境造成較大影響.梭菌屬細菌在動物糞便中普遍存在[18]，糞便中細菌霧化排放進入大氣環(huán)境是養(yǎng)殖場附近大氣梭菌屬細菌的主要來源[19].此外，農(nóng)家肥堆肥可能是漳州地區(qū)大氣中梭菌屬細菌成為優(yōu)勢類群的另一主因，漳州市大部分牛、羊養(yǎng)殖場產(chǎn)生的糞便由養(yǎng)殖戶自行收集曬干后，外賣做為蘑菇土或發(fā)酵制有機肥，有研究發(fā)現(xiàn)堆肥過程中梭菌屬和芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，梭菌屬細菌最高比例可達53%[20].

九龍江流域梭菌屬細菌污染對大氣中梭菌屬的貢獻也不容忽視.有研究認(rèn)為水體中梭菌屬細菌增加與沿岸的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動如農(nóng)業(yè)面源污染、畜禽養(yǎng)殖污染和生活污水排放影響有關(guān)[14-15,21].侯麗媛等[9]對九龍江流域潛在病原菌分析中發(fā)現(xiàn)梭菌屬細菌在所有樣品中都有檢出，且相對豐度最高，占病原菌屬序列總量的54.5%.

3.2 潛在病原菌分析及健康影響

參照國家衛(wèi)生健康主管部門于2006年頒發(fā)的《人間傳染的病原微生物名錄》和Taylor 等[22]總結(jié)的病原菌數(shù)據(jù)庫，比較本研究樣品的測序結(jié)果，在漳州樣品中檢出41個潛在病原菌屬(表2).其中致病力較強的梭菌屬和鏈球菌屬在所有樣品中都有檢出，同時也是相對豐度最高的兩個菌屬，分別占檢出病原菌屬序列總量的27.6%和10.4%.梭菌屬中多數(shù)是可產(chǎn)生外毒素的致病菌，如破傷風(fēng)梭菌(C.tetani)等.破傷風(fēng)梭菌經(jīng)皮膚或黏膜傷口感染后在體內(nèi)繁殖并產(chǎn)生毒素引起肌肉痙攣，感染后人體死亡率高.鏈球菌是化膿性球菌中一類常見的細菌，可引起各種化膿性炎癥以及變態(tài)反應(yīng)性疾病.

表2 微生物氣溶膠病原菌分析Tab.2 Analysis of pathogenic bacterial in 6 samples

漳州樣品中軍團菌屬、立克次氏體屬、鄰單胞菌屬、弧菌屬、不粘柄菌屬僅在單個樣本中檢出，相對豐度較低(＜0.01%).這些菌屬相對數(shù)量雖然較少，卻是多數(shù)醫(yī)院院內(nèi)感染的主要病原菌.樣品中有些菌屬可見于豬養(yǎng)殖場空氣微生物氣溶膠中檢出的優(yōu)勢異養(yǎng)細菌[23-24]，其來源可能與本地生豬養(yǎng)殖污水污物有關(guān).這些菌屬主要有：芽孢桿菌屬(1.51%)、鏈球菌屬(3.21%)、棒桿菌屬(3.08%)、假單孢菌屬(0.58%)、葡萄球菌屬(1.12%)、不動桿菌屬(0.43%)、短桿菌屬(0.74%)和黃桿菌屬(0.11%).這些菌屬在一定條件下對人體健康均可能造成威脅.對豬舍周邊居民健康狀況的研究結(jié)果表明，居民常有結(jié)膜感染、上呼吸道感染和消化道感染癥狀[24]，從畜禽糞便中逸散的抗生素耐藥菌也可能對周邊環(huán)境人群健康造成不同程度的危害[25].此外，需要注意的是，本研究樣品中約有1.11%的序列尚不能確定，其中可能包含對人和動植物有致病性的潛在病原菌.有關(guān)微生物氣溶膠潛在病原菌的傳播和影響機制還需進一步研究.

4 結(jié)論

1)本研究采用16 S rRNA 基因高通量測序，分析漳州市區(qū)大氣氣溶膠中細菌群落結(jié)構(gòu)組成，共有22個門、726個屬，優(yōu)勢門為厚壁菌門(34.82%)、放線菌門(23.87%)和變形桿菌門(20.92%)，優(yōu)勢屬為梭菌屬(8.49%)、藍藻未分類菌屬(4.43%)和乳桿菌屬(4.28%).

2)研究結(jié)果表明梭菌屬(8.49%)是漳州地區(qū)大氣細菌群落最優(yōu)勢屬，具有較為明顯的區(qū)域性特征.漳州作為東南沿海重要農(nóng)業(yè)區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活躍是本地區(qū)梭菌屬細菌相對豐度高的原因.

3)本次氣溶膠樣品共檢出41個潛在病原菌屬，所有樣品中均檢出豐度較高的梭菌屬、異常球菌屬和鏈球菌屬，這些細菌氣溶膠對本地區(qū)人群健康具有潛在威脅.

本研究樣品采集時間段（2015年11月）處于漳州市推動畜禽養(yǎng)殖污染防治工作落實總量減排要求、實行《漳州市“十三五”畜禽養(yǎng)殖污染防治規(guī)劃》（以下簡稱《規(guī)劃》）節(jié)點前.《規(guī)劃》實施期間，漳州市在養(yǎng)殖總量控制、養(yǎng)殖場標(biāo)準(zhǔn)化改造等工作上多舉措并舉推進，截至2017年漳州市禽畜糞污資源化利用率達95%，在深化畜禽養(yǎng)殖污染防治方面效果顯著.本研究資料也為后續(xù)漳州畜禽養(yǎng)殖污染防治效果中有關(guān)大氣細菌氣溶膠方面的研究提供對照.